專利名稱：用于生物聚合物陣列成象和分析的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、分子診斷學(xué)和激光光學(xué)等領(lǐng)域。更具體地說涉及一種利用全內(nèi)反射熒光的方法，在二維陣列上對熒光標記的生物聚合物分子進行平行測定和分析的方法，以及一種熒光檢測裝置。
在二維結(jié)構(gòu)固體透明支持體(玻片)上的預(yù)制的短生物聚合物(核酸，縮氨酸等)的化學(xué)健結(jié)合過程中，所述的陣列結(jié)構(gòu)可用于診斷目的，例如，當將樣靶核酸加(雜化)到固定的核苷酸聚合物中時。靶樣品在雜化之前用熒光團進行標記，但是標記的結(jié)合在掃描前迅速發(fā)生。至于核酸陣列的分析和成象，可使用基于不同物理原理的裝置，主要涉及兩類一是檢測器，二是基于同焦顯微鏡的掃描儀。
與本發(fā)明所描述的裝置最密切的類型，基于全內(nèi)反射的熒光檢測器，是基于由Vysis公司(Downers Grove,IL,USA)制造的、稱為GenoSensorTM的CCD攝像機裝置。
基于CCD攝像機的裝置GenoSensorTM功能如下。通過光透射DNA陣列(

圖1)引起的激發(fā)，檢測與結(jié)合在玻片支持體上的DNA探針雜化的熒光標記的靶分子。光由氙燈產(chǎn)生，并通過濾光鏡選擇必要的光譜帶。由熒光團發(fā)出的光通過發(fā)射濾光片并經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)的引導(dǎo)，到達高分辨率的冷卻的CCD攝像機上。所得信號在計算機內(nèi)進行處理。
核酸陣列是與固體透明支持體結(jié)合的高密度、二維結(jié)構(gòu)的核酸分子。由于較低的靈敏度、選擇性(由于用于激發(fā)的譜帶必須從整個光譜中過濾出來，因此使用透射光進行熒光團的激發(fā)效率低)和較低的檢測速度(掃描總是要耗時的)，陣列上進行生物反應(yīng)的結(jié)果評定存在問題。當存在整列引物延伸反應(yīng)(APEX)的情況下，在反應(yīng)中同時使用四種不同的的寡聚核苷酸或終止劑，每個攜帶不同熒光團，就需要能在四個光譜區(qū)域中運行的檢測器，進行核酸陣列成象。所述檢測器必須是能對每一個熒光團最大限度地激發(fā)和信號捕獲，并能得到綜合反應(yīng)結(jié)果的裝置。
作為上述提到問題的解決方案，本發(fā)明提出了一種包括全內(nèi)發(fā)射熒光(圖2)，進行生物聚合物陣列成象(類似于靶DNA的測序)的方法，以及能夠在四個不同的光譜帶內(nèi)迅速并精確地評估核酸陣列上的反應(yīng)結(jié)果的熒光檢測器裝置。
本發(fā)明的目的在于，提供一種用于分析生物聚合物陣列或“芯片”上進行的生物反應(yīng)的裝置和方法。核酸陣列主要用在兩個方面。首先，在僅基于雜化分析的情況下，待分析的熒光標記靶將與固定在陣列上的遺傳物質(zhì)雜化。在擴增過程中將標記結(jié)合。由于雙鏈核酸中的氮基間形成氫鍵的能量受到限制，該基于雜化反應(yīng)機理的類型就不特別具有選擇性，也不能清楚地分辨信號和噪音。
另一個可能在于固定的寡聚核苷酸探針和靶核酸的雜化中添加酶反應(yīng)。例子是聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)(polymerase-mediated extension)，在此每個固定的寡聚核苷酸變成加長了一個熒光標記核苷酸。DNA聚合酶增加了一個有關(guān)靶DNA的遺傳信息的核苷酸。
陣列的DNA擴展反應(yīng)用熒光團標記的二脫氧核苷酸作為DNA聚合酶的基質(zhì)。同時使用四種不同標記的二脫氧核苷酸，但僅有一種與探針結(jié)合，其對應(yīng)于靶核酸的初級結(jié)構(gòu)。
所述酶機理方法優(yōu)于僅基于雜化的反應(yīng)之處在于1．如果固定探針和靶之間的雜化不好，則聚合酶既不識別結(jié)構(gòu)也不進行反應(yīng)。
2．如果雜化很好，酶在探針上與二脫氧核苷酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。這能使陣列在反應(yīng)后得以洗滌，以除去非特定結(jié)合的生物物質(zhì)。因此做到實質(zhì)性地提高信噪比，使系統(tǒng)能夠檢測雜合突變。
本發(fā)明所描述的方法用于生物聚合物陣列分析。一束已知波長的光(激光)以一定的角度射入支持體(玻片)的邊緣，該角度將引起光束的全內(nèi)反射。該支持體成為波導(dǎo)(圖2)。一部分光不會從玻片的內(nèi)表面反射，但是將作為容易消散的波從玻片中穿出。其強度將呈指數(shù)下降，但在1/4波長的距離上保持足夠強度。該距離足以激發(fā)與玻片緊接的探針中所含的熒光團。由于在聚合酶延伸的情況下有四種不同的核苷酸/標記，使用四種不同波長的激光束來達到最大限度地激發(fā)熒光標記。發(fā)射的光將通過各自的發(fā)射濾光鏡聚集以去除背景光，并通過光學(xué)系統(tǒng)(物鏡)聚焦進入CCD攝像機。由于使用的攝像機已冷卻，所以成象時間短，對于每個核苷酸/熒光通道約需10秒種。
