專利名稱：高靈敏度的免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR-FIA)方法，特別是涉及利用熒光銪絡(luò)合物高靈敏度檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
正常人血漿等體液中存在的游離細(xì)胞因子或趨化因子的濃度接近或低于常規(guī)ELISA測(cè)定的檢測(cè)界限。例如，據(jù)報(bào)道通過應(yīng)用檢測(cè)界限為6皮摩爾(pM)的傳統(tǒng)ELISA測(cè)定，從正常人血漿中檢測(cè)不到IL-8(Leonard等(文獻(xiàn)1))。為了正確測(cè)定體液樣品中趨化因子的濃度，增大測(cè)定靈敏度以及減低來源于體液樣品的非特異性背景就成為主要課題。
近年來，開發(fā)了利用銪絡(luò)合物的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)方法，并正用于臨床上(Kropf等(文獻(xiàn)2))。游離的、形成了絡(luò)合物的銪離子(Eu3+)的放射波長(zhǎng)為615nm，不會(huì)受到激發(fā)波長(zhǎng)(340nm)或某種蛋白質(zhì)造成的短壽命背景熒光(350nm～600nm)的影響，所以很合適?；谠撛淼?種分析方法是商業(yè)化的DELFIA(解離-增強(qiáng)型鑭系熒光免疫檢測(cè)；Pharmacia)，例如可用于TNFα和IL-6的測(cè)定。但是，應(yīng)用DELFIA時(shí)不能成功地正確測(cè)定這些細(xì)胞因子在血漿中的濃度(Ogata等(文獻(xiàn)3))。
最近，松本等研究小組開發(fā)了4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-鄰-三苯基(BHHCT)-Eu3+絡(luò)合物作為標(biāo)記化合物。該絡(luò)合物可與蛋白質(zhì)直接結(jié)合，通過時(shí)間分辨型熒光測(cè)定可以進(jìn)行高靈敏度分析(Yuan等(′97)(文獻(xiàn)4)和Yuan等(′98)(文獻(xiàn)5))。BHHCT具有β-二酮結(jié)構(gòu)，與Eu3+結(jié)合的穩(wěn)定系數(shù)高達(dá)1010M-1。所生成的Eu3+絡(luò)合物的壽命超過400微秒(μs)，吸收和發(fā)射波長(zhǎng)的最大值為330nm和615nm，顯示了極良好的性質(zhì)。說明該絡(luò)合物可用于檢測(cè)人血漿中腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(Yuan等(′98)(文獻(xiàn)5))和免疫球蛋白E(IgE)(Yuan等(′97)(文獻(xiàn)4))的檢測(cè)。但是，還不知道應(yīng)用上述Eu3+絡(luò)合物檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的例子。
基質(zhì)細(xì)胞來源的因子-1(SDF-1)是屬于趨化因子家族的細(xì)胞因子，它是1993年從骨髓基質(zhì)細(xì)胞系初次克隆出來(Tashiro等(文獻(xiàn)6))。SDF-1是CXCR4受體的主要配體(Bleul等(文獻(xiàn)7)和Oberlin等(文獻(xiàn)8))。已知該受體作為I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)亞群的CD4共受體(coreceptor)起作用。最近的研究表明，SDF-1基團(tuán)的多態(tài)性與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)進(jìn)展的延遲相關(guān)。(例如，Winkler等(文獻(xiàn)9)和Martin等(文獻(xiàn)10))。但是，其作用機(jī)制有多種闡釋，尚未確立。
還有文獻(xiàn)指出SDF-1在造血、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎形成中起著重要作用(例如，Zou等(文獻(xiàn)11)和Tachibana等(文獻(xiàn)12))。另一方面，現(xiàn)狀是SDF-1在成人組織中的生物學(xué)功能還有許多尚未闡明。
如上所述，開發(fā)一種正確定量、監(jiān)測(cè)體液樣品中SDF-1的技術(shù)，將對(duì)加深理解SDF-1起到極為重要的作用。不言而喻，對(duì)其它趨化因子和細(xì)胞因子也一樣，體液樣品的正確測(cè)定方法將會(huì)為學(xué)術(shù)和臨床作出貢獻(xiàn)。基于這樣的觀點(diǎn)，期望有以更高靈敏度檢測(cè)細(xì)胞因子的測(cè)定方法。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的是解決上述課題，并提供高靈敏度且能簡(jiǎn)便檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的方法。
根據(jù)本發(fā)明，它提供用于檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR-FIA)方法，該方法包括在固相上形成依次結(jié)合了(a)具有固相結(jié)合部分和能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域的第一抗體，(b)該細(xì)胞因子，(c)具有能與該細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和生物素結(jié)合部分的第二抗體，(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物，(e)鑭系金屬離子的復(fù)合物的步驟；以及測(cè)定與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的熒光的步驟；這里，該熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n-1-X (I)(式中，R為能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數(shù)，X為氟原子或通式(II)表示的基團(tuán))-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R- (II)
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述鑭系金屬離子為銪。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(III)表示。
-R-Ar-(C(C＝O)-CH2-C-(＝O)-CnF2n+1)2(III)(式中，R、Ar及n與上面相同)本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述熒光結(jié)構(gòu)部分為4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-鄰-三苯基。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述結(jié)合物中，相對(duì)于每1分子鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，存在10～60單位上述熒光結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述測(cè)定熒光的步驟在不解離在固相上形成的復(fù)合物的情況下進(jìn)行。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，上述測(cè)定熒光的步驟是在解離在固相上形成的復(fù)合物后進(jìn)行。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述細(xì)胞因子為趨化因子家族的細(xì)胞因子。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述細(xì)胞因子可以是CXC趨化因子。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述細(xì)胞因子為基質(zhì)細(xì)胞來源的因子-1(SDF-1)。
或者，本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述細(xì)胞因子可以作為血循環(huán)中的可溶性因子存在，并且是微量即具有生物活性的細(xì)胞因子。
或者，本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述細(xì)胞因子可以是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-單集落刺激因子(GM-CSF)或白細(xì)胞介素2(IL-2)。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述體液樣品為血漿或全血。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，還包括在上述形成復(fù)合物的步驟之前，用樣品稀釋緩沖液稀釋上述體液樣品的步驟；該樣品稀釋緩沖液是pH7.3～8.3的0.01～0.1M Tris-HCl，并含有0.1～0.3％牛血清白蛋白，0.05～0.2％疊氮鈉，以及0.5～1.5％的氯化鈉。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，還包括在上述形成復(fù)合物的步驟之前，在上述細(xì)胞因子的非變性溫度條件下，對(duì)上述體液樣品進(jìn)行加熱處理的步驟。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，還包括在測(cè)定熒光的步驟之前，用洗滌緩沖液洗滌在上述固相上形成的復(fù)合物的步驟；該復(fù)合物洗滌緩沖液是pH8.5～9.5的0.01～0.1M Tris-HCl，并含有0.01～0.1％的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，上述固相是有50～200ng/cm2IgG吸附能力的微量滴度板。
