一種超聲駐波式微流控芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種超聲駐波式微流控芯片及其制備方法，該芯片通過芯片通道中的PLGA?PEI微球或PLGA短納米纖維線在超聲駐波中對粒子或細(xì)胞進(jìn)行操縱、捕獲和分離。方法包括：(1)利用雙乳化法合成PLGA微球，再以聚乙烯亞胺對其進(jìn)行改性；(2)用靜電紡絲法制備PLGA納米纖維膜，再進(jìn)行均質(zhì)化處理得到短納米纖維線；(3)制作超聲駐波式微流控芯片。本發(fā)明能夠有效地控制粒子或細(xì)胞，制備過程簡易，成本低廉，具有很高的可控性和可操作性，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】
一種超聲駐波式微流控芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微流控技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種超聲駐波式微流控芯片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微流控技術(shù)(Microfluidics)是當(dāng)前世界上最前沿的科技技術(shù)之一。它是一個融化學(xué)、物理、生命科學(xué)、微電子學(xué)、材料、計算機(jī)等于一體的高度學(xué)科交叉技術(shù)，目前主要應(yīng)用在化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域。它是一種在微米尺度的通道內(nèi)對納升或皮升量級液體進(jìn)行操縱或控制的技術(shù)，從采樣、樣品預(yù)處理、反應(yīng)、分離富集到檢測的整個分析過程在集成的微芯片上完成，在極大減少樣品和試劑用量的同時，更極大地提高分析速度，實現(xiàn)分析系統(tǒng)的微型化、集成化和自動化，并且具有低成本、高通量、使用簡便、可多部件組合等優(yōu)點。而微流控技術(shù)需要借助微流控芯片來實現(xiàn)，微流控芯片(MicrofIuidie chip)又稱芯片實驗室(Lab-on-a-chip)，它是通過微加工技術(shù)，在娃、石英、玻璃、聚甲基丙稀酸甲酯(polymethylmethacrylate ,PMMA)、聚二甲基娃氧燒(polydimethylsiloxane，PDMS)等材料上，根據(jù)實際需求，制作出各種結(jié)構(gòu)的、尺寸在微米量級的管道進(jìn)行實驗。由于它具有極小的體積和微量操縱的功能，這就使得它不僅對樣品量的需求極少，而且具有很高的檢測靈敏度和分析速度，可以連續(xù)自動的進(jìn)行各項實驗，具有極為廣泛的適用性和應(yīng)用前景，是當(dāng)前微全分析系統(tǒng)研究的重點。
[0003]與此同時，由于微流控芯片的管道尺寸在微米量級和微納粒子非常匹配，又可以很好的操縱流體，而且還可以精確控制粒子在通道里的位置，非常有應(yīng)用于粒子操縱的潛力。目前對粒子的操縱，例如在流體介質(zhì)中實現(xiàn)粒子的迀移，聚集，運輸，分選，是微流控技術(shù)領(lǐng)域的一個重要的特征。由于聲學(xué)操作方法對活體生物樣本檢測的無損性，使得其與微流控技術(shù)的結(jié)合成為研究的另一個熱點。聲學(xué)微流控技術(shù)是指依靠壓電陶瓷片的驅(qū)動激發(fā)超聲駐波微流控裝置產(chǎn)生聲輻射力來實現(xiàn)對粒子的操縱，這種聲輻射力憑借粒子和流體介質(zhì)的性質(zhì)不同控制懸浮粒子移向波節(jié)或波腹。由于其對所有微粒的適用性，因此基于超聲駐波原理在微流控芯片中操縱粒子是一種比較理想的方式。CheolGi Kim等人(CheolGi，K.,et al.,Ultrasonic Manipulat1n of Magnetic Particles in a MicrofluidicChannel.1nternat1nal Journal of Precis1n Engineering and Manufacturing,2014.15(7):p.1411-1416)利用超聲駐波在微流控芯片中實現(xiàn)對磁性粒子以及活細(xì)胞的操縱。