絨毛漿作為吸收體收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法及裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種絨毛漿作為吸收體收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法及裝置。所述方法包括如下步驟：(1)利用絨毛漿作為吸收體收集尿液；(2)將所述絨毛漿吸收的尿液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫，并進(jìn)行保存，即實(shí)現(xiàn)尿液中蛋白質(zhì)的收集和保存；所述保存的方式是將所述洗脫得到的洗脫液吸附于吸附膜上。所述洗脫的方法如下：1)將所述絨毛漿與洗脫液混合并攪拌得混合液；2)將所述混合液進(jìn)行抽濾，使所述混合液流經(jīng)所述吸附膜，則尿液中蛋白質(zhì)吸附于所述吸附膜上。本發(fā)明方法簡便易行，而且費(fèi)用低；它不需要任何的有機(jī)溶劑，利于環(huán)保，最重要的是蛋白質(zhì)是在完全干燥的狀態(tài)下保存，避免了蛋白質(zhì)的降解，可以在室溫下長期保存尿液蛋白質(zhì)。
【專利說明】
絨毛漿作為吸收體收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法及裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法和裝置，具體涉及一種絨毛漿作為吸收體收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]生物標(biāo)志物指的是與生理或病理生理過程相關(guān)的可監(jiān)測的變化，其本質(zhì)是變化。血漿作為機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，受穩(wěn)態(tài)機(jī)制調(diào)節(jié)各種理化成分保持相對恒定，即變化范圍小、容納生物標(biāo)志物少；而尿液作為機(jī)體的代謝廢物，包含更多反映機(jī)體變化的信息，即非常多的生物標(biāo)志物。此外，尿液樣本獲取無創(chuàng)，可以連續(xù)、大量收集，受酶解作用影響小。因此，同一個(gè)受試者可以重復(fù)多次取樣，從而方便的動(dòng)態(tài)監(jiān)測疾病的變化。尿蛋白質(zhì)組成相對血液更加簡單、背景低。尿蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)含量動(dòng)態(tài)范圍大致在106，在對血漿和尿液采用完全一樣的蛋白質(zhì)鑒定分析策略的情況下，尿液中可以鑒定到更多的蛋白質(zhì)。尿蛋白質(zhì)組中70%蛋白質(zhì)來自泌尿系統(tǒng)，另30%是由血漿經(jīng)腎小球?yàn)V過產(chǎn)生。因此尿蛋白質(zhì)不僅能夠直接反應(yīng)泌尿系統(tǒng)的生理和病理生理變化;還能夠反應(yīng)機(jī)體其它系統(tǒng)的疾病。綜上所述，尿液可能是比血液更好的挖掘生物標(biāo)志物的來源。
[0003]據(jù)Urinary Protein B1marker Database所收錄的信息，很多能夠反映不同病理生理狀態(tài)的尿液蛋白質(zhì)候選標(biāo)志物被報(bào)道，但在應(yīng)用于臨床以前需要對此進(jìn)行大規(guī)模的臨床驗(yàn)證。因此，尿液作為重要的生物樣本，如果能將其與臨床病歷在疾病的每個(gè)階段一同保存下來，那么在未來尋找生物標(biāo)志物的回顧性和前瞻性研究中，特別是在大規(guī)模臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，將起到不可估量的作用。
[0004]無自主排尿功能的群體，例如嬰幼兒及意識(shí)喪失昏迷的患者，在疾病診斷過程中不能給出準(zhǔn)確的主訴，從而使疾病的診斷更多的依賴于實(shí)驗(yàn)室檢查。而血液檢查屬于有創(chuàng)檢查，因此從尿液中尋找疾病標(biāo)志物為疾病的診斷提供有價(jià)值的線索，尤其是嬰幼兒。鑒于此，收集無自主排尿功能人尿液時(shí)存在一些困難，需要提供一種簡單地收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法及裝置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種能簡單地收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法和裝置，特別適用于無自主排尿功能的群體(嬰幼兒及意識(shí)喪失昏迷的患者等)的尿液中的蛋白質(zhì)，本發(fā)明方法能夠長期保存所收集的尿液中蛋白質(zhì)。