另外，根據(jù)本發(fā)明，還提供用于檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR-FIA)方法的試劑盒，該試劑盒包括具有固相結(jié)合部分和能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域的第一抗體，具有能與該細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和生物素結(jié)合部分的第二抗體，具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物，以及鑭系金屬離子；這里，該熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X(I)(式中，R為能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數(shù)，X為氟原子或通式(II)表示的基團(tuán))-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R- (II)附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1a是表示SDF-1校正曲線的圖。應(yīng)用實(shí)施例2所述的TR-FIA法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)SDF-1。數(shù)據(jù)是3次測(cè)定的平均值。
圖1b是與圖1a相同的校正曲線，是特別在低濃度范圍內(nèi)測(cè)定的。圖中的直線，Y＝1.3X+1.2(×10000a.u.)，r＝0.995。數(shù)據(jù)是3次測(cè)定的平均值。
圖1c是為了監(jiān)測(cè)SDF-1的生物學(xué)活性，按照實(shí)施例3所述的方案測(cè)定EL-4細(xì)胞表面的CXCR4表達(dá)的結(jié)果圖。通過與沒有人SDF-1β時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)的對(duì)照相比較，計(jì)算出平均熒光強(qiáng)度(MFI)的減少％。數(shù)據(jù)是1輪實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次后選擇的中間值。
圖1d表示為了評(píng)價(jià)TR-FIA對(duì)SDF-1的特異性，測(cè)定各種趨化因子的結(jié)果圖。數(shù)據(jù)是測(cè)定3次的平均值。
圖2是針對(duì)SDF-1的，TR-FIA與DELFIA進(jìn)行比較的圖。圖2的左側(cè)是以人SDF-1β為標(biāo)準(zhǔn)溶液，用與實(shí)施例2中使用的相同組合的捕捉抗體和檢測(cè)抗體，用DELFIA和TR-FIA體系進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖2的右側(cè)表示用兩種體系檢測(cè)血漿樣品中內(nèi)源性SDF-1濃度的結(jié)果。圖2右側(cè)所示的樣品中未添加標(biāo)準(zhǔn)SDF-1。圖2右側(cè)的數(shù)據(jù)和表1的數(shù)據(jù)是對(duì)不同樣品進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。數(shù)據(jù)是3次測(cè)定的平均值。
圖3a是表示抗凝劑和蛋白酶抑制劑對(duì)用TR-FIA測(cè)定SDF-1的影響。用EDTA(1mg/ml)，肝素(30IU/ml)，檸檬酸鹽(0.38％檸檬酸鈉)及具有抑肽酶(1μg/ml)的EDTA(1mg/ml)中的任一種處理血漿樣品。黑柱和斜線柱是對(duì)兩個(gè)不同樣品進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。數(shù)據(jù)是3次測(cè)定的平均值。
圖3b表示血漿樣品的預(yù)加熱對(duì)用TR-FIA測(cè)定SDF-1的影響。測(cè)定前55℃預(yù)先溫育血漿樣品30分鐘，或不加熱直接進(jìn)行測(cè)定。24份體液樣品來自健康的日本志愿者。數(shù)據(jù)是2次測(cè)定的平均值。
圖3c表示血漿樣品的稀釋對(duì)用TR-FIA測(cè)定SDF-1的影響。用緩沖液4稀釋各樣品。5份體液樣品來自健康的日本志愿者。數(shù)據(jù)是3次測(cè)的平均值。
圖4a表示作為SDF-1的對(duì)照的，用ELISA定量IL-8時(shí)血細(xì)胞的影響。將IL-8添加到血漿樣品后，混合細(xì)胞沉積物或血漿。37℃溫育15分鐘后，對(duì)血漿中的可溶性IL-8進(jìn)行定量。白方塊是未與細(xì)胞沉積物或血漿混合的標(biāo)準(zhǔn)樣品，黑圓圖表示與血漿混合的樣品，白圓圈表示與細(xì)胞沉積物混合的樣品。數(shù)據(jù)是4次測(cè)定的平均值。
圖4b是作為SDF-1的對(duì)照的，用ELISA對(duì)MCP-1進(jìn)行定量時(shí)血細(xì)胞的影響。向血漿樣品中添加MCP-1后，與細(xì)胞沉積物或血漿混合。37℃溫育15分鐘后對(duì)血漿中的可溶性MCP-1進(jìn)行定量。符號(hào)與圖4a相同。數(shù)據(jù)是測(cè)定4個(gè)復(fù)本的均值。
圖4c表示在SDF-1的TR-FIA定量中血細(xì)胞的影響。向血漿樣品中添加SDF-1后，與細(xì)胞沉積物或血漿混合。37℃溫育15分鐘后，對(duì)血漿中的可溶性SDF-1進(jìn)行定量。符號(hào)與圖4a相同。數(shù)據(jù)是測(cè)定4個(gè)復(fù)本的均值。
圖5表示36個(gè)健康日本志愿者的人血漿中SDF-1的水平。測(cè)定前，于55℃對(duì)所有的血漿樣品進(jìn)行30分鐘熱處理。數(shù)據(jù)是2輪不同測(cè)定的各3次測(cè)定的平均值。
圖6表示人血漿樣品中Protein G-Sepharose引起的IgG耗竭的影響。將從7個(gè)健康日本志愿者獲取的血漿樣品與Protein G-Sepharose在冰上一起溫育30分鐘，離心分離，測(cè)定上清中的SDF-1量。斜線柱和黑柱分別表示非加熱樣品和加熱(55℃30分鐘)樣品。
圖7表示GM-CSF的校正曲線。用TR-FIA方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)GM-CSF。數(shù)據(jù)是3次測(cè)定的平均值。
圖8是IL-2的校正曲線。用TR-FIA法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)IL-2。數(shù)據(jù)是3次測(cè)定的平均值。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。
本發(fā)明的方法基于時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR-FIA)方法。
“時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)”是應(yīng)用如本發(fā)明中鑭系金屬離子絡(luò)合物的能放射長(zhǎng)壽命熒光的熒光化合物，通過免疫學(xué)反應(yīng)標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物，在較短壽命的背景熒光消失后，對(duì)來自標(biāo)記物的熒光信號(hào)進(jìn)行時(shí)間分辨型測(cè)定的測(cè)定方法。
本發(fā)明的方法尤其適于高靈敏度檢測(cè)體液樣品中的細(xì)胞因子?！绑w液樣品”是指從動(dòng)物，優(yōu)選從哺乳動(dòng)物，尤其是從人體采集的液態(tài)物質(zhì)。代表例有血液(即全血)及其分級(jí)物血漿和血清，以及腦脊髓液、膽汁、羊水、胸水、腹水、呼吸道內(nèi)分泌液、骨髓液、乳汁、淚液、鼻腔分泌物、心內(nèi)膜液、關(guān)節(jié)內(nèi)包液、唾液、精液、尿等。動(dòng)物來源的培養(yǎng)細(xì)胞的上清液等也包括在體液樣品中。本發(fā)明的方法在應(yīng)用全血、血漿、血清或腦脊髓液時(shí)，尤其是應(yīng)用全血或血漿時(shí)效果顯著。稱為體液樣品時(shí)，通常包括生物體液自身和用生物體液適宜的載體進(jìn)行稀釋等處理后的液態(tài)樣品兩者。
“細(xì)胞因子”是指在生物體細(xì)胞間負(fù)責(zé)信息傳遞的蛋白質(zhì)性化學(xué)物質(zhì)。對(duì)于每種細(xì)胞因子來講，靶細(xì)胞表面上表達(dá)其特征的受體，通過與受體結(jié)合而顯示細(xì)胞增殖、分化等生理活性。統(tǒng)稱為“造血因子”的一組誘導(dǎo)血細(xì)胞分化和增殖的細(xì)胞因子包括包含粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-單集落刺激因子(GM-CSF)的集落刺激因子(CSF)、干細(xì)胞因子、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素等。調(diào)控淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞介素包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18等。統(tǒng)稱為“生長(zhǎng)因子”的一組細(xì)胞因子包括TGF-β家族、EGF家族、FGF家族、IGF家族、NGF家族、血小板來源的生長(zhǎng)因子(PDGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)等。統(tǒng)稱為“腫瘤壞死因子”的一組細(xì)胞因子包括TNF-α、TNF-β等。統(tǒng)稱為“干擾素”的一組細(xì)胞因子包括INF-α、INF-β、INF-γ等。其它已知的細(xì)胞因子有內(nèi)皮素、膠質(zhì)細(xì)胞株來源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)等。細(xì)胞因子中，使任一種功能上成熟的血細(xì)胞具有化學(xué)趨避性的一組細(xì)胞因子稱作趨化因子。按照其N末端所保存的半胱氨酸的位置，將趨化因子分為CC、CXC、C、CXXXC4類。
本發(fā)明的方法中的檢測(cè)對(duì)象可以是上述趨化因子中的任一種。再者，屬于上述細(xì)胞因子一組的新發(fā)現(xiàn)的成員，或者不屬于上述細(xì)胞因子一組的新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子也是本發(fā)明方法中的檢測(cè)對(duì)象。尤其是，本發(fā)明的方法適用于在血循環(huán)中以可溶性性因子存在、微量即具有生物學(xué)活性、與多種疾病相關(guān)的細(xì)胞因子。