目前，在微流控系統(tǒng)中，一般通過濕法刻蝕方法，在硅片等硬質(zhì)材料上刻蝕出微網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，再通過陽極鍵和的方式，將玻璃片鍵和到刻蝕有微結(jié)構(gòu)的硅片上，以此來制作聲波芯片，這種方法加工的聲波芯片效果較好，但是，它需要用到價值數(shù)百萬的陽極鍵和設(shè)備，從而使得制備的芯片成本很高，不利于市場化。
[0004]聚乳酸-輕基乙酸共聚物(poly(lactic-co_glycolic acid)，PLGA)由兩種單體-乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域，在美國PLGA通過Π)Α認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典。各種PLGA藥物微球制備應(yīng)用多見報道，其中PLGA微球作為蛋白質(zhì)、酶類藥物的載體，是研究的熱點。但是在聲學(xué)微流控技術(shù)中還未發(fā)現(xiàn)基于超聲駐波原理操縱PLGA微球和PLGA納米纖維線的報道。
[0005]靜電紡絲技術(shù)因為其設(shè)備簡單，操作容易以及高效等特點，并且通過其制備的納米纖維比表面積高、均一性好以及纖維形貌可調(diào)可控等優(yōu)點，而成為近年來備受關(guān)注、應(yīng)用最多的制備納米纖維的方法。使用該方法可以制備出直徑1nm?ΙΟμπι的超細(xì)纖維，在催化劑載體、生物醫(yī)學(xué)、增強(qiáng)材料、過濾材料、電極材料、傳感器等方面都有很好的應(yīng)用。大量研究表明納米纖維易進(jìn)行表面修飾，并且可以負(fù)載生物活性分子，如蛋白質(zhì)、核酸、糖類及生長因子等。Mal 1uk，Thomas E等人(Mai 1uk，T.E.，et al., Steering AcousticallyPropelled Nanowire Motors toward Cells in a B1logical Iy CompatibleEnvironment Using Magnetic Fields.Langmuir，2013.29(52):p.16113-16118.)制備聲學(xué)性能的納米線在外加磁場和聲場的操控下靶向HeLa細(xì)胞。尚未見在超聲駐波微流控芯片里操縱短而分散的納米纖維線的報道。
[0006]檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明:在聲學(xué)微流控技術(shù)中還未發(fā)現(xiàn)基于超聲駐波原理操縱PLGA微球和PLGA納米纖維線的報道。尚未見在超聲駐波微流控芯片里操縱短而分散的納米纖維線的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種超聲駐波式微流控芯片及其制備方法，該芯片能夠有效地控制粒子或細(xì)胞，制備過程簡易，成本低廉，具有很高的可控性和可操作性，應(yīng)用前景廣闊。
[0008]本發(fā)明的一種超聲駐波式微流控芯片，通過芯片通道中的PLGA-PEI微球或PLGA短納米纖維線在超聲駐波中對粒子或細(xì)胞進(jìn)行操縱、捕獲和分離。
[0009 ] 所述PLGA短納米纖維線的長度為1?30μπι。
[0010]本發(fā)明的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，包括如下步驟:
[0011](I)制備PLGA微球;然后將PLGA微球分散于水中，加入碳二亞胺EDC及N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合水溶液活化，再加入聚乙烯亞胺PEI水溶液，搖床振蕩反應(yīng)，離心洗滌，分散，得到PLGA-PEI微球;其中，PLGA微球與PEI質(zhì)量比為1:2-4;