本發(fā)明將依照附圖進行描述，在此圖1是通過橫向光對位于生物聚合物陣列表面上熒光團進行激發(fā)；圖2是根據(jù)本發(fā)明的方法通過全內(nèi)反射熒光進行所述激發(fā)；圖3是本發(fā)明方法的應(yīng)用，在此引起全內(nèi)反射的激光束通過柱面透鏡聚焦，這樣其直徑小于支持體的厚度；圖4是本發(fā)明方法的應(yīng)用，在此使用棱鏡將激光束引導(dǎo)進入支持體。在棱鏡和支持體之間存在透明液體，其折射率與棱鏡和支持體的折射率接近。
圖5是本發(fā)明裝置，熒光檢測器的主要設(shè)計圖。
圖2到圖4表示本發(fā)明用于生物聚合物陣列成象的方法。熒光標記的生物聚合物分子固定到帶有平行壁(1)的薄支持體上。為了最大限度地激發(fā)熒光分子，使用激光束(2)。該激光通過一個呈扇形的比邊緣(1)薄的柱面鏡(3)聚焦，在此光束以使支持體變?yōu)槿珒?nèi)反射的波導(dǎo)的角度入射到邊緣(1)上。
由激光束得到的熒光光學(xué)地進入光敏元件，該光敏元件可提供固定在支持體(1)上的熒光分子的圖象。通過由上面所述原理獲得的熒光投影到光敏元件上，該光敏元件能夠獲得如圖5所示的固定在支持體(1)上并由激光束激發(fā)的熒光分子的圖象。激光束通過側(cè)表面射向支持體。使用數(shù)字控制的CCD攝像機作為光敏元件。激光束通過透明平板或六面體(4)散射，同時用光楔調(diào)整。這些元件的組合修正來自反射鏡(6)的激光進入支持體(1)的角度。
如圖4所示，使用棱鏡(8)將光束通過邊緣表面導(dǎo)入支持體(1)。為減少光從棱鏡(8)進入支持體(1)的轉(zhuǎn)換過程中的反射損失，而使用透明液體(9)，例如在顯微鏡中使用的浸油，其折射率與棱鏡(8)和支持體(1)的折射率接近。
盡管本發(fā)明結(jié)合具體的優(yōu)選實施例進行了描述，可以理解的是本發(fā)明不限于所描述的主題，而相反的是，本發(fā)明還要包括包含所加專利權(quán)利要求書精神和范圍的各種改進和等效的裝置。
權(quán)利要求
1．一種生物高分子陣列成象和分析方法，特征在于一定波長的光束以在支持體內(nèi)引起全內(nèi)反射的角度射入陣列支持體，該支持體成為波導(dǎo)，并且一部分光作為漸消散的波穿過支持體的表面，并激發(fā)迅速設(shè)置到表面的與分子結(jié)合的熒光團。
2．如權(quán)利要求1的所述的方法，特征在于所述光束為激光束。
3．為權(quán)利要求1和2所述方法提供的熒光檢測器，包括數(shù)控CCD攝像機(7)，帶通濾光鏡和散射柱面鏡(3)，以增寬照明區(qū)域。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光檢測器，特征在于生物高分子陣列支持體中的區(qū)域的增寬，通過激光束的掃描移動完成，其中所述的掃描通過透明平板或六面體(4)完成，旋轉(zhuǎn)該平板或六面體可改變激光束進入支持體(1)的入射角度。
5．根據(jù)權(quán)利要求3或4的熒光檢測器，特征在于使用調(diào)整元件來獲得支持體(1)上較均勻的光分布。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光檢測器，特征在于調(diào)整元件是一個能圍繞它的軸旋轉(zhuǎn)的光楔(5)，其中光楔的軸位于激光束的光軸附近。
7．根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一個的熒光檢測器，特征在于為得到支持體較均勻的激光束分布，支持體(1)的激光束入射邊緣或側(cè)表面是磨砂的，以得到光的色散。
8．根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一個的熒光檢測器，特征在于為得到支持體上較高強度的激光束，支持體(1)的激光束入射邊緣或側(cè)表面是拋光的。
9．根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一個的熒光檢測器，特征在于使用位于支持體(1)上的衍射光柵，使得激光束射入支持體(1)。
10．根據(jù)權(quán)利要求3至9中任一個的熒光檢測器，特征在于使用光學(xué)棱鏡(8)使激光束經(jīng)過支持體(1)的側(cè)表面導(dǎo)入支持體。
11．根據(jù)權(quán)利要求3至10中任一個的熒光檢測器，特征在于在支持體(1)和棱鏡(8)之間放置透明液體(9)，例如浸油，其反射率與棱鏡(8)和支持體(1)的反射率接近。
全文摘要
使用全內(nèi)反射熒光進行生物聚合物陣列成象。光束(2)以一定角度導(dǎo)入固體支持體(1),在固體支持體內(nèi)引起全內(nèi)反射。一部分光從內(nèi)玻片表面不反射,而以漸消散的波從玻片中穿出。它將激發(fā)與支持體表面結(jié)合的生物聚合物分子結(jié)合的熒光團。這樣引起的熒光導(dǎo)入光敏元件(7),提供位于支持體表面上的熒光分子的數(shù)據(jù)。所述熒光信號的檢測迅速,每個熒光通道約需10秒。
文檔編號G01N21/64GK1302375SQ00800623
公開日2001年7月4日 申請日期2000年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月21日
發(fā)明者A·梅茨帕盧, J·貝里克, A·庫爾格 申請人:阿斯帕公司