本發(fā)明方法中檢測(cè)對(duì)象的例子有屬于上述趨化因子家族的細(xì)胞因子，尤其是CXC趨化因子，但不一定限于這些分類。本發(fā)明中最優(yōu)選的檢測(cè)對(duì)象的例子為SDF-1。
本發(fā)明的方法中，為了選擇性捕捉、標(biāo)記體液樣品中所期望的細(xì)胞因子，在固相上形成包含該細(xì)胞因子的復(fù)合物。具體而言，含有細(xì)胞因子的復(fù)合物是由以下成分在適宜的固相上形成的(a)具有固相結(jié)合部分和能與細(xì)胞因子結(jié)合區(qū)域的第一抗體；(b)細(xì)胞因子；(c)具有能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和生物素結(jié)合部分的第二抗體；(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物；以及(e)鑭系金屬離子。
以下，對(duì)各成分進(jìn)行說明。
首先，作為“固相”可應(yīng)用任意形狀和材質(zhì)的固體物質(zhì)，只要是能進(jìn)行抗體的結(jié)合且不妨礙上述復(fù)合物的形成以及后述的熒光測(cè)定即可。為了便于測(cè)定方法的實(shí)施，代表性的可應(yīng)用多孔型微量滴度板，也可應(yīng)用填充了珠子的柱子(珠子的材質(zhì)為葡聚糖、瓊脂糖等，但并不限于此)等其它形狀的物質(zhì)。本發(fā)明中尤適宜應(yīng)用具有中等程度的蛋白質(zhì)吸附能力的微量滴度板。這里的“中等程度”的吸附能力是指當(dāng)免疫球蛋白G(IgG)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)被吸附時(shí)，代表性的吸附約50～約200ng/cm2，優(yōu)選約15～約150ng/cm2，更優(yōu)選約90～約120ng/cm2的吸附能力。微量滴度板的材質(zhì)優(yōu)選聚苯乙烯，但不限定于此。
成分(a)“第一抗體”是以與上述固相結(jié)合的狀態(tài)存在，且通過抗原-抗體反應(yīng)能與所期望的細(xì)胞因子結(jié)合的抗體。根據(jù)這種概念，將第一抗體稱做“捕捉抗體”。本說明書中的“抗體”包含多克隆抗體、單克隆抗體、Fab、(Fab)2、嵌合抗體等任意類型的免疫球蛋白(Ig)和免疫球蛋白來源的分子。術(shù)語“抗體”用意廣泛，只要與免疫球蛋白同樣能與細(xì)胞因子結(jié)合，以該細(xì)胞因子作配體的受體也包含在內(nèi)。優(yōu)選的抗體例子是多克隆抗體或單克隆抗體。針對(duì)各種細(xì)胞因子的抗體均有市售，例如可購(gòu)自R&D System Inc.(Minnesota，US)、Dako Immunoglobulinsals(丹麥)、PharMingen(California，US)、Southern Biotechnology Associates(Alabama，US)等公司?；蛘呖梢岳妹庖邉?dòng)物、雜交瘤技術(shù)等常規(guī)方法制備針對(duì)所期望的細(xì)胞因子的抗體。
結(jié)合到固相的方法可按照常規(guī)的方法進(jìn)行，例如將第一抗體直接涂布到微量滴度板上。第一抗體中的“固相結(jié)合部分”代表性的指其一部分吸附到固相上的、抗體的Fc區(qū)域，但并不限于此。例如也可應(yīng)用能分別與固相和抗體的一部分結(jié)合的雙功能性的連接分子。
成分(b)，即存在于體液樣品中的所期望的細(xì)胞因子，代表性的是通過與第一抗體結(jié)合而固定到固相上。細(xì)胞因子不必以游離狀態(tài)與第一抗體接觸，例如可與后述的第二抗體結(jié)合后與第一抗體結(jié)合。這樣品發(fā)明中復(fù)合物的形成不限于各成分結(jié)合的次序。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)當(dāng)把含有所期望細(xì)胞因子的體液樣品暴露給能與該細(xì)胞因子結(jié)合的抗體時(shí)，用適當(dāng)?shù)木彌_液將之稀釋成適宜的濃度對(duì)于高靈敏度檢測(cè)細(xì)胞因子是很重要的。用緩沖液稀釋體液樣品的稀釋倍數(shù)，當(dāng)用(體液樣品∶緩沖液)的體積表示時(shí)，代表性的約1∶1～約1∶30，優(yōu)選約1∶2.5～約1∶20，更優(yōu)選約1∶5～約1∶15的范圍。稀釋倍數(shù)的最適值要根據(jù)體液樣品的種類和細(xì)胞因子的種類而變動(dòng)，還要依賴于樣品稀釋緩沖液的組成。
適宜的樣品稀釋緩沖液為由三(羥甲基)氨基甲烷(略作“Tris”)和無機(jī)酸構(gòu)成的弱堿性緩沖液，代表性的為Tris-HCl。其pH，代表性的為約7.0～約8.0，優(yōu)選約7.3～約8.3，更優(yōu)選約7.5～約8.1。代表性的濃度為約0.005～約0.2摩爾(M)，優(yōu)選約0.01～約0.1M，更優(yōu)選約0.025～約0.075M。
樣品稀釋緩沖液還包含適量的血漿蛋白質(zhì)成分和鹽類。血漿蛋白質(zhì)成分代表性的為血清白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。其濃度代表性的為約0.05～約0.5％左右，優(yōu)選約0.1～約0.3％，更優(yōu)選約0.15～約0.25％。鹽類代表性的為疊氮鈉(NaN3)和氯化鈉(NaCl)。NaN3的濃度代表性的為約0.02～約0.4％，優(yōu)選約0.05～約0.2％，更優(yōu)選約0.05％～約0.15％。NaCl的濃度代表性的為約0.2～約3％，優(yōu)選約0.5～約1.5％，更優(yōu)選約0.6～約0.12％。
不用說樣品稀釋緩沖液的組成不限定于上述條件，也允許該領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行便宜的各種改變。例如，可用其它堿金屬或堿土金屬對(duì)應(yīng)的鹽置換上述鈉鹽的一部分或全部。樣品稀釋緩沖液的pH和各成分的濃度等的最佳值可根據(jù)檢測(cè)對(duì)象細(xì)胞因子的種類而不同，還依賴于體液樣品的稀釋倍率。該領(lǐng)域的技術(shù)人員可在通常條件設(shè)定方法的范圍內(nèi)使之最優(yōu)化。
成分(c)“第二抗體”具有能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域，并與第一抗體一起以?shī)A心形式捕捉所期望的細(xì)胞因子。第一抗體與第二抗體最好是互不干涉，識(shí)別同一細(xì)胞因子不同部位(即不同表位)的抗肽抗體。因此，與所期望的細(xì)胞因子的結(jié)合能力相關(guān)，第一抗體和第二抗體的適當(dāng)組合是很重要的。例如，可用全長(zhǎng)細(xì)胞因子，或用已知或預(yù)測(cè)包含多個(gè)表位的細(xì)胞因子的片段免疫適當(dāng)?shù)膭?dòng)物，從獲得的多種多克隆抗體中選擇適當(dāng)?shù)慕M合。或者從識(shí)別表位不同的多個(gè)單克隆抗體中選擇適當(dāng)?shù)慕M合。這樣的選擇不是特別難進(jìn)行，例如可通過制備細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)需檢測(cè)的抗體組合用常規(guī)ELISA進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。
第二抗體還具有生物素結(jié)合部分，并可通過熒光測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞因子。根據(jù)這這種概念，又把第二抗體叫做“檢測(cè)抗體”。生物素是一種維生素，又叫做維生素H或輔酶R，并可與肽等的氨基形成酰胺鍵。第二抗體可通過應(yīng)用常規(guī)方法，對(duì)檢測(cè)對(duì)象細(xì)胞因子的抗體進(jìn)行生物素化和純化來進(jìn)行制備。第二抗體中的“生物素結(jié)合部分”是指生物素自身和結(jié)合了生物素的抗體的一部分(代表性的為Fc區(qū)域)。必要時(shí)可應(yīng)用能與生物素和抗體的一部分結(jié)合的雙功能性連接分子連接這兩部分。
這里，“第二抗體”不必為單一分子，可表示任意結(jié)構(gòu)單位，只要能履行必要的功能(即，通過抗原-抗體反應(yīng)或配體-受體結(jié)合反應(yīng)可結(jié)合細(xì)胞因子的功能，以及攜持生物素的功能)即可。上述“第一抗體”也同樣。例如，本發(fā)明中可應(yīng)用抗所期望細(xì)胞因子的抗體和能與該抗細(xì)胞因子抗體結(jié)合的生物素化抗IgG抗體的組合。此時(shí)，抗細(xì)胞因子抗體與生物素化抗IgG抗體的組合統(tǒng)稱為“第二抗體”。生物素化抗IgG抗體具有普遍適用性，所以很方便。另外，當(dāng)針對(duì)所期望細(xì)胞因子的抗體因某種原因?qū)ι锼鼗磻?yīng)有抵觸性時(shí)，組合應(yīng)用生物素化抗IgG抗體則可以奏效。另一方面，從簡(jiǎn)化測(cè)定程序、且使細(xì)胞因子的檢測(cè)靈敏度最大化的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選應(yīng)用單一分子作為第二抗體。
成分(d)的“結(jié)合物”是具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的任意結(jié)構(gòu)單位，代表性的是鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白與熒光結(jié)構(gòu)部分直接或間接通過共價(jià)鍵連接起來的分子。眾所周知，鏈霉抗生物素蛋白通常是由放線菌產(chǎn)生的分子量約6萬的蛋白質(zhì)，具有很強(qiáng)地與生物素結(jié)合的性質(zhì)。但是，本發(fā)明中的“鏈霉抗生物素蛋白”對(duì)微生物來源不作限定，只要它基本上維持與生物素結(jié)合的能力，可包含其它微生物來源的相應(yīng)蛋白質(zhì)及其修飾物。眾所周知，通?？股锼氐鞍资锹寻字邪姆肿恿考s7萬的蛋白質(zhì)，也具有很強(qiáng)地與生物素結(jié)合的性質(zhì)。本發(fā)明中的“抗生物素蛋白”不限于天然的卵白蛋白質(zhì)，只要能基本上維持與生物素結(jié)合的能力，也包含其修飾物。
由上述原則可知，本發(fā)明的方法也可通過應(yīng)用具有能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結(jié)合部分的抗體替代成分(c)，以及通過應(yīng)用具有生物素和能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物替代成分(d)來完成。