[0012](2)以四氫呋喃和N，N_ 二甲基甲酰胺作為混合溶劑，配制PLGA紡絲液，通過靜電紡絲制備得到PLGA納米纖維膜，干燥;將片狀PLGA納米纖維膜浸沒于聚乙烯醇PVA溶液中，在冰水浴條件下進(jìn)行均質(zhì)化處理，得到納米纖維的分散液，離心洗滌，得到PLGA短納米纖維線；
[0013](3)制備微流控芯片，在芯片通道中注入PLGA-PEI微球或PLGA短納米纖維線，即得超聲駐波式微流控芯片。
[0014]所述步驟(I)中的PLGA微球與EDC、NHS的質(zhì)量比為100:40:24。
[0015]所述步驟(I)中的PLGA微球的制備方法包括:
[0016]I)將聚乳酸羥基乙酸共聚物PLGA溶于有機(jī)溶劑中得到油相，超純水作為水相，然后將油相和水相混合，在冰水浴中超聲處理20-30s，得到油包水W/0乳液;其中PLGA的分子量Mw為25000，PLGA的有機(jī)溶劑為二氯甲烷CH2Cl2，PLGA與超純水的質(zhì)量比為500:1，油相和水相的體積比為5-10:1 ；
[0017]2)將上述W/0乳液加入聚乙烯醇PVA水溶液中，冰水浴條件下進(jìn)行均質(zhì)化處理，得到水包油包水W/0/W乳液;其中PVA的分子量Mw為20000-30000，PVA溶液的質(zhì)量百分濃度為2%-5%，均質(zhì)化處理為均質(zhì)機(jī)剪切，轉(zhuǎn)速為6000rpm，時間為5-10min，W/0/W乳液三相體積比為 25-100:5-10:1;
[0018]3)將上述W/0/W乳液加入異丙醇水溶液中，35-40°C左右攪拌3-5h，離心洗滌，冷凍干燥，得到PLGA微球;其中W/0/W乳液和異丙醇水溶液的體積比為I: 40-80。
[0019]所述步驟(I)中的搖床振蕩反應(yīng)溫度為25-28°C，反應(yīng)時間為2-3d。
[0020]所述步驟(I)中的聚乙烯亞胺PEI的分子量為25000;PLGA的分子量為25000。
[0021]所述步驟(2)中的PLGA與混合溶劑的質(zhì)量體積比為lg:4mL;混合溶劑中四氫呋喃與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為3:1。
[0022]所述步驟(2)中的PLGA的分子量為81000。
[0023]所述步驟(2)中的靜電紡絲工藝參數(shù)為:電壓為15_20kV，接收距離為15cm，流速為
0.6mL/h，雙管噴頭，環(huán)境溫度為20-25°C，相對濕度為40-50%。
[0024]所述步驟(2)中的干燥為自然風(fēng)干，干燥時間為12-24h。
[0025]所述步驟(2)中的片狀PLGA納米纖維膜與聚乙烯醇PVA溶液的質(zhì)量體積比為50-1OOmg: 10-20mL。片狀PLGA納米纖維膜塊放入尺寸為5 X 2mm2IVA溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-5%。均質(zhì)化處理為均質(zhì)機(jī)剪切，轉(zhuǎn)速為15000rpm，時間為15_20min。
[0026]所述步驟(3)中的微流控芯片的制備方法為:以長方形毛細(xì)管作為芯片通道，用環(huán)氧樹脂膠固定在載玻片上;通過環(huán)氧樹脂膠把壓電陶瓷片粘接在長方形毛細(xì)管一側(cè);在長方形毛細(xì)管的兩側(cè)出口粘接聚乙烯管作為PLGA-PEI微球或PLGA短納米纖維線的懸浮液的輸入口和輸出口。
[0027]所述的長方形毛細(xì)管的尺寸為50mm X 0.2mm X 2mm。
[0028]所述的壓電陶瓷片的尺寸為15_X2mmX0.2mm，驅(qū)動壓電陶瓷片的波形發(fā)生器的電壓調(diào)節(jié)為20Vpp，頻率調(diào)節(jié)為4.6MHz。
[0029]所述的聚乙稀管內(nèi)徑為1mm，外徑為1.4mm。
[0030]本發(fā)明采用操作簡易的雙乳化法制備PLGA微球，驗證了PLGA這種材質(zhì)的聲學(xué)對比因子，并且對PLGA微球進(jìn)行功能化修飾，利用靜電吸附作用結(jié)合細(xì)胞，證明了經(jīng)過靜電吸附和超聲駐波處理對細(xì)胞活性沒有傷害，因此基于超聲駐波原理在微流控芯片中操縱粒子是一種比較理想的方式。