[0006]本發(fā)明所提供的收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟:
[0007](I)利用絨毛漿作為吸收體收集新鮮的尿液；
[0008](2)將所述絨毛漿吸收的尿液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫，并進(jìn)行保存，即實(shí)現(xiàn)尿液中蛋白質(zhì)的收集和保存。
[0009]上述的方法中，所述保存的方式是將所述洗脫得到的洗脫液吸附于吸附膜上，即將尿液中蛋白質(zhì)從絨毛漿中轉(zhuǎn)移至吸附膜上進(jìn)行保存。
[0010]上述的方法中，所述洗脫的方法如下:
[0011 ] I)將所述絨毛漿與洗脫液混合并攪拌得混合液；
[0012]2)將所述混合液進(jìn)行抽濾，使所述混合液流經(jīng)所述吸附膜，則尿液中蛋白質(zhì)吸附于所述吸附膜上。
[0013]上述的方法中，所述絨毛漿作為吸收體能夠快速有效的吸收尿液，并且不與尿液中的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)產(chǎn)生永久而牢固的結(jié)合，從而能夠?qū)⒛虻鞍踪|(zhì)從吸收體上洗脫下來。所述絨毛漿的材質(zhì)以及纖維長度和分布均不影響其吸收效果。
[0014]上述的方法中，所述洗脫液可為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，所述磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的濃度可為1Μ，ρΗ值可為6(通過添加氫氧化鈉調(diào)節(jié))，其具有一定酸堿度緩沖能力，可以調(diào)節(jié)尿液的PH值；
[0015]所述洗脫液的用量以能浸沒所述絨毛漿、且能使所述絨毛漿攪拌均勻即可。
[0016]上述的方法中，所述抽濾時(shí)，使所述混合液依次流經(jīng)隔離膜、所述吸附膜和濾紙；
[0017]所述隔離膜、所述吸附膜與所述濾紙依次疊加在一起。
[0018]上述的方法中，所述抽濾步驟在抽濾瓶中進(jìn)行，具體可在真空抽濾的作用下進(jìn)行，以加速混合液的濾過。
[0019]上述的方法中，所述隔離膜為PVDF膜；
[0020]所述隔離膜疊加的層數(shù)為I層；
[0021 ]所述隔離膜的孔徑為可為0.22μπι，以去除隔離一些顆粒雜質(zhì)；
[0022]所述隔離膜的作用是:在所述混合液順利通過時(shí)隔離膜不結(jié)合尿液蛋白質(zhì)，并且阻隔所述絨毛漿纖維及尿液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片與所述吸附膜結(jié)合接觸；
[0023]所述吸附膜為硝酸纖維素膜或活化的PVDF膜，所述活化指的是將PVDF膜在甲醇中浸泡幾秒；
[0024]所述吸附膜疊加的層數(shù)為I層；
[0025]所述吸附膜的孔徑為0.22?0.45μηι，具體可為0.22μηι ；
[0026]所述濾紙疊加的層數(shù)可為3?8層，如4?6層；
[0027]所述濾紙可選用中速濾紙。
[0028]所述隔離膜、所述吸附膜和所述濾紙依次進(jìn)行疊加時(shí)，首先用水浸潤，以防止氣泡的產(chǎn)生。
[0029]上述的方法中，所述方法還包括對吸附了尿液中蛋白質(zhì)的所述吸附膜進(jìn)行干燥的步驟，
[0030]所述干燥在不高于56°C的烘箱中進(jìn)行或?yàn)槭覝叵伦匀桓稍?，所述室溫指的?0?25。。。
[0031]本發(fā)明收集得到的吸附了尿液中蛋白質(zhì)的吸附膜進(jìn)行保存時(shí)，可將其與記錄有尿液樣本信息的標(biāo)簽紙放入獨(dú)立的真空密封袋中，于-80°C或室溫保存。
[0032]本發(fā)明還提供一種保存尿液中蛋白質(zhì)的裝置，它包括一抽濾瓶和與所述抽濾瓶配合的漏斗;所述漏斗的底部由下至上依次鋪設(shè)有濾紙、吸附膜和隔離膜。
[0033]上述的裝置中，所述濾紙的層數(shù)可為3?8層，具體可為4?6層；
[0034]所述吸附膜的層數(shù)為I層；
[0035]所述隔離膜的層數(shù)為I層；
[0036]所述隔離膜可為PVDF膜。
[0037]上述的裝置中，所述漏斗為布氏漏斗。
[0038]上述的裝置中，所述抽濾瓶與真空抽濾裝置相連接，可進(jìn)行真空抽濾，以加速混合液的通過。
[0039]本發(fā)明收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法，首先用絨毛漿作為吸收體收集新鮮的尿液，再通過抽濾裝置將吸收體吸收的尿液中蛋白質(zhì)洗脫下來，并吸附結(jié)合在吸附膜上，將膜干燥后，以真空、干燥的形式保存尿液蛋白質(zhì)。