成分(d)的結(jié)合物中能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分是指相應(yīng)的熒光化合物與鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白間直接或間接形成共價(jià)鍵，通過這樣的反應(yīng)而得到的部分結(jié)構(gòu)。熒光結(jié)構(gòu)部分可用下面的通式(I)表示。
-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X(I)(式中，R為能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)殘基，Ar是具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數(shù)，X為氟原子或通式(II)表示的基團(tuán))
-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R(II)上述通式中，規(guī)定殘基R的“能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)”是指能與蛋白質(zhì)中氨基酸殘基具有的任意反應(yīng)性基團(tuán)(代表性的如氨基、羧基和羥基)反應(yīng)并能形成共價(jià)鍵的任何有機(jī)官能團(tuán)。這樣的官能團(tuán)的例子包括下面所示的基團(tuán)-N＝C＝S，-N＝C＝O， -N2X，-N3， -SO3CF3，-NH2， -SO2X，-SO3H，-SH，-X，-CX3， (其中，X選自鹵素原子、-OSO2CH3、-OSO2F、-OSO2CF3、-OSO2C4F9或-OSO2PhCH3-p(Ph為苯基)，RA選自烷基、鏈烯基、芳香基、或芳烷基，RB選自亞烷基、亞烯基、亞芳基或亞芳烷基，p為0～5，q為2～10)上述通式中，規(guī)定Ar的“具有共軛雙鍵體系的烴基”是指至少有3個(gè)共軛的雙鍵的烴基，代表性的是至少有1個(gè)苯環(huán)的2價(jià)或3價(jià)芳香族烴基。對(duì)烴基的碳原子數(shù)上限沒有特殊限制，代表性的在約50個(gè)以內(nèi)，優(yōu)選在約30個(gè)以內(nèi)。這里，1個(gè)以上的碳可被雜原子(例如氧或硫原子)所取代。烴基Ar的例子包括下列基團(tuán)。
(m為1～6的整數(shù)) 優(yōu)選烴基Ar為3價(jià)，熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(III)表示。
-R-Ar-(C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1)2(III)這里，較優(yōu)選的Ar例子是在4，4′位與2個(gè)β-二酮基結(jié)合的O-三苯基。同樣優(yōu)選的Ar的其它例子是將2個(gè)β-二酮放置在與O-三苯基中的β-二酮位置近似或基本上同一空間距離的3價(jià)芳香族烴基。
上述通式中，n為1以上的整數(shù)，代表性的為1～6，優(yōu)選2～4。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的熒光結(jié)構(gòu)部分是4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺?；?鄰-三苯基。它是從相應(yīng)的熒光化合物4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-氯磺酰基-鄰-三苯基(略作“BHHCT”)獲得的。BHHCT的結(jié)構(gòu)式如下所示 提供上述熒光結(jié)構(gòu)部分的所期望的熒光化合物，可利用常規(guī)的有機(jī)合成反應(yīng)而合成。代表性的是按照包括以下2個(gè)步驟的工序合成(第一步)在適當(dāng)?shù)娜軇┲幸约皦A性催化劑(例如甲基鈉鹽)存在的條件下，使乙?；姆枷阕寤衔锱c過氟羧酸酯進(jìn)行Claisen縮合反應(yīng)，生成乙酰基的CH3被過氟羧酸酯化了的β-二酮化合物。
(第二步)將能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)導(dǎo)入β-二酮化合物中。例如，通過應(yīng)用氯磺酸進(jìn)行氯磺化反應(yīng)而使芳香環(huán)的氫被置換為氯磺酰基(ClSO3-)。必要時(shí)在各步后進(jìn)行重結(jié)晶、沉淀等純化。
所得熒光性化合物依賴于在上述第二步中導(dǎo)入的官能團(tuán)種類，在適當(dāng)?shù)臈l件下可與蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，從而提供目的熒光結(jié)構(gòu)部分。例如，氯磺?；c蛋白質(zhì)中的氨基在堿性反應(yīng)條件下很容易地形成酰胺。
本發(fā)明中，成分(d)的結(jié)合物可通過用熒光化合物直接標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而制備?；蛘咄ㄟ^首先結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白與其它蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白)后，再對(duì)之進(jìn)行標(biāo)記而制備。鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白與其它蛋白的結(jié)合可按常規(guī)方法進(jìn)行，如應(yīng)用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。
用熒光化合物標(biāo)記蛋白質(zhì)的反應(yīng)，代表性的是將蛋白質(zhì)溶解到已調(diào)節(jié)至適于反應(yīng)的pH(例如，進(jìn)行氯磺化時(shí)，pH約為9左右)的緩沖液中后，在該緩沖液中以期望的摩爾比量添加溶解到適宜溶劑(例如乙醇或二甲基甲酰胺)的熒光化合物來進(jìn)行。可通過調(diào)節(jié)相對(duì)于蛋白質(zhì)的熒光化合物的摩爾比以及通過調(diào)節(jié)含有熒光化合物的溶液的濃度，控制每1個(gè)蛋白質(zhì)分子結(jié)合的熒光化合物的比率(亦稱為“結(jié)合比”)。該結(jié)合比相當(dāng)于本發(fā)明的結(jié)合物中每1分子鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的熒光結(jié)構(gòu)部分的單位數(shù)。結(jié)合比代表性的為5-100單位，優(yōu)選10～60單位。結(jié)合比過低的話，得不到足夠高的細(xì)胞因子檢測(cè)的靈敏度。另一方面，結(jié)合比過高也不會(huì)提高檢測(cè)靈敏度。
本發(fā)明方法中，通過成分(e)鑭系金屬離子與上述熒光結(jié)構(gòu)部分絡(luò)合，在固相上形成復(fù)合物。鑭系金屬離子的例子包括銪(Eu)、釤(Sm)、鋱(Tb)和鏑(Dy)。其中，優(yōu)選銪。通常鑭系金屬離子預(yù)先與成分(d)的結(jié)合物絡(luò)合，在此狀態(tài)下用于復(fù)合物的形成。也就是說，通常在上述鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和生物素形成結(jié)合的時(shí)間點(diǎn)，熒光結(jié)構(gòu)部分已形成了挾持Eu3+的絡(luò)合物。但并不妨礙與此相反的程序。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)將上述在固相上形成的復(fù)合物進(jìn)行熒光測(cè)定之前，用適宜的緩沖液進(jìn)行充分洗滌，對(duì)于高靈敏度的細(xì)胞因子的檢測(cè)是重要的。這里所講的適當(dāng)?shù)膹?fù)合物洗滌緩沖液是由Tris和無機(jī)酸構(gòu)成的堿性緩沖液，代表性的是Tris-HCl。其pH，代表性的為約8.2～約9.8，優(yōu)選約8.5～約9.5，更優(yōu)選約8.7～約9.4。其濃度，代表性的是約0.005～約0.2M，優(yōu)選約0.01～約0.1M，更優(yōu)選約0.025～約0.075M。
復(fù)合物洗滌緩沖液還含有適量的、具有蛋白質(zhì)促溶能力的非離子表面活性劑。該非離子表面活性劑，代表性的為聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯，優(yōu)選商品名為“Tween(注冊(cè)商標(biāo))20”的市售聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(分子量約1200)。也可優(yōu)選應(yīng)用與Tween(注冊(cè)商標(biāo))20基本上具有同一性質(zhì)(例如羥基值為約95～約115，皂化值為約35～約55，HLB為約15～約18(親水性-疏水性平衡))的其它非離子表面活性劑。非離子表面活性劑的濃度代表性的為約0.005～約0.2％，優(yōu)選約0.01～約0.1％，更優(yōu)選約0.025～約0.075％。
不言而喻，復(fù)合物洗滌緩沖液的組成并不限定于上述條件，允許該領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行便宜的各種改變。PH和各成分的濃度等的最佳值可根據(jù)作為檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞因子的種類而不同。這種最優(yōu)化可由該領(lǐng)域的技術(shù)人員在通常條件設(shè)定方法的范圍內(nèi)進(jìn)行。
以下，概括說明本發(fā)明方法中在固相上形成復(fù)合物的代表性程序的例子。
1)將用適宜的涂布用緩沖液稀釋的第一抗體的溶液施用到固相上(例如96孔微量滴度板的孔)，通過孵育，將一抗固定到固相。作為涂布緩沖液，例如可應(yīng)用含有適量NaCl的磷酸緩沖液。孵育的條件，代表性的是約2～6℃左右20小時(shí)以上。
2)接著用洗滌緩沖液洗滌數(shù)次涂布了第一抗體的固相表面。作為洗滌緩沖液，例如可應(yīng)用弱堿性的Tris-HCl，必要時(shí)可添加適量的具有蛋白質(zhì)促溶能力的非離子表面活性劑。洗滌后將涂布了的固相保存于-20℃，直到需要進(jìn)行測(cè)定之前。