[0031]本發(fā)明中借助成膜的納米纖維均質(zhì)化處理成短而分散的納米纖維線，實現(xiàn)了其在超聲駐波微流控芯片中的操縱，由于超聲駐波可以操縱短而單分散的納米纖維線，未來再對其進(jìn)行功能化修飾，應(yīng)用于生物傳感及生物醫(yī)學(xué)。
[0032]本發(fā)明設(shè)計的超聲駐波芯片，制作過程簡易，成本低廉，具有很高的可控性和可操作性，集成化程度高，很容易實現(xiàn)對粒子及生物活體樣品操縱。
[0033]本發(fā)明中PLGA為鏈狀大分子，較難進(jìn)行修飾改性，而PEI分子具有較多的氨基與其表面的羧基反應(yīng)，再利用PEI的正電性，通過靜電吸附將細(xì)胞吸附在PLGA微球表面，成功操縱細(xì)胞與微球的復(fù)合物排列在通道中間。
[0034]本發(fā)明中成功制備短而分散的納米纖維線，實現(xiàn)其在超聲駐波微流控芯片中的排列，有望應(yīng)用于生物傳感及生物醫(yī)學(xué)方面。
[0035]有益效果
[0036](I)本發(fā)明制備的PLGA微球和PLGA納米纖維，材料具有良好的形貌、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；
[0037](2)本方法制備的PEI改性的PLGA微球吸附細(xì)胞效果好;并且PLGA微球和PLGA納米纖維材料具有靈敏的超聲駐波響應(yīng)特性，在微流控芯片中呈現(xiàn)較整齊的排列；
[0038](3)本發(fā)明的超聲駐波式微流控芯片，加工簡易，成本低廉，制作過程中不需要價格昂貴的陽極鍵合設(shè)備;超聲駐波場的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)可操控;芯片易清洗，反復(fù)使用不影響效率;利用本發(fā)明能夠很容易地實現(xiàn)對粒子及細(xì)胞等生物活體樣品的操縱、捕獲和分離;本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、藥物科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0039]圖1為實施例1中制備的PLGA微球的SEM圖(左)及直徑分布圖(右)；
[0040]圖2為實施例1中PEI和PE1-FI溶液的紫外-可見吸收光譜圖；
[0041 ]圖3為實施例1中的P E1-FI修飾后的功能化P LG A微球的熒光顯微鏡圖片；其中，(a)、(b)、(c)分別為熒光PLGA微球的熒光圖片、相差圖片以及熒光和相差疊加后的圖片；
[0042]圖4為實施例2中PLGA微球在超聲駐波刺激前隨機(jī)分布在通道中(a)，超聲駐波刺激后排列在通道中間(b);
[0043]圖5為實施例3中靜電吸附PLGA-PEI微球的細(xì)胞在超聲駐波刺激前隨機(jī)分布在通道中(a)，超聲駐波刺激后排列在通道中間(b);
[0044]圖6為實施例4中，經(jīng)過酒精處理的HeLa細(xì)胞的熒光顯微鏡圖(上)，經(jīng)過超聲駐波處理前，HeLa細(xì)胞和PLGA-PEI靜電吸附的結(jié)合物的熒光顯微鏡圖(中)，經(jīng)過超聲駐波處理后，HeLa細(xì)胞和PLGA-PEI靜電吸附結(jié)合物的熒光顯微鏡圖(下)；
[0045]圖7為實施例4中FCM測試結(jié)果，分別是經(jīng)過酒精處理、無超聲駐波處理和超聲駐波處理的HeLa細(xì)胞的熒光強(qiáng)度圖；
[0046]圖8為實施例5中制備的PLGA靜電紡納米纖維的SEM圖(左)及直徑分布圖(右)；
[0047]圖9為實施例6中PLGA納米纖維膜塊在不同溶劑中的親水性；
[0048]圖10為實施例6中制備的PLGA短納米纖維線的相差顯微鏡圖(左)及短納米纖維線長度分布圖(右)；
[0049]圖11為實施例7中PLGA納米纖維線在超聲駐波刺激前隨機(jī)分布在通道中(a)，超聲駐波刺激后排列在通道中間(b);
[0050]圖12為實施例2中超聲駐波微流控芯片的示意圖。
【具體實施方式】
[0051]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0052]實施例1