[0040]本發(fā)明收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法及裝置，以真空、干燥的形式保存尿液蛋白質(zhì)。本發(fā)明方法簡便易行，而且費(fèi)用低;它不需要任何的有機(jī)溶劑，利于環(huán)保，最重要的是蛋白質(zhì)是在完全干燥的狀態(tài)下保存，避免了蛋白質(zhì)的降解，可以在室溫下長期保存尿液蛋白質(zhì)。
【附圖說明】
[0041]圖1為本發(fā)明保存尿液中蛋白質(zhì)的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0042]圖1中各標(biāo)記如下:
[0043 ] I真空抽濾瓶、2布氏漏斗、3橡膠塞、4細(xì)頸。
[0044]圖2為本發(fā)明收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法中尿液收集過程的示意圖。
[0045]圖3為本發(fā)明收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法中尿液蛋白質(zhì)保存到硝酸纖維素膜上過程的示意圖。
[0046]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中尿液中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析圖。
[0047]圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中尿液中蛋白質(zhì)豐度的變異系數(shù)的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0049]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0050]實(shí)施例1、收集尿液中蛋白質(zhì)的裝置
[0051]本發(fā)明提供的收集尿液中蛋白質(zhì)的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
[0052]本發(fā)明裝置包括一個(gè)真空抽濾瓶I和與該真空抽濾瓶I密封配合的布氏漏斗2，布氏漏斗2與真空抽濾瓶I之間通過橡膠塞3進(jìn)行密封配合。布氏漏斗2的底部(圖中未示出)上由下至上依次鋪設(shè)有濾紙、吸附膜和隔離膜，進(jìn)行鋪設(shè)之前，均先用水進(jìn)行潤濕，以防止產(chǎn)生氣泡。濾紙鋪設(shè)4?6層，為中速濾紙。吸附膜具體可為硝酸纖維素膜，鋪設(shè)一層，孔徑為0.22μπι，用于吸附尿液中蛋白質(zhì)。隔離膜具體可為PVDF膜，孔徑為0.22μπι，用于阻隔絨毛漿纖維及尿液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片與硝酸纖維素膜結(jié)合接觸，并且其不結(jié)合尿液蛋白質(zhì)。為了加速濾液通過，將真空抽濾瓶I的細(xì)頸4與真空抽濾裝置(圖中未示出)(如真空栗)相連接。
[0053]實(shí)施例2、收集和保存尿液中蛋白質(zhì)(絨毛漿作為吸收體收集尿液，硝酸纖維素膜保存尿蛋白質(zhì))
[0054]本實(shí)施例中尿液收集的過程示意圖如圖2所示。
[0055]本實(shí)施例中尿液蛋白質(zhì)保存到硝酸纖維素膜上的過程示意圖如圖3所示。
[0056]利用實(shí)施例1提供的裝置進(jìn)行尿液中蛋白質(zhì)的收集，具體步驟如下:
[0057]1、將30ml混合尿液傾倒在絨毛漿吸收體上，20°C下放置30min，將吸有尿液的部分剪下，取出絨毛漿置于潔凈燒杯中。
[0058]2、在燒杯中加入80ml洗脫液(1M磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液(pH6))完全浸沒絨毛漿，約80ml，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆颉?br>[0059]3、在布氏漏斗2上放置4張用純凈水浸潤的圓形濾紙(中速)，將用純凈水浸潤的硝酸纖維素膜置于圓形濾紙之上，將用純凈水潤濕的PVDF膜作為隔離膜置于硝酸纖維素膜之上，整個(gè)過程中避免氣泡的產(chǎn)生。
[0060]4、安裝好真空抽濾瓶I，倒入步驟2得到的混合物。
[0061]5、將真空抽濾瓶I和真空栗連接，通過調(diào)整真空壓力使液體依次穿過PVDF膜、硝酸纖維素膜和濾紙后逐滴滴下，隨著時(shí)間的累積，逐漸增大真空栗壓力，直至液體全部濾過后即可，總時(shí)間約為30分鐘左右。
[0062 ] 6、待液體濾過完畢，取下硝酸纖維素膜，20°C下自然干燥。
[0063]將結(jié)合尿蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜與尿夜樣本信息記錄紙(如:樣品編號(hào)、取尿時(shí)間、尿常規(guī)編號(hào)等等)放入獨(dú)立的真空封裝袋內(nèi)室溫保存。