3)如上所述，優(yōu)選預(yù)先用稀釋緩沖液對(duì)含有檢測(cè)對(duì)象細(xì)胞因子的體液樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋。將該體液樣品以及根據(jù)需要將該細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)溶液施用到已涂布了的固相上進(jìn)行孵育。孵育的條件，代表性的是約35～39℃左右約40分鐘～約2小時(shí)左右。孵育后與上述同樣，用洗滌緩沖液數(shù)次洗滌固相表面。
4)其后，將用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋的第二抗體溶液施用到固相上。這里，優(yōu)選應(yīng)用與上述樣品稀釋緩沖液相同的溶液。孵育條件與體液樣品的上述孵育條件相同。孵育后與上面同樣，用洗滌緩沖液數(shù)次洗滌固相表面。
5)將結(jié)合物與鑭系金屬離子的鹽溶液混合，形成熒光性絡(luò)合部分。用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尳j(luò)合的結(jié)合物后，施用到固相上進(jìn)行孵育。孵育條件與體液樣品和二抗的上述各孵育條件相同。孵育后，如上所述，用適當(dāng)?shù)膹?fù)合物洗滌緩沖液洗滌在固相上形成的復(fù)合物。
將由上述步驟得到的含有鑭系絡(luò)合物的復(fù)合物供給到固相或液相的時(shí)間分辨型熒光測(cè)定。該熒光測(cè)定的裝置可從市場(chǎng)上購(gòu)買。測(cè)定條件是，代表性的是延遲時(shí)間為約0.2～約0.3毫秒(ms)，窗口時(shí)間為約0.2～約0.6ms，閃爍速度(flash rate)為約0.5～約1.5ms，激發(fā)波長(zhǎng)為337.1nm(氮激光的波長(zhǎng))，測(cè)定波長(zhǎng)為615nm。
進(jìn)行固相熒光測(cè)定時(shí)，可將具有上述復(fù)合物的固相直接供給到熒光測(cè)定條件。進(jìn)行液相熒光測(cè)定時(shí)，要通過用適當(dāng)?shù)慕怆x溶液處理復(fù)合物，使含有熒光性絡(luò)合部分的結(jié)構(gòu)單位游離到溶液中，再將該溶液提供給熒光測(cè)定條件。代表性的解離溶液是含有三烷基膦氧化物和陰離子表面活性劑的弱堿性水溶液。作為解離溶液的例子，可應(yīng)用含有三(正辛基)膦氧化物(TOPO)和十二烷基硫酸鈉(SDS)的碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液。應(yīng)用這樣的解離溶液，通過與具有上述復(fù)合物的固相例如在約45～55℃左右孵育約40分～約2小時(shí)，切斷上述鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和生物素的結(jié)合，使含有熒光絡(luò)合物部分的結(jié)合物游離到溶液中。
根據(jù)上述液相熒光測(cè)定，因?yàn)楣滔嗯c熒光測(cè)定無關(guān)，所以其優(yōu)點(diǎn)是固相種類及材質(zhì)的選擇范圍更廣。另一方面，與固相熒光測(cè)定相比，液相熒光測(cè)定需要額外的步驟，所以程序復(fù)雜。再者，與固相熒光測(cè)定相比，因在用解離溶液處理的過程中容易受雜質(zhì)的影響，液相熒光測(cè)定的靈敏度有一些降低。但是，可以認(rèn)為固相和液相熒光測(cè)定各自所能達(dá)到的最大靈敏度，可以通過與測(cè)定相關(guān)的各種條件的組合來進(jìn)行變動(dòng)。
根據(jù)本發(fā)明，它還提供用于實(shí)施上述時(shí)間分辨熒光測(cè)定(TR-FIA)的試劑盒。通常，該試劑盒至少包括上述成分(a)、(c)、(d)和(e)作為構(gòu)成物件。也就是說，將具有固相結(jié)合部分和能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域的第一抗體，具有能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和生物素結(jié)合部分的第二抗體，具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物，和鑭系金屬一起提供給測(cè)定者，使檢測(cè)體液樣品中的細(xì)胞因子的測(cè)定可以實(shí)施。必要時(shí)試劑盒還可包括測(cè)定對(duì)象細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品，上述各種緩沖液(特別是樣品稀釋緩沖液和復(fù)合物洗滌緩沖液)等。通常試劑盒的構(gòu)成物件各自以適宜的方式貯存在容器內(nèi)，與使用說明書或指示書一起作為一整體進(jìn)行包裝。
根據(jù)本發(fā)明，使得正確且高靈敏度檢測(cè)體液樣品中的細(xì)胞因子，尤其是包含SDF-1的趨化因子的新方法可以應(yīng)用。當(dāng)用與下述實(shí)施例2基本上相同的條件進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，本發(fā)明方法中細(xì)胞因子的檢測(cè)界限代表性的為約100pg/ml以下，優(yōu)選為約50pg/ml以下，更優(yōu)選為約30pg/ml以下。同樣在與實(shí)施例2基本上相同的條件下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞因子測(cè)定的變動(dòng)系數(shù)(CV)代表性的為約低于10％，優(yōu)選約低于8％，更優(yōu)選約低于7％。另外，當(dāng)在與實(shí)施例6基本上相同的條件下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，該細(xì)胞因子由血漿樣品的回收率代表性的為約70％以上，優(yōu)選約80％以上，更優(yōu)選90％以上。此外，于不同日期內(nèi)在同一條件下重復(fù)測(cè)定4次同一個(gè)體來源的血漿樣品中細(xì)胞因子時(shí)，其測(cè)定值的變動(dòng)優(yōu)選在約10～約20％的范圍內(nèi)。
如下述實(shí)施例所示，尤其對(duì)于SDF-1，與ELISA和DELFIA等傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明中通過利用熒光化合物BHHCT來源的Eu3+絡(luò)合物，可使血漿樣品中的檢測(cè)靈敏度改善2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。正確把握SDF-1在體內(nèi)的行為并闡明其生理功能，對(duì)深入理解HIV-1感染、開拓AIDS治療的新展望是極其重要的。很明顯本發(fā)明能對(duì)細(xì)胞因子的分子生物學(xué)的發(fā)展及應(yīng)用作出極為有意義的貢獻(xiàn)。
此外，如下述實(shí)施例所示，根據(jù)本發(fā)明，通過應(yīng)用熒光化合物BHHCT來源的Eu3+絡(luò)合物，可以與SDF-1同樣的高靈敏度測(cè)定趨化因子家族以外的細(xì)胞因子，例如在血循環(huán)中以可溶性因子存在、微量即保持生物活性、不僅與多種病理相關(guān)且已用于治療的細(xì)胞因子，且再現(xiàn)性良好。
實(shí)施例以下，結(jié)合實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。但這些實(shí)施例并不限定本發(fā)明。
實(shí)施例中使用的材料、裝置及測(cè)定條件如下抗體用包含人SDF-1β的殘基33～45(RFFESHIARANVK)的多克隆抗體原肽(Research Genetics，Alabama，U.S.)免疫兔子，以誘導(dǎo)抗SDF-1的抗血清。用親合柱純化抗血精，然后應(yīng)用。針對(duì)人SDF-1β的山羊多克隆抗體購(gòu)自R&D System Inc.(Minnesota，U.S.)。針對(duì)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-單集落刺激因子(GM-CSF)的人單克隆抗體購(gòu)自PharMingen(California，U.S.)。針對(duì)人白細(xì)胞介素2(IL-2)的單克隆抗體購(gòu)自PharMingen(California，U.S.)。
趨化因子人RANTES、人MIP-1α和β、人MDC和人fractalkine購(gòu)自DIACLONE Research(法國(guó))。人IL-8購(gòu)自ENDOGEN(Massachusetts，U.S.)。用市售的ELISA試劑盒來測(cè)定加入到血漿中的小鼠IL-8和小鼠MCP-1。小鼠IL-8購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech(瑞典)，小鼠MCP-1購(gòu)自PharMingen(California，U.S.)。小鼠SDF-1α、小鼠SDF-1β、人SDF-1α和人SDF-1β均由Genetics Institute(Massachusetts，U.S.)贈(zèng)送。人GM-CSF購(gòu)自PharMingen(Califomia，U.S.)。人IL-2購(gòu)自PharMingen(California，U.S.)。
裝置及測(cè)定條件應(yīng)用Wallac(法國(guó))和Amersham PharmaciaBiotech的1420型ARVO多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀進(jìn)行時(shí)間分辨型熒光測(cè)定。測(cè)定條件如下延遲時(shí)間0.20毫秒(ms)，窗口時(shí)間0.40ms，閃爍速度1.00ms。為了得到最靈敏的TR-FIA測(cè)定體系，測(cè)定了5種購(gòu)自Nunc(丹麥)的微量滴度板。其中，polysorp板在標(biāo)準(zhǔn)人SDF-1β的測(cè)定中產(chǎn)生最敏銳的熒光信號(hào)。靈敏度的次序如下White C96 polysorp＞W(wǎng)hite C96 maxisorp＞W(wǎng)hite C8maxisorp＞Black F16maxisorp。以下實(shí)驗(yàn)常用White C96maxisorp微量滴度板。(實(shí)施例1TR-FIA的預(yù)研究)最初試圖找出測(cè)定SDF-1的、基于ELISA的免疫檢測(cè)體系適用的固相結(jié)合捕捉抗體與檢測(cè)抗體的良好組合。為了這一目的，對(duì)多克隆兔抗SDF-一抗體和多克隆山羊抗SDF-一抗體共5種進(jìn)行了各種組合。有3種組合可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)SDF-1的特異性檢測(cè)。但是ELISA測(cè)定時(shí)，SDF-1的檢測(cè)界限沒有超越約10～20ng/ml的范圍。通常，血漿中存在的SDF-1的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該檢測(cè)界限。因此可以確定用ELISA測(cè)定事實(shí)上不能進(jìn)行血漿樣品中SDF-1的檢測(cè)。