[0053]PLGA微球的制備及其功能化修飾的具體過程如下:
[0054](I)稱取10mg PLGA溶于2mLCH2Cl2中，200yL超純水作為內(nèi)水相，將有機(jī)相和內(nèi)水相兩相混合，冰水浴狀態(tài)下超聲處理30s，形成W/0乳液;將上述的W/0乳液轉(zhuǎn)入50mL 5%PVA水溶液中，冰水浴狀態(tài)下用均質(zhì)機(jī)處理(6000rpm，5min)，使液滴形成尺寸較為均一的W/0/W乳液;將得到的W/0/W乳液滴入80mL 2 %異丙醇水溶液中，39 °C水浴條件下，磁力攪拌4h后，離心(4000rpm，3min)，棄去上清液，離心殘留物用30mL超純水水洗，重復(fù)上述離心水洗操作三次以至上清液澄清無色，離心后將離心殘留物重新分散于30ml超純水中，-80°C冰箱冷凍3h后，置于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥處理3d，即得到PLGA微球。通過圖1可知，可以清晰地看到PLGA的表面光滑，成球性較好，尺寸分布較窄，具有良好的單分散性，平均直徑為3.46μπι。
[0055](2)稱取步驟(I)凍干的PLGA微球10mg溶于5mL超純水中制得微球溶液，在其中加入碳二亞胺EDC(40mg，0.2mmol)及N-羥基琥珀酰亞胺NHS(24mg，0.2mmol)混合水溶液，活化反應(yīng)2h，最后加入聚乙烯亞胺PEI聚合物水溶液(200mg，8 X 1^mmoI)，在25 °C條件下，搖床上振蕩反應(yīng)3d，得到基于聚乙稀亞胺改性的PLGA微球，再用30mL超純水離心(4000rpm，3min)洗滌3次，棄去上清液，離心殘留物分散在5mL水中備用。
[0056](3)稱取聚乙烯亞胺PEI (200mg，8.0 X 10—3mmol)，溶于5mL二甲亞砜DMSO中，再加入異硫氰酸熒光素(FI TC) (6.20mg，1.6 X I O^mmo I)避光反應(yīng)I d。然后把反應(yīng)好的混合液轉(zhuǎn)移至截留分子量為8000-14000的透析袋中，先用pH值為7.4的0.02M PBS緩沖液透析24h(3次，2L/次)，再在蒸餾水中透析24-48h(6次，2L/次)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，即獲得產(chǎn)品PE1-FI。在透析和凍干過程中都需要避光處理，通過紫外-可見吸收光譜圖可知，F(xiàn)I成功修飾到PEI表面(圖2)。
[0057](4)稱取步驟(I)凍干的PLGA微球10mg溶于5mL超純水中制得微球溶液中，加入碳二亞胺EDC(40mg，0.2mmol)及N-輕基琥I自酰亞胺NHS(24mg，0.2mmol)混合水溶液，反應(yīng)2h，再加入溶于5mL水中步驟(3)得到的產(chǎn)品200mg，室溫條件下，避光，搖床振蕩反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，對所得溶液進(jìn)行離心洗滌(4000rpm，3min)3次，棄去上清液，離心殘留物分散在5mL水中備用，通過PLGA-PE1-FI的熒光顯微鏡圖片證明PEI成功修飾在PLGA微球表面(圖3)。而且動態(tài)光散射儀測試結(jié)果顯示PLGA微球表面電勢-22.97 ± 1.03mV，PEI改性的PLGA微球PLGA-PEI的表面電勢為48.40 ± 0.35mV，進(jìn)一步證實了 PEI成功修飾在PLGA微球表面。
[0058]實施例2
[0059]超聲駐波式微流控芯片如圖12所示，具體步驟如下:
[0060](I)在76X 26mm2的載玻片上，用環(huán)氧樹脂膠固定長方形毛細(xì)管(長度為50mm，寬度為0.2mm，高度為2mm)，此長方形毛細(xì)管作為微流控芯片的通道；
[0061](2)在長方形毛細(xì)管的兩側(cè)出口，粘接內(nèi)徑為1_、外徑為1.4mm的聚乙烯管作為懸浮液的輸入口和輸出口；
[0062](3)最后在固定好的長方形毛細(xì)管一側(cè)，通過環(huán)氧樹脂膠粘接來固定壓電陶瓷片(15mmX2mmX0.2mm)，然后在壓電陶瓷片的正反面焊接導(dǎo)線作為電路連接導(dǎo)線。