[0064]本實(shí)施例硝酸纖維素膜上保存的尿液中蛋白質(zhì)的提取過程如下:
[0065]1、將吸附尿蛋白質(zhì)的硝酸纖維膜剪碎置于2mL離心管中，依次加入1.7mL丙酮，
0.2mL 0.5%碳酸氫銨水溶液。
[0066]2、將混合物室溫強(qiáng)烈振蕩20s，置于55°C干浴器60min，且每隔20min停止加熱強(qiáng)烈振蕩30s。
[0067]3、4°C輕搖2h，12 000r/min、18°C離心 15min，棄上清，室溫放置lOmin，晾干。
[0068]4、加入150yL裂解緩沖液(7M尿素、2M硫脲、40mM Tris、25mM二硫蘇糖醇)，吹打后超聲3min。
[0069]5、12 OOOr/mirulSO離心 15min，取上清。
[0070]6、Bradf ord法測蛋白質(zhì)濃度后，-80 V凍存?zhèn)溆谩?br>[0071 ]對比例1、丙酮沉淀法提取尿液中蛋白質(zhì)
[0072]丙酮沉淀尿蛋白質(zhì)方法參照文獻(xiàn)(Thongboonkerd V1Mcleish K ,Arthur J, etal.Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetoneprecipitat1n or ultracentrifugat1n.Kidney Int，2002，62(4): 1461-1470.)進(jìn)行，混合尿液(與實(shí)施例1中尿液相同)3500g/min、4°C離心30min，取上清12000g/min、4°C離心30min，取上清20ml加入60mL預(yù)冷的丙酮，-20 °C沉淀Ahc3Bradf ord法測蛋白質(zhì)濃度-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0073]實(shí)施例3、本發(fā)明實(shí)施例2保存的尿液中蛋白質(zhì)和對比例I提取的尿液中蛋白質(zhì)的分析
[0074]1、SDS_聚丙稀酰胺凝膠電泳分析
[0075]分離膠4%?12%，考馬斯亮藍(lán)染色。
[0076]分析結(jié)果:每個(gè)樣品取25yg尿蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析的結(jié)果如圖4所示，由圖4可以看出，本發(fā)明用絨毛漿作為吸收體收集尿液、硝酸纖維素膜保存尿液蛋白質(zhì)的方法，與用丙酮沉淀法所制備的蛋白質(zhì)樣品做對照組相比，涵蓋了絕大部分相同條帶、無明顯的蛋白質(zhì)降解，說明本發(fā)明方法具有很好的技術(shù)重復(fù)性。
[0077]2、尿蛋白質(zhì)酶切與LC-MS/MS分析
[0078]取10yg尿蛋白質(zhì)，按Wisniewski等(WisniewskiJR,Zougman A,Nagaraj N,etal.Universal sample preparat1n method for proteome analysis.Nat Methods ,2009,6(5):359-363.)方法酶切，酶切后肽段用Oasis小柱除鹽。除鹽后肽段溶于0.1%甲酸，色譜分離(Thermo EASY-nLC 1200):洗脫時(shí)間60min，色譜柱流速0.3yL/min，洗脫梯度為4%?28%流動(dòng)相B(0.1 %甲酸+ 79.9%乙腈+ 20%水)。反相柱洗脫下的多肽用(ThermoOrbitrap Fus1n Lumos)進(jìn)行質(zhì)譜掃描。每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。
[0079]數(shù)據(jù)分析:所有二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果用Mascot(PerkinsDN,Pappin DJC,Creasy DM,etal.Probaility-based protein identificat1n by searching sequence databasesusing mass spectrometry data.Electrophoresis ,1999,20(18):3551-3567.)(MatrixScience公司，版本2.4.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。所用數(shù)據(jù)庫為Swissprot_human database(數(shù)據(jù)截止至2013年5月3日)。檢索條件:胰酶酶切;允許最多2個(gè)漏切位點(diǎn)；固定修飾為半胱氨酸的脲基甲基化;母離子和子離子質(zhì)量精確度均為0.05Da。