應(yīng)用在上面找到的最佳多克隆抗體的組合，對(duì)通常的TR-FIA條件進(jìn)行了如下改變后，進(jìn)行SDF-1的檢測(cè)。(實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)SDF-1的TR-FIA)為TR-FIA制備4種測(cè)定緩沖液。涂布96孔微量滴度板的緩沖液1(含有0.14M NaCl的0.15M磷酸緩沖液(PBS))；洗滌板的緩沖液2(含0.05％Tween 20的0.05M Tris-HCl，pH7.8)；洗滌緩沖液3(0.05MTris-HCl，pH7.8)；稀釋蛋白質(zhì)溶液的緩沖液4(含有0.2％BSA，0.1％NaN3和0.9％NaCl的0.05M Tris-HCl，pH7.8)。
BHHCT的合成按照Yuan等(′98)(文獻(xiàn)5)所述的方法實(shí)施。鏈霉抗生物素蛋白-牛血清白蛋白(SA-BSA)結(jié)合物的制備，及用BHHCT對(duì)結(jié)合物的標(biāo)記按照Yuan等(′97)(文獻(xiàn)4)所述的方法進(jìn)行。將標(biāo)記的結(jié)合物溶液于-20℃保存，使用前即刻用下述的緩沖液(緩沖液4)稀釋100倍。
應(yīng)用兔抗人SDF-1β多克隆抗體或山羊抗人SDF-1β多克隆抗體作為捕捉抗體。它們各產(chǎn)生相似的結(jié)果。將用緩沖液1稀釋到10μg/ml的捕捉抗體溶液(各60μl)加到96孔微量滴度板的孔中，4℃保溫24小時(shí)。然后用緩沖液2將孔洗2次，用緩沖液3洗1次。這樣的用抗SDF-一抗體涂布的板子在-20℃至少可保存1個(gè)月。
將SDF-1標(biāo)準(zhǔn)溶液(50μl)吸到涂布的上述板中，37℃孵育1小時(shí)。用緩沖液2和3洗滌板子后，將50μl用緩沖液4稀釋1000倍的生物素化的山羊抗人SDF-1β多克隆抗體(用常規(guī)方法使上述R&D System的山羊抗體生物素化)加到孔中，37℃孵育1小時(shí)。孵育后，用緩沖液2洗2次板，然后用緩沖液3洗1次，然后加入50μl用BHHCT-Eu3+標(biāo)記的BSA-SA溶液(50μl)，37℃孵育1小時(shí)。用含有0.05％Tween 20的0.05MTris-HCl(pH9.1)將板洗4次。應(yīng)用1420型ARVO多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀對(duì)該培養(yǎng)板進(jìn)行固相熒光測(cè)定。
通過上述TR-FIA得到的水性溶液中的SDF-1的校正曲線如圖1a和圖1b所示。應(yīng)用TR-FIA時(shí)，SDF-1的檢測(cè)界限可通過以下計(jì)算式(Kropf等(文獻(xiàn)2))計(jì)算。
3×[S0]×SB/(S0-B)這里，[S0]為標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低濃度SB為空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差S0為最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光信號(hào)強(qiáng)度B 為空白的熒光信號(hào)強(qiáng)度通過上式計(jì)算出TR-FIA的檢測(cè)界限為30pg/ml。這比上述參考例中的ELISA的檢測(cè)界限(約10-20ng/ml)低3個(gè)數(shù)量級(jí)。由于每孔應(yīng)用50μl溶液，所以用TR-FIA檢測(cè)出的SDF-1蛋白質(zhì)的最小量為1.5pg/孔。
在測(cè)定的重現(xiàn)性這一點(diǎn)上TR-FIA也有所改善。標(biāo)準(zhǔn)樣品在0.1ng/ml～1204ng/ml的濃度范圍內(nèi)時(shí)，應(yīng)用TR-FIA檢測(cè)SDF-1的變動(dòng)系數(shù)(CV)＜7％。與此相對(duì)，上述參考例中，在10ng/ml～1000ng/ml的濃度范圍內(nèi)，應(yīng)用ELISA時(shí)的CV值超過10％；在0.1ng/ml～1024ng/ml的濃度范圍內(nèi)，應(yīng)用DELFIA(參照下述比較例)時(shí)的CV值也超過10％。
除了上述固相熒光測(cè)定外，對(duì)液相熒光測(cè)定也進(jìn)行了研究。即，通過用酸性螯合的表示活性劑溶液(含有10μM TOPO和0.05％SDS的0.1MNaHCO3水溶液)處理按上述程序在固相上形成的熒光性復(fù)合物(抗SDF-1多克隆抗體-SDF-1-生物素化抗SDF-1多克隆抗體-BHHCT-Eu3+標(biāo)記的BSA-SA)，使標(biāo)記的BSA-SA結(jié)合物從固相上游離出來。用1420型ARVO多標(biāo)記記數(shù)儀測(cè)定溶液中的結(jié)合物的熒光強(qiáng)度。此時(shí)的SDF-1檢測(cè)靈敏度約為100pg/ml，不如上述固相測(cè)定那么高。(實(shí)施例3人SDF-1β對(duì)CXCR4的下調(diào))為了確認(rèn)用實(shí)施例2中的TR-FIA測(cè)定SDF-1的測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)SDF-1蛋白質(zhì)生物活性的相關(guān)性，用EL-4細(xì)胞體外測(cè)定通過與SDF-1結(jié)合而誘導(dǎo)的SDF-1受體(CXCR4)的下調(diào)。
在人SDF-1β(1，10，20，40，100和1000ng/ml)存在或不存在的條件下，在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改進(jìn)Eagle′s培養(yǎng)基(D′MEM)中培養(yǎng)EL-4細(xì)胞。37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，用Fc-人SDF-1α嵌合蛋白和FITC結(jié)合山羊F(ab′)2抗人IgG(Southern BiotechnologyAssociates，Alabama，U.S.)對(duì)細(xì)胞表面上的CXCR4進(jìn)行染色。用熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(FACSCalibur，BECTON DICKINSON，California，U.S.)進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定。通過計(jì)算CXCR4染色的平均熒光強(qiáng)度(MFI)減少％來評(píng)價(jià)CXCR4的下調(diào)。結(jié)果如圖1c所示。
圖1c顯示，與人SDF-1β一起培養(yǎng)的EL-4細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)以用量依賴性方式下調(diào)。所得結(jié)果與以前的報(bào)道(HesseIgesser等(文獻(xiàn)13)和Amara等(文獻(xiàn)14))一致性良好，即SDF-1α和β分別以5～10nM和2.3～3.6nM的Kd值與CXCR4結(jié)合。(實(shí)施例4TR-FIA對(duì)SDF-1測(cè)定的特異性)為了確認(rèn)TR-FIA對(duì)SDF-1的特異性，對(duì)以下各種趨化因子進(jìn)行與實(shí)施例2同樣的TR-FIA測(cè)定CC趨化因子(小鼠MCP-1、人MIP-1α和β、人RANTES，人MDC)、CXC趨化因子(人IL-8、小鼠SDF-1α和小鼠SDF-1β、人SDF-1α和人SDF-1β)以及CXXXC趨化因子(人Fractalkine)。結(jié)果如圖1d所示。除SDF-1之外其它任何趨化因子均未看到熒光強(qiáng)度的顯著性升高。因此可以確定上述TR-FIA可高特異性檢測(cè)SDF-1。人和小鼠的SDF-1α和SDF-1β間存在交差反應(yīng)性。(實(shí)施例5血漿樣品的制備)以下各實(shí)施例中使用的血漿樣品是用EDTA(1mg/ml血液)作抗凝劑，從36名18～30歲健康的志愿者(日本人)血液制備的。具體而言，在用0.1M EDTA涂層了的注射器中按每1ml采取血液為7μl填充含0.5MEDTA的PBS。將血采集到這樣的注射器中，室溫保存5分鐘，然后3000rpm離心10分鐘，得到血漿。-80℃保存血漿樣品，分析前立即用緩沖液4稀釋10倍，除非有其它指示。測(cè)定前不要反復(fù)凍融。(實(shí)施例6用血漿樣品進(jìn)行的TR-FIA)應(yīng)用SDF-1標(biāo)準(zhǔn)溶液和上述血漿樣品(來自5個(gè)個(gè)體)進(jìn)行實(shí)施例2中所述的TR-FIA。與由標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定求出的校正曲線(圖2左側(cè)所示黑圓線圖)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算出血漿樣品中的SDF-1濃度。為了確認(rèn)測(cè)定的準(zhǔn)確性，再向各血漿樣品中加入0.4或0.8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)SDF-1進(jìn)行測(cè)定，算出回收率。
添加標(biāo)準(zhǔn)SDF-1后所測(cè)定的血漿樣品的熒光強(qiáng)度如圖2右側(cè)(“TR-FIA”欄)所示。添加標(biāo)準(zhǔn)SDF-1前后血漿樣品的SDF-1濃度及回收率示于下述的表1中。結(jié)果表明與對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)相同，應(yīng)用TR-FIA，從血漿樣品中也可檢測(cè)出SDF-1并且回收率極高。(比較例DELFIA對(duì)SDF-1的檢測(cè))如無其它特殊情況，以下DELFTA的測(cè)定操作按制造者(AmershamPharinacia Biotech，以下稱作“APB公司”)的指示進(jìn)行。洗滌時(shí)全部應(yīng)用PBS/0.05％Tween 20。