[0063]取實施例1中(I)所得產(chǎn)品的水溶液(0.2mg/mL)2mL置于5mLEP管中作為儲液管，進(jìn)行試驗前，微流控芯片用2%BSA浸泡2h，搭建好超聲駐波微流控裝置平臺，首先測試壓電陶瓷兩端是否加上了電壓，調(diào)節(jié)信號發(fā)生器的輸出信號為電壓為20Vpp，頻率為ΙΟΚΗζ，標(biāo)準(zhǔn)是加上這個信號之后可以聽到蜂鳴聲，否則壓電陶瓷兩端就沒加上信號，這時就需要檢查接頭是否正確，信號發(fā)生器輸出通道和輸入通道選擇是否一致等。調(diào)試好之后，把信號發(fā)生器的輸出電信號調(diào)到電壓為20Vpp，頻率為4.6MHz。把作為懸浮液入口的聚乙烯管插入儲液管中，注射栗采用抽的模式，流速設(shè)定為30yL/min，當(dāng)微球流動速度穩(wěn)定時，打開計算機(jī)上的MetaVue圖像采集軟件，調(diào)出live實時圖像觀察界面，開啟波形發(fā)生器的輸出端按鈕，可以觀察到微球排列在通道中間(圖4)。
[0064]實施例3
[0065]取實施例1中(2)所得產(chǎn)品的PLGA-PEI水溶液500yL(lmg)，用無血清培養(yǎng)基稀釋到lmL(濃度為0.5mg/mL)，置于5mLEP管中，加入消化離心下來的無血清培養(yǎng)基懸浮的HeLa細(xì)胞(100萬)，總體積為2mL，37°C共培養(yǎng)30min，得到細(xì)胞與微球結(jié)合物的溶液。進(jìn)行試驗前，微流控芯片用2%BSA浸泡2h，搭建好超聲駐波微流控裝置平臺，首先測試壓電陶瓷兩端是否加上了電壓，調(diào)節(jié)信號發(fā)生器的輸出信號為電壓為20Vpp，頻率為ΙΟΚΗζ，標(biāo)準(zhǔn)是加上這個信號之后可以聽到蜂鳴聲，否則壓電陶瓷兩端就沒加上信號，這時就需要檢查接頭是否正確，信號發(fā)生器輸出通道和輸入通道選擇是否一致等。調(diào)試好之后，把信號發(fā)生器的輸出電信號調(diào)到電壓為20Vpp，頻率為4.6MHz。把作為懸浮液入口的聚乙烯管插入細(xì)胞與微球結(jié)合物的溶液儲液管中，注射栗采用抽的模式，流速設(shè)定為30yL/min，當(dāng)微球流動速度穩(wěn)定時，打開計算機(jī)上的MetaVue圖像采集軟件，調(diào)出live實時圖像觀察界面，開啟波形發(fā)生器的輸出端按鈕，可以觀察到結(jié)合了微球的細(xì)胞排列在通道中間(圖5)。
[0066]實施例4
[0067](I)消化處于對數(shù)期的HeLa細(xì)胞，收集離心，用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，取90萬，分成3份，每份30萬個細(xì)胞。其中兩份細(xì)胞懸浮液中加入0.5mg PLGA-PEI微球溶液，無血清培養(yǎng)基作為細(xì)胞與微球培養(yǎng)液，總體積ImL，37 0C共培養(yǎng)30min。
[0068](2)選擇步驟(I)中一份細(xì)胞和PLGA-PEI微球共培養(yǎng)的混合液通入超聲駐波微流控通道里，按照上述步驟搭建超聲駐波裝置，全程開啟超聲駐波信號(持續(xù)2min)，直到所有溶液通過此裝置，觀察到結(jié)合了微球的細(xì)胞排列在通道中間，最后在通道出口收集經(jīng)過超聲駐波處理的細(xì)胞。
[0069 ] (3)然后用70 %的酒精處理步驟(I)中剩余的一份細(xì)胞，處理時間為25min。最后同一時間用Calcein-AM(活細(xì)胞染料)分別染色這三份細(xì)胞，染料濃度為5μΜ，染色時間為1min。染色完畢后，加1mLPBS稀釋，離心洗滌多余的染料(100rpm，3min)，再重新分散在500yL PBS 中。
[0070](4)分別取出步驟(3)所得的產(chǎn)品1yL滴在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光效果(圖6)。結(jié)果顯示和酒精處理染色的死細(xì)胞相比，沒有經(jīng)過超聲駐波處理染色細(xì)胞和經(jīng)過超聲駐波處理染色的細(xì)胞呈現(xiàn)良好的活性。