采用Progenesis (Nonl inear公司，版本4.1)軟件對蛋白進(jìn)行定量，方法參照文獻(xiàn)(Hauck S1Dietter J,Kramer R，etal.Deciphering membrane-associated molecular processes in target tissue ofautoimmune uveitis by label-free quantitative mass spectrometry.Mol CellProteomics,2010,9(10):2292-2306.)。選擇進(jìn)行定量的譜峰電荷數(shù)為+2、+3、+4;Mascot肽段評分(1ns sCOre)>30，假陽性率(FDR)〈1%;若蛋白只有一條肽段得到鑒定，即認(rèn)為該蛋白不具有定量信息。
[0080]質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)豐度的變異系數(shù)的分析結(jié)果:
[0081]本發(fā)明用絨毛漿作為吸收體收集尿液、硝酸纖維素膜結(jié)合尿液蛋白質(zhì)方法分別處理3個(gè)尿液樣品，共同鑒定到629個(gè)蛋白質(zhì)，其豐度CV值的均數(shù)是20.1%，且62.3%的蛋白質(zhì)豐度CV值〈20% ;用丙酮沉淀方法處理3個(gè)尿液樣品，共同鑒定到730個(gè)蛋白質(zhì)的豐度CV值的均數(shù)是22.2%，且56.6%的蛋白質(zhì)豐度CV值〈20%，如圖5所示。
[0082]上述分析結(jié)果顯示，本發(fā)明用絨毛漿作為吸收體收集尿液、硝酸纖維素膜保存尿蛋白質(zhì)的方法，相較廣泛應(yīng)用的丙酮沉淀直接從尿液中提取蛋白質(zhì)法，二者的技術(shù)重復(fù)性沒有實(shí)質(zhì)性差異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種收集和保存尿液中蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟: (1)利用絨毛漿作為吸收體收集尿液； (2)將所述絨毛漿吸收的尿液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫，并進(jìn)行保存，即實(shí)現(xiàn)尿液中蛋白質(zhì)的收集和保存。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述保存的方式是將所述洗脫得到的洗脫液吸附于吸附膜上。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述洗脫的方法如下: 1)將所述絨毛漿與洗脫液混合并攪拌得混合液； 2)將所述混合液進(jìn)行抽濾，使所述混合液流經(jīng)所述吸附膜，則尿液中蛋白質(zhì)吸附于所述吸附膜上。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述洗脫液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述抽濾時(shí)，使所述混合液依次流經(jīng)隔離膜、所述吸附膜和濾紙； 所述隔離膜、所述吸附膜與所述濾紙依次疊加在一起； 所述抽濾步驟在抽濾瓶中進(jìn)行。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述隔離膜為PVDF膜； 所述隔離膜疊加的層數(shù)為I層； 所述吸附膜為硝酸纖維素膜或活化的PVDF膜； 所述吸附膜疊加的層數(shù)為I層； 所述濾紙疊加的層數(shù)為3?8層。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述方法還包括對吸附了尿液中蛋白質(zhì)的所述吸附膜進(jìn)行干燥的步驟， 所述干燥在不高于56 °C的烘箱中進(jìn)行或?yàn)槭覝叵伦匀桓稍铩?.—種保存尿液中蛋白質(zhì)的裝置，它包括一抽濾瓶和與所述抽濾瓶配合的漏斗；其特征在于:所述漏斗的底部由下至上依次鋪設(shè)有濾紙、吸附膜和隔離膜。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于:所述濾紙的層數(shù)為3?8層； 所述吸附膜的層數(shù)為I層； 所述隔離膜的層數(shù)為I層； 所述漏斗為布氏漏斗； 所述抽濾瓶與真空抽濾裝置相連接。10.絨毛漿在吸收和保存尿液中蛋白質(zhì)作為吸收體中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】B01D61/00GK106000102SQ201610388290
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】高友鶴, 秦偉偉
【申請人】北京師范大學(xué)