將用PBS稀釋到10μg/ml的兔抗人SDF-1β抗體或山羊抗人SDF-1β抗體溶液(各60μl)吸附到透明的maxisorp板(Nunc，丹麥)中，4℃孵育24小時(shí)后，洗滌1次。接著用180μl DELFIA測(cè)定緩沖液(APB公司)于室溫至少處理30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合。
洗板3次后，每孔加入50μl用DELFIA測(cè)定緩沖液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)SDF-1或10倍稀釋的血漿，然后于4℃至少孵育6小時(shí)。將板洗3次后，添加100μl在測(cè)定緩沖液中稀釋到20ng/ml的Eu標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白(APB公司)，然后室溫孵育30分鐘。洗板6次后，添加DELFIA增感溶液(APB公司)，從與固相結(jié)合的Eu標(biāo)記抗體解離出Eu3+。將微量板緩慢振蕩5分鐘后，用時(shí)間分離型熒光儀(ARVO 1420)進(jìn)行熒光測(cè)定。
由標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定所得校正曲線如圖2左側(cè)所示(黑方塊線圖)。按實(shí)施例2所述的計(jì)算公式算出的檢測(cè)界限為130pg/ml。應(yīng)用DELFIA能檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)溶液中的SDF-1，但靈敏度比TR-FIA低。但是，對(duì)血漿樣品(來自4個(gè)個(gè)體)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，均檢測(cè)不到內(nèi)源性SDF-1。而且，向各血漿樣品中添加1.0ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)SDF-1并進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其回收率約為20％以下，遠(yuǎn)低于TR-FIA。
對(duì)添加標(biāo)準(zhǔn)SDF-1后的血漿樣品進(jìn)行測(cè)定的熒光強(qiáng)度示于圖2的右側(cè)(“DELFIA”欄)。添加標(biāo)準(zhǔn)SDF-1前后的血漿樣品的SDF-1濃度和回收率示于表1中(圖2和圖1的數(shù)據(jù)中顯示的血漿樣品均進(jìn)行了55℃、30分鐘的預(yù)熱)。
表1添加到人血漿中的SDF-1的回收率添加的標(biāo)準(zhǔn) SDF-1的測(cè)定值預(yù)測(cè)的總SDF-1回收率SDF-1(ng/ml)(ng/ml) (ng/ml) (％)(a)TR-FIA0 1.08-1.0 2.102.08 1020 1.53-1.0 2.482.53 950 1.68-1.0 2.692.68 1010 1.87-1.0 2.832.87 960 2.14-1.0 3.113.14 97(b)DELFIA0 ＜D.L.
1.0 0.20＞1.0 ＜200 ＜D.L.
1.0 0.16＞1.0 ＜160 ＜D.L.
1.0 0.17＞1.0 ＜170 ＜D.L.
1.0 0.20＞1.0 ＜20<D.L低于檢測(cè)界限(130pg/ml)>(實(shí)施例7抗凝劑和蛋白酶抑制劑的影響)據(jù)報(bào)道，抗凝劑和蛋白酶抑制劑影響人血漿樣品中細(xì)胞因子的檢測(cè)(Thavasu等(文獻(xiàn)15))。為了研究TR-FIA對(duì)SDF-1的測(cè)定是否也受這些因素的影響進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
向血漿樣品中添加乙二胺四乙酸(EDTA)(1.0mg/ml)、肝素(30IU/ml)、檸檬酸鈉(0.38％)或乙二胺四乙酸(EDTA)(1.0mg/ml)和蛋白酶抑制劑抑肽酶(1μg/ml)。應(yīng)用與實(shí)施例2同樣的TR-FIA測(cè)定各添加樣品中的SDF-1。結(jié)果如圖3a所示。可以確實(shí)抗凝劑和蛋白酶抑制劑對(duì)用TR-FIA進(jìn)行的血漿SDF-1的測(cè)定有顯著性影響。(實(shí)施例8血漿樣品預(yù)熱的影響)為了確保應(yīng)用TR-FIA進(jìn)行SDF-1測(cè)定在臨床應(yīng)用中的安全性，有必要將存在于血液樣品中的HIV病毒滅活。于是研究了血漿樣品的預(yù)加熱對(duì)TR-FIA的影響。
首先，為了試驗(yàn)SDF-1蛋白的熱穩(wěn)定性，將SDF-1標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于0℃30分鐘，37℃30分鐘，55℃30分鐘，70℃30分鐘，100℃1分鐘，然后進(jìn)行測(cè)定。觀察到在70℃30分鐘和100℃1分鐘的條件下檢測(cè)量降低，考慮是由于SDF-1的熱變性造成。另一方面，37℃或55℃加熱30分鐘時(shí)，可得到與不加熱樣品幾乎相同的校正曲線，不影響SDF-1的檢測(cè)量。
在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，測(cè)定前對(duì)24份血漿樣品(參照實(shí)施例5)于55℃進(jìn)行30分鐘的預(yù)孵育或者不加熱，應(yīng)用與實(shí)施例2同樣的TR-FIA對(duì)SDF-1進(jìn)行測(cè)定。(預(yù)加熱在用緩沖液4稀釋血漿樣品前進(jìn)行)。結(jié)果如圖3b所示。55℃30分鐘的預(yù)加熱可增大平均約20％的熒光強(qiáng)度。
該結(jié)果提示血漿樣品的SDF-1中至少有一部分以多聚體形式存在，和/或以與可熱解離或分解等的結(jié)合因子結(jié)合的形式存在。也許在這樣的多聚體和/或結(jié)合狀態(tài)下，SDF-1表位與抗體的結(jié)合受到抑制。(實(shí)施例9血漿樣品稀釋的影響)有關(guān)測(cè)定血漿樣品中IL-8和MCP-1的以往的研究(Thavasu等(文獻(xiàn)15)和Kajikawa等(文獻(xiàn)16))表明過低評(píng)價(jià)了非稀釋樣品的測(cè)定中趨化因子的存在量。所以，研究了血漿樣品的稀釋對(duì)應(yīng)用TR-FIA測(cè)定SDF-1的影響。
用緩沖液4將5份不同個(gè)體的血漿樣品稀釋到1∶1～1∶20的各種比例，應(yīng)用與實(shí)施例2同樣的TR-FIA測(cè)定SDF-1。結(jié)果如圖3c所示。當(dāng)稀釋倍數(shù)由1倍增加到10倍時(shí)，可以看到幾乎一致性的檢測(cè)靈敏度的提高。另一方面，當(dāng)稀釋倍率在10～20倍時(shí)，檢測(cè)靈敏度未增加。因此10倍稀釋(即1份血漿樣品用10份緩沖液4稀釋)可被評(píng)價(jià)為最有效的條件。(實(shí)施例10血漿樣品中添加血細(xì)胞時(shí)的影響)據(jù)報(bào)道，向全血中添加IL-8和MCP-1，這些趨化因子可被血細(xì)胞吸附(Amara等(文獻(xiàn)14)，Darbonne等(文獻(xiàn)17)和Neote等(文獻(xiàn)18))。于是，研究了是否能觀察到血細(xì)胞對(duì)SDF-1有同樣的吸收。
將250μl全血在微量離心機(jī)上離心，使細(xì)胞沉淀，取125μl上清組分的血漿。按預(yù)先設(shè)定的終濃度向125μl血漿中添加IL-8、MCP-1或SDF-1。然后將添加了這些趨化因子的血漿與125μl體積的細(xì)胞沉積物或125μl血漿混合，然后37℃孵育15分鐘。接著，將混合了細(xì)胞沉積物的樣品離心使細(xì)胞沉淀并分離。用ELISA對(duì)樣品中的可溶性IL-8和MCP-1進(jìn)行定量，用TR-FIA對(duì)其中的SDF-1進(jìn)行定量。結(jié)果如圖4a～圖4c所示。
IL-8和MCP-1添加量的大部分被血細(xì)胞吸收(圖4a和4b)。而與血細(xì)胞孵育后SDF-1的減少量低于10％(圖4c)。此外，在其它實(shí)驗(yàn)中，將SDF-1直接添加到全血，孵育后分離血細(xì)胞，用TR-FIA進(jìn)行定量時(shí)，與將SDF-1添加到血漿中的對(duì)照間沒有顯著性差異(數(shù)據(jù)未給出)。由以上可以確定SDF-1幾乎不被血細(xì)胞吸收。(實(shí)施例11血漿樣品的TR-FIA多次測(cè)定)對(duì)36份不同個(gè)體的血漿樣品進(jìn)行55℃30分鐘的預(yù)加熱(參照實(shí)施例7)后，用與實(shí)施例2相同的TR-FIA測(cè)定SDF-1。結(jié)果如圖5c所示。人血漿中的SDF-1水平的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85±0.26ng/ml。
在相同條件下，在不同日子對(duì)同一個(gè)體(3名)來源的血漿樣品重復(fù)測(cè)定4次，測(cè)定值的變動(dòng)為10～20％的范圍。這表明TR-FIA對(duì)血漿SDF-1測(cè)定的可信度十分高。(實(shí)施例12血漿樣品中SDF-1和IgG的會(huì)合)據(jù)報(bào)道，與IL-8和MCP-1相關(guān)的，妨礙血漿樣品的免疫檢測(cè)的其它主要原因是與循環(huán)系統(tǒng)中的自身抗體結(jié)合或會(huì)合的可能性(Leonard等(文獻(xiàn)1)和Thavasu等(文獻(xiàn)15))。如下所述對(duì)SDF-1與血漿中IgG的會(huì)合進(jìn)行評(píng)價(jià)。
將7個(gè)個(gè)體來源的血漿樣品不加熱或加熱處理(55℃30分鐘)后，與Protein G-Sepharose一起在冰上放置30分鐘，耗竭IgG。將樣品離心，取其上清組分。應(yīng)用TR-FIA測(cè)定該上清中的SDF-1。與Protein G-Sepharose處理前的血漿樣品的測(cè)定值進(jìn)行對(duì)比，求出熒光強(qiáng)度的減少度。結(jié)果如圖6所示。
圖6中斜線柱和黑柱分別表示非加熱樣品和加熱處理的樣品?？梢钥闯?，與加熱樣品相比，未加熱樣品易受Protein G-Sepharose處理的影響。通過耗竭非加熱樣品的IgG，TR-FIA可測(cè)定的SDF-1水平減少23～37％(平均30％)。而加熱處理的樣品相對(duì)應(yīng)的減少度為6～22％(平均15％)。因此實(shí)施例8中顯示的預(yù)加熱的效果(圖3b)可以用以下的假說進(jìn)行解釋。即，血漿樣品中一部分SDF-1與IgG會(huì)合存在，通過加熱解離，轉(zhuǎn)變成TR-FIA可以測(cè)定的可溶性形式。