[0071](5)為了進(jìn)一步確定經(jīng)過不同處理方式的細(xì)胞活性，把步驟(3)經(jīng)過三種不同方式處理的溶在500yL PBS中的細(xì)胞冰浴使細(xì)胞降低活力，用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度。結(jié)果分析，經(jīng)過酒精處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度很弱，沒有經(jīng)過超聲駐波處理的細(xì)胞和經(jīng)過超聲駐波處理的細(xì)胞具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度(圖7)，對比經(jīng)過酒精處理的死細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度很弱，而實驗組經(jīng)過超聲駐波處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度依然很強(qiáng)，因此證明了超聲駐波處理和靜電吸附的方式對細(xì)胞不會造成傷害。
[0072]實施例5
[0073]PLGA納米纖維的制備包括如下步驟:稱取1.0g的PLGA，將其溶于四氫呋喃(THF)和N-N-二甲基甲酰胺(DMF)混合液中(體積比為THF: DMF = 3:1)，在磁力攪拌作用下，直到PLGA全部溶解完畢，得到紡絲液濃度為25%(lg/4mL)。把紡絲液吸取到注射器內(nèi)，利用高壓靜電紡絲機(jī)進(jìn)行靜電紡絲，紡絲條件為:溫度25°C，濕度40-50 %，電壓20Kv ；接收距離15cm；液體流量0.8mL/h。其中接收板為干凈的錫箔紙。自然風(fēng)干12h。SEM結(jié)果顯示，獲得的納米纖維表面光滑，直徑均勻，纖維平均直徑為724nm(圖8)。
[0074]實施例6
[0075]取實施例5中所得的PLGA納米纖維膜剪成片狀的納米纖維膜塊(尺寸為5X 2mm2)，稱取10mg浸沒在12.5mL5%PVA水溶液中，對比漂浮在超純水表面的納米纖維膜塊，可以看出納米纖維膜塊完全浸沒在PVA水溶液里有較好的親水性(圖9)，所以選擇PVA作為乳化劑。冰水浴狀態(tài)下用均質(zhì)機(jī)(15000rpm，15min)進(jìn)行均質(zhì)化處理，得到纖維的分散液。再用30mL超純水離心洗滌(5000rpm，3min) 3次，棄去上清液，離心殘留物分散在5mL超純水中，最后再100rpm離心一次，取上清液，60 °C烘箱干燥備用。把干燥好的納米線稱取5mg溶于5mL超純水中(lmg/mL)，取1yL滴在載玻片上，在相差顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示纖維線分散性較好，長度主要分布在30μπι以內(nèi)，主要集中在17.73μπι左右(圖10)。
[0076]實施例7
[0077]取實施例6中所得的納米纖維線分散液(lmg/mL)2mL置于5mLEP管中作為儲液管，進(jìn)行試驗前，微流控芯片(同實施例2)用2%BSA浸泡2h，搭建好超聲駐波微流控裝置平臺，首先測試壓電陶瓷兩端是否加上了信號，調(diào)節(jié)信號發(fā)生器的輸出信號為電壓為20Vpp，頻率為ΙΟΚΗζ，標(biāo)準(zhǔn)是加上這個信號之后可以聽到蜂鳴聲，否則壓電陶瓷兩端就沒加上信號，這時就需要檢查接頭是否正確，信號發(fā)生器輸出通道和輸入通道選擇是否一致等。調(diào)試好之后，把信號發(fā)生器的輸出電信號調(diào)到電壓為20Vpp，頻率為4.6MHz。把作為懸浮液入口的聚乙烯管插入儲液管中，注射栗采用抽的模式，流速設(shè)定為30yL/min，當(dāng)微球流動速度穩(wěn)定時，打開計算機(jī)上的MetaVue圖像采集軟件，調(diào)出live實時圖像觀察界面，開啟波形發(fā)生器的輸出端按鈕，可以觀察到納米纖維線排列在通道中間(圖11)。
【主權(quán)項】
1.一種超聲駐波式微流控芯片，其特征在于:通過芯片通道中的PLGA-PEI微球或PLGA短納米纖維線在超聲駐波中對粒子或細(xì)胞進(jìn)行操縱、捕獲和分離。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲駐波式微流控芯片，其特征在于:所述PLGA短納米纖維線的長度為10?30μηι。3.—種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，包括如下步驟: (1)制備PLGA微球;然后將PLGA微球分散于水中，加入碳二亞胺EDC及N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合水溶液活化，再加入聚乙烯亞胺PEI水溶液，搖床振蕩反應(yīng)，離心洗滌，分散，得至IJPLGA-PEI微球;其中，PLGA微球與PEI質(zhì)量比為1:2-4; (2)以四氫呋喃和N，N-二甲基甲酰胺作為混合溶劑，配制PLGA紡絲液，通過靜電紡絲制備得到PLGA納米纖維膜，干燥;將片狀PLGA納米纖維膜浸沒于聚乙烯醇PVA溶液中，在冰水浴條件下進(jìn)行均質(zhì)化處理，得到納米纖維的分散液，離心洗滌，得到PLGA短納米纖維線； (3)制備微流控芯片，在芯片通道中注入PLGA-PEI微球或PLGA短納米纖維線，即得超聲駐波式微流控芯片。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟⑴中的PLGA微球與EDC、NHS的質(zhì)量比為100:40:24。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟⑴中的搖床振蕩反應(yīng)溫度為25-28 °C，反應(yīng)時間為2-3d。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟⑴中的PLGA的分子量為25000;聚乙烯亞胺PEI的分子量為25000。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的PLGA與混合溶劑的質(zhì)量體積比為I g: 4mL;混合溶劑中四氫呋喃與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為3:1。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的靜電紡絲工藝參數(shù)為:電壓為15-20kV，接收距離為15cm，流速為0.6mL/h，雙管噴頭，環(huán)境溫度為20-25 °C，相對濕度為40-50 %。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的片狀PLGA納米纖維膜與聚乙烯醇PVA溶液的質(zhì)量體積比為50-1 OOmg: 10-20mL。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種超聲駐波式微流控芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的微流控芯片的制備方法為:以長方形毛細(xì)管作為芯片通道，用環(huán)氧樹脂膠固定在載玻片上;通過環(huán)氧樹脂膠把壓電陶瓷片粘接在長方形毛細(xì)管一側(cè);在長方形毛細(xì)管的兩側(cè)出口粘接聚乙烯管作為PLGA-PEI微球或PLGA短納米纖維線的懸浮液的輸入口和輸出□ O
【文檔編號】B01L3/00GK106076444SQ201610420922
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月14日 公開號201610420922.7, CN 106076444 A, CN 106076444A, CN 201610420922, CN-A-106076444, CN106076444 A, CN106076444A, CN201610420922, CN201610420922.7
【發(fā)明人】朱曉玥, 尹迪, 魏延傳, 徐剛偉, 王夢媛, 史向陽
【申請人】東華大學(xué)