其它實(shí)驗(yàn)中，Protein G-Sepharose處理后，未觀察到加到血漿樣品中的標(biāo)準(zhǔn)SDF-1的顯著性減少(未列出數(shù)據(jù))。因此，否定了SDF-1自身被Protein G-Sepharose吸附的可能性，及血漿樣品中的抗SDF-1 IgG以外的抗體或蛋白質(zhì)被Protein G-Sepharose吸附，而SDF-1被它們吸附的可能性。
由以上結(jié)果可以理解用TR-FIA測(cè)定出的人血漿中SDF-1水平與血液中實(shí)際存在的生理性SDF-1的水平極其接近。(實(shí)施例13GM-CSF的TR-FIA)除應(yīng)用抗人GM-CSF單克隆抗體作捕捉抗體和應(yīng)用生物素化抗人GM-CSF單克隆抗體(按常規(guī)方法對(duì)上述PharMingen人抗體進(jìn)行生物素化)外，與實(shí)施例2同樣將GM-CSF標(biāo)準(zhǔn)溶液(50μl)供給固相熒光測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)GM-CSF的校正曲線。結(jié)果如圖7所示。再用與實(shí)施例5同樣的方法由健康日本人志愿者的血液制備血漿樣品，按實(shí)施例9所述，用緩沖液4稀釋，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣用TR-FIA測(cè)定GM-CSF。結(jié)果表明，對(duì)GM-CSF也可進(jìn)行高靈敏度的測(cè)定，并且得到了重現(xiàn)性良好的結(jié)果。(實(shí)施例14對(duì)IL-2的TR-FIA)除應(yīng)用抗人IL-2單克隆抗體作捕捉抗體和應(yīng)用生物素化抗人IL-2單克隆抗體(按常規(guī)方法使上述PharMingen人抗體生物素化)之外，與實(shí)施例2同樣，將IL-2的標(biāo)準(zhǔn)溶液(50μl)供給固相熒光測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)IL-2的校正曲線。結(jié)果如圖8所示。再用與實(shí)施例5同樣的方法由健康日本志愿者制備血漿樣品，按實(shí)施例9所述，用緩沖液4稀釋，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣通過TR-FIA測(cè)定IL-2。結(jié)果表明，對(duì)IL-2也可以進(jìn)行高靈敏度的測(cè)定，并且可以得到重現(xiàn)性良好的結(jié)果。
產(chǎn)業(yè)上的實(shí)用性本發(fā)明提供能極其靈敏且簡(jiǎn)便地檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子，尤其是包括SDF-1的趨化因子的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR-FIA)方法，以及用于該方法的試劑盒。該方法及試劑盒適用于作為可溶性因子存在于血液循環(huán)中的，微量即具有生物學(xué)活性并與多種病理相關(guān)的細(xì)胞因子。
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1.檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR-FIA)方法，該方法包括在固相上形成依次結(jié)合了(a)具有固相結(jié)合部分和能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域的第一抗體，(b)該細(xì)胞因子，(c)具有能與該細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和生物素結(jié)合部分的第二抗體，(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物，以及(e)鑭系金屬離子的復(fù)合物的步驟；以及測(cè)定與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的熒光的步驟；這里，該熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X (I)-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R- (II)式中，R為能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數(shù)，X為氟原子或通式(II)表示的基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述鑭系金屬離子為銪。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(III)表示；-R-Ar-(C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1)2(III)式中，R、Ar及n與權(quán)利要求1中的定義相同。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述熒光結(jié)構(gòu)部分為4，4′-二(1″，1″，1″，2″2″3″3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺?；?鄰-三苯基。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述結(jié)合物中，相對(duì)于每1分子的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，存在10～60單位上述熒光結(jié)構(gòu)部分。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述測(cè)定熒光的步驟在不解離在上述固相上形成的復(fù)合物情況下進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述測(cè)定熒光的步驟在解離上述固相上形成的復(fù)合物后進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述細(xì)胞因子為屬于趨化因子家族的細(xì)胞因子。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，上述細(xì)胞因子為CXC趨化因子。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中，上述細(xì)胞因子為基質(zhì)細(xì)胞來源的因子-1(SDF-1)。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述體液樣品為血漿或全血。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括在上述形成復(fù)合物的步驟之前，用樣品稀釋緩沖液稀釋上述體液樣品的步驟；該樣品稀釋緩沖液是含有0.1～0.3％牛血清白蛋白，0.05～0.2％疊氮鈉，以及0.5～1.5％的氯化鈉的pH7.3～8.3的0.01～0.1M Tris-HCl。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括在上述形成復(fù)合物的步驟之前，在上述細(xì)胞因子的非變性溫度條件下加熱處理上述體液樣品的步驟。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括在上述測(cè)定熒光的步驟之前，用洗滌緩沖液洗滌在上述固相上形成的復(fù)合物的步驟；該復(fù)合物洗滌緩沖液是含有0.01～0.1％的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯的pH 8.5～9.5的0.01～0.1M Tris-HCl。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述固相為具有50～200ng/cm2IgG吸附能力的微量滴度板。
16.用于檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR-FIA)方法的試劑盒，該試劑盒包括具有固相結(jié)合部分和能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域的第一抗體，具有能與該細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和生物素結(jié)合部分的第二抗體，具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物，以及鑭系金屬離子；這里，該熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X(I)-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R-(II)式中，R為能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數(shù)，X為氟原子或通式(II)表示的基團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明提供高靈敏度檢測(cè)體液樣品中細(xì)胞因子的方法。該方法是時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TR－FIA)方法，包括捕捉細(xì)胞因子，在固相上形成含有與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的復(fù)合物的步驟，以及測(cè)定熒光結(jié)構(gòu)部分的熒光的步驟。該復(fù)合物由依次結(jié)合(a)具有固相結(jié)合部分和能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域的第一抗體，(b)細(xì)胞因子，(c)具有能與細(xì)胞因子結(jié)合的區(qū)域和生物素結(jié)合部分的第二抗體，(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡(luò)合的熒光結(jié)構(gòu)部分的結(jié)合物，以及(e)鑭系金屬離子而形成。熒光結(jié)構(gòu)部分可用通式(I)表示。
文檔編號(hào)G01N33/58GK1402834SQ00816405
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月29日
發(fā)明者田代啟, 本庶佑, 池川雅哉, 松本和子 申請(qǐng)人:科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán)