一種新型大通道電泳微芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型大通道電泳微芯片，以PDMS為材質(zhì)，芯片中設(shè)置有直徑為0.8～1.2mm、總長為8～30cm的分離通道，分離通道兩端固定緩沖槽，分離通道內(nèi)固定有內(nèi)制冷毛細(xì)管，所述內(nèi)制冷毛細(xì)管兩端以中空纖維膜固定，在距離分離通道一端0.5～2cm處設(shè)置有與分離通道垂直的進(jìn)樣通道，在距離所述進(jìn)樣通道6～20cm處設(shè)置有轉(zhuǎn)移通道，所述轉(zhuǎn)移通道垂直于分離通道，材質(zhì)為PDMS或石英毛細(xì)管。芯片總長度為8～30cm，寬度為2～9cm，芯片厚度為0.2～0.7cm。本發(fā)明以WBE技術(shù)為基礎(chǔ)，通過微流控芯片的手段，開發(fā)了分離通道尺寸在毫米級(jí)的新型大通道電泳芯片。首次在微流控芯片電泳系統(tǒng)中引入內(nèi)制冷模塊，從而將載樣量提高至與WBE相當(dāng)?shù)乃剑瑫r(shí)解決了焦耳熱效應(yīng)過大的問題，并實(shí)現(xiàn)了大通道與轉(zhuǎn)移通道的零死體積連接，可全部通過電壓控制完成樣品的一維分析，二維轉(zhuǎn)移的全過程。
【專利說明】一種新型大通道電泳微芯片

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微流控芯片電泳分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種電泳微芯片。

【背景技術(shù)】
[0002]芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)或稱微全分析系統(tǒng)(MiniaturizedTotal AnalysisSystem, μ -TAS)是由Manz與Widmer在1990年首次提出的概念，并在此后的20余年中得到了不斷的創(chuàng)新和發(fā)展。通常微芯片電泳技術(shù)的核心是在50-100 μ m寬和10-20μπι深的通道內(nèi)進(jìn)行高速的毛細(xì)管電泳分離，具有分析速度快、效率高、成本低、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量化的優(yōu)勢，是當(dāng)今分析化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著當(dāng)今生物技術(shù)的研究逐步深入，常規(guī)的一維分析很難滿足復(fù)雜樣品對(duì)方法的峰容量的要求，因此芯片電泳一直在朝著多維聯(lián)用的方向發(fā)展，以期獲得更好的分析效果，同時(shí)兼顧快速、便捷的優(yōu)勢。但是由于傳統(tǒng)的毛細(xì)管微流控芯片電泳的分離管道的內(nèi)徑過小，導(dǎo)致其載樣量較低，這就限制了其在多維分析方面的應(yīng)用，使得微流控芯片的靈活性和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等優(yōu)勢不能得到足夠的彰顯。
[0003]焦耳熱是限制芯片電泳分析載樣量的關(guān)鍵因素。電泳過程中，通道內(nèi)的緩沖液在電場作用下產(chǎn)生電流，從而不可避免的出現(xiàn)焦耳熱蓄積，這就決定了不能簡單地通過擴(kuò)大通道內(nèi)徑來提高載樣量。雖然一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芯片通道內(nèi)可承受的電場強(qiáng)度可達(dá)傳統(tǒng)CE的5-10倍之高，但這都是以短通道、快速分離來實(shí)現(xiàn)的，縮短了焦耳熱蓄積時(shí)間，并不能從根本上解決熱量消除的問題。
[0004]大管電泳(WBE技術(shù))可以從根本上解決上述問題，大幅提高電泳分析的載樣量。本課題組的郭玉高使用類似于列管換熱器的思路，將內(nèi)制冷方法應(yīng)用在了電泳分離中，從而成功實(shí)現(xiàn)了電泳分析載樣量由nL到μ L級(jí)的變化。李優(yōu)鑫對(duì)WBE技術(shù)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn)，通過中空纖維膜進(jìn)行制冷管的固定，使其被位置保持在通道中心，從而保證散熱效果的均一性和穩(wěn)定性，極大地提高了 WBE技術(shù)的分離效率，并開發(fā)了 WBE在線酶反應(yīng)及收集系統(tǒng)、WBE-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)等，使WBE的理論不斷完善，是大通道電泳微流控芯片設(shè)計(jì)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種新型大通道電泳微芯片，克服現(xiàn)有技術(shù)中毛細(xì)管微流控芯片載樣量低的問題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]一種新型大通道電泳微芯片，以PDMS為材質(zhì)，芯片中設(shè)置有直徑為0.8?1.2mm、總長為8?30cm的分離通道，分離通道兩端固定緩沖槽，分離通道內(nèi)固定有內(nèi)制冷毛細(xì)管，所述內(nèi)制冷毛細(xì)管外徑為400-700μπι，兩端以中空纖維膜固定。在距離分離通道一端
0.5?2cm處設(shè)置有與分離通道垂直的進(jìn)樣通道，在距離所述進(jìn)樣通道6?20cm處設(shè)置有轉(zhuǎn)移通道。所述轉(zhuǎn)移通道垂直于分離通道，材質(zhì)為PDMS或石英毛細(xì)管，另一端為緩沖液槽。芯片總長度為8?30cm，寬度為2?15cm，芯片厚度為0.2?0.7cm。
[0008]大通道芯片電泳緩沖液中需添加0.3%?1% HEC或HPMC等添加劑以增加粘度，一般選擇添加0.6%的HEC。施加分離電壓前，預(yù)先逆向通入內(nèi)制冷水使體系溫度達(dá)到平衡，冷卻水溫度一般控制在10°C左右，流速3-15mL/min，根據(jù)實(shí)際室溫環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)。在三個(gè)緩沖液槽內(nèi)分別插入電極，并依據(jù)樣品性質(zhì)施加不同的電勢，樣品即受到電場力驅(qū)動(dòng)，在不同通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離以及轉(zhuǎn)移，并通過檢測器收集信號(hào)。
[0009]其中分離通道直徑最好為1mm，內(nèi)制冷管外徑最好為690 μ m。
[0010]所述轉(zhuǎn)移通道為多個(gè)平行設(shè)置。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明以WBE技術(shù)為基礎(chǔ)，通過微流控芯片的手段，開發(fā)了分離通道尺寸在毫米級(jí)的新型大通道電泳芯片。首次在微流控芯片電泳系統(tǒng)中弓I入內(nèi)制冷模塊，從而將載樣量提高至與WBE相當(dāng)?shù)乃?，電泳過程中通過逆向通入內(nèi)制冷水的方式，可以將焦耳熱即時(shí)原位地消除，解決了焦耳熱效應(yīng)過大的問題，并實(shí)現(xiàn)了大通道與轉(zhuǎn)移通道的零死體積連接，可全部通過電壓控制完成樣品的一維分析，二維轉(zhuǎn)移的全部過程。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明新型大通道電泳微芯片結(jié)構(gòu)示意圖；
[0013]圖2為大通道電泳微芯片進(jìn)樣量-峰寬關(guān)系圖；
[0014]圖3為電場強(qiáng)度-電流曲線；
[0015]圖4為以毛細(xì)管為二維通道的全組分轉(zhuǎn)移；
[0016]圖5為相異緩沖體系下的解離抑制轉(zhuǎn)移；
[0017]圖6為電進(jìn)樣結(jié)果圖(三次重復(fù))；
[0018]圖7為相近緩沖體系下的全組分轉(zhuǎn)移(259nm檢測)。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0020]本發(fā)明的新型大通道電泳微芯片以PDMS為材質(zhì)，采用模具成型法獲得。該大通道微芯片分離通道直徑為0.8?1.2mm，可以實(shí)現(xiàn)大量樣品的分離分析，載樣量高達(dá)SOOnl。大通道芯片分離通道總長為8?30cm，通道兩端固定緩沖槽，在距離一端0.5?2cm處設(shè)計(jì)與主分離通道垂直的進(jìn)樣通道，供“十字交叉電進(jìn)樣”或“壓力進(jìn)樣”使用。將燒去涂層的石英毛細(xì)管固定于芯片主分離通道內(nèi)部，作為內(nèi)制冷毛細(xì)管，兩端以中空纖維膜固定，以保證其位置在分離通道軸心。在與樣品運(yùn)行相反的方向流入冷卻水，冷卻水流入溫度控制在10°C，可保證運(yùn)行緩沖液內(nèi)部在場強(qiáng)達(dá)到300V/cm時(shí)U-1關(guān)系不偏離歐姆定律，為樣品的高效分離提供基礎(chǔ)。芯片總長度為8?30cm，寬度為2?15cm，芯片厚度為0.2?0.7cm。上述大通道芯片的通道直徑最好為1_，內(nèi)制冷管外徑最好為690 μ m。轉(zhuǎn)移毛細(xì)管一端與分離通道相連，另一端連接緩沖液槽。轉(zhuǎn)移通道可選取PDMS和石英毛細(xì)管兩種材質(zhì)，為滿足一維大通道實(shí)現(xiàn)一定程度的樣品分離，其位置設(shè)計(jì)于距離進(jìn)樣位置6?20cm的任意位置，并垂直于一維分離通道?？砂葱枰O(shè)計(jì)任意多個(gè)平行轉(zhuǎn)移通道，當(dāng)使用石英毛細(xì)管材質(zhì)時(shí)，轉(zhuǎn)移毛細(xì)管位置及接口在芯片制作時(shí)即確定，可靈活插拔，可根據(jù)不同分離需要隨時(shí)更換毛細(xì)管。如圖1所示，B與BW間為分離通道，直徑為Imm ；A為進(jìn)樣位點(diǎn)；A與S間、A與SW間均為進(jìn)樣通道，錯(cuò)開距離約為1mm，S與SW距離為1.1cm ;C與D間為轉(zhuǎn)移通道(六組平行)，且可根據(jù)需要插入轉(zhuǎn)移毛細(xì)管。當(dāng)選擇CD為轉(zhuǎn)移通道或以C點(diǎn)為檢測點(diǎn)時(shí)，A與C間距離為分析有效長度與BW間距離為分析總長。CE、CD等六個(gè)平行通道均為PDMS材質(zhì)的轉(zhuǎn)移通道，CE、CD間距離均為二維分析總長，其有效長度依每次實(shí)驗(yàn)所選擇的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)而定。內(nèi)制冷管貫穿于B與BW之間，并與外部冷卻系統(tǒng)相連。
[0021]本發(fā)明的新型大通道電泳微芯片的制作方法為:在一塊平整潔凈的玻璃板上，依照上述芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，固定0.8?1.2mm的鋼絲以及毛細(xì)管作為大通道芯片通道的陽模。并在玻璃板四周制作圍擋，以保證制成芯片具有一定的厚度。稱取Sylgardl84雙組份，并以重量比10:1的配比，將預(yù)聚物與固化劑充分混勻，靜置15min，待氣泡消散。將該混合物澆筑在固定有芯片模型的玻璃板上，于75°C烘箱中加熱40min。將基片連同模型同時(shí)翻面，在背面繼續(xù)涂覆Sylgardl84雙組份的10:1混合物,于75°C烘箱中繼續(xù)加熱至其完全老化(約Ih左右)。脫模，用蒸餾水測試、清洗，固定內(nèi)制冷管和緩沖液槽，完成含轉(zhuǎn)移通道的芯片制作。在緩沖槽所需位置開孔，并使用704硅橡膠固定緩沖液槽。將外徑為690μπι毛細(xì)管壁涂層燒去，使用中空纖維膜進(jìn)行兩端的固定，并以AB膠封堵，即完成大通道芯片的制作。
[0022]進(jìn)樣與分析:進(jìn)樣過程可靈活選擇I?2個(gè)進(jìn)樣通道，通過進(jìn)樣針壓力進(jìn)樣和電進(jìn)樣完成。一維運(yùn)行緩沖液中采用添加羥乙基纖維素(HEC)的方法增加粘滯阻力，有效抑制了樣品擴(kuò)散所致的區(qū)帶展寬和進(jìn)樣過程中樣品泄漏。冷卻水溫度一般控制在10°C左右，流速3-15mL/min，根據(jù)實(shí)際室溫環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0023]轉(zhuǎn)移:大通道芯片上的二維轉(zhuǎn)移通常選擇“三電極模式”，是指在大管分離通道一側(cè)設(shè)計(jì)垂直的轉(zhuǎn)移通道，在施加一維電壓的同時(shí)，在轉(zhuǎn)移通道槽一端提供電勢差，樣品即可部分的遷移至轉(zhuǎn)移通道中。在該二維分析系統(tǒng)中，不同通道內(nèi)可以維持相對(duì)獨(dú)立的緩沖體系，進(jìn)而可以依據(jù)不同物質(zhì)在不同體系內(nèi)解離性質(zhì)的差異，實(shí)現(xiàn)混合樣品的選擇性轉(zhuǎn)移。
[0024]試驗(yàn)例I
[0025]實(shí)驗(yàn)條件:緩沖液:10mM pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液(含0.6% HEC);樣品為:lmg/mL對(duì)甲苯磺酸；檢測波長為:259nm ;分離有效長度/總長=6.5cm/1Icm ;負(fù)極進(jìn)樣；分離電壓1000V,電流280 μ A.
[0026]表I大通道芯片最大載樣量測試數(shù)據(jù)
[0027]
序號(hào)進(jìn)樣量峰寬/min峰面積保留時(shí)間/min
/nl
11.081884046.58
21.471523006.33
34001.501562656.17
平均1.351656566.36
RSD17.12%11.95%3.3%
41.182113525.95
51.191791356.07
66001.272759756.05
平均1.212221546.02
RSD3.82%22.2%1.10%
71.283732676.03
81.322703595.68
98001.483554427,08
平均1,363330226.26
RSD7.90%16.51%11.66%
102.324405355.98
111.984023656.08
1210001.98.3400155.69
[0028]
平均2.093943055.92
RSD9.21%12.87%3.44%
[0029]以進(jìn)樣量和峰寬作圖，從圖2可以直觀的看出，當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到100nl時(shí)，峰展寬變得更加明顯。從數(shù)值上可以看出，進(jìn)樣100nl時(shí)，峰寬增大的數(shù)值超出了 10%的范圍。表I中，峰面積和保留時(shí)間的重復(fù)性均良好，證明了以上峰寬數(shù)據(jù)的可靠性。因此，對(duì)于有效長度/總長=6.5cm/1Icm的芯片來說，載樣量為800nl。
[0030]試驗(yàn)例2
[0031]實(shí)驗(yàn)條件:緩沖液:10mM pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液；冷卻水流速:15mL/min ；冷卻水溫度約為10°C。
[0032]如圖3所示，加入內(nèi)制冷水后，電場強(qiáng)度最高可以施加到300V/cm，而不引起明顯的熱蓄積。而無內(nèi)制冷水時(shí)，場強(qiáng)超過150V/cm后，即偏離線性關(guān)系。由此可見，通過與WBE類似的內(nèi)制冷方法，可以顯著削弱大通道芯片中的熱蓄積效應(yīng)。
[0033]試驗(yàn)例3
[0034]實(shí)驗(yàn)條件:一維緩沖液:10mM pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液；二維緩沖液:40mMpH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液；樣品為:lmg/mL苯甲酸、2mg/mL對(duì)甲苯磺酸混合液；負(fù)極進(jìn)樣；300V,90s ;三電極電壓:-1000V,0V,7600V ;一維有效長度 / 總長=6.5cm/10.5cm ;二維有效長度/總長=13.5cm/27.5cm ;檢測波長:214nm。
[0035]如圖4所示(其中I為對(duì)甲苯磺酸；2為苯甲酸)，首次將大通道微芯片電泳與毛細(xì)管電泳組成了二維聯(lián)用系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了零死體積連接，以及樣品的在線轉(zhuǎn)移。
[0036]試驗(yàn)例4
[0037]實(shí)驗(yàn)條件:一維緩沖液:10mM pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液；二維緩沖液:20mMpH2.5的tris-磷酸緩沖液；樣品為:lmg/mL苯甲酸、2mg/mL對(duì)甲苯磺酸混合液；負(fù)極進(jìn)樣；300V，90s ;三電極電壓:-1000V,0V,7600V ;一維有效長度 / 總長=6.5cm/10.5cm ;二維有效長度/總長=13.5cm/27.5cm ;檢測波長:214nm。
[0038]如圖5所示，結(jié)果表明:苯甲酸在解離抑制的條件下，出峰時(shí)間延長至原體系的約
1.5倍，并且分離度進(jìn)一步提高。受到遷移速率的影響，轉(zhuǎn)移量也有所減小，證明對(duì)于pKa差異較大的樣品，可以通過改變轉(zhuǎn)移體系的PH值進(jìn)行選擇性轉(zhuǎn)移。此外，該結(jié)果也證明了在二維連接的大通道芯片與毛細(xì)管體系中，各分離通道可以維持相對(duì)獨(dú)立的緩沖體系，從而實(shí)現(xiàn)樣品的選擇性轉(zhuǎn)移。
[0039]實(shí)施例1:
[0040]設(shè)計(jì)如圖1所示芯片,其中B與BW間距離為10.5cm,通道直徑為Imm ；A為進(jìn)樣位點(diǎn)；s與Sff距離為1.1cm ;A、S與A、SW間錯(cuò)開距離為Imm ;A與C間距離為6.5cm ;按照技術(shù)方案中步驟制作芯片。采用“雙T型”通道電進(jìn)樣方式，分析有機(jī)酸樣品:
[0041]實(shí)驗(yàn)條件:緩沖液:10mM pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液(含0.6% HEC);樣品為:lmg/mL苯甲酸、2mg/mL對(duì)甲苯磺酸混合液；有效長度/總長=6.5cm/10.5cm ;檢測波長為:259nm ;進(jìn)樣電壓300V ;進(jìn)樣電流300 μ A ;進(jìn)樣時(shí)間60s ;負(fù)極進(jìn)樣；分離電壓1000V ;電流220-240 μ A ;冷卻水溫度約10°C;冷卻水流速為15ml/min。結(jié)果如圖6，其中I為對(duì)甲苯磺酸；2為苯甲酸。
[0042]實(shí)施例2:
[0043]設(shè)計(jì)如圖1所示芯片,其中B與BW間距離為10.5cm,通道直徑為Imm ；A為進(jìn)樣位點(diǎn)；S與Sff距離為1.1cm ;A、S與A、SW間錯(cuò)開距離為Imm ;A與C間距離為6.5cm ;C、D間通道采用插入毛細(xì)管的方式，獲得通道有效長度/總長=13.5cm/27.5cm ;按照技術(shù)方案(c)中步驟制作芯片。采用“雙T型”通道電進(jìn)樣方式，以及三電極轉(zhuǎn)移模式，分析有機(jī)酸樣品:
[0044]實(shí)驗(yàn)條件:一維緩沖液:10mM pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液；二維緩沖液:40mMpH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液；樣品為:lmg/mL苯甲酸、2mg/mL對(duì)甲苯磺酸混合液；負(fù)極進(jìn)樣；300V,90s ;轉(zhuǎn)移電壓:B點(diǎn)為-1000V, Bff點(diǎn)為OV ；D點(diǎn)為7600V ;一維有效長度/總長=
6.5cm/10.5cm ;二維有效長度/總長=13.5cm/27.5cm ;檢測波長:259nm。結(jié)果如圖7，其中I為對(duì)甲苯磺酸；2為苯甲酸。
【權(quán)利要求】
1.一種新型大通道電泳微芯片，其特征在于，所述大通道電泳微芯片以PDMS為材質(zhì)，芯片中設(shè)置有直徑為0.8?1.2_、總長為8?30cm的分離通道，分離通道兩端固定緩沖槽，分離通道內(nèi)固定有內(nèi)制冷毛細(xì)管，所述內(nèi)制冷毛細(xì)管兩端以中空纖維膜固定，在距離分離通道一端0.5?2cm處設(shè)置有與分離通道垂直的進(jìn)樣通道，在距離所述進(jìn)樣通道6?20cm處設(shè)置有轉(zhuǎn)移通道，所述轉(zhuǎn)移通道垂直于分離通道，材質(zhì)為PDMS或石英毛細(xì)管，另一端為緩沖液槽；芯片總長度為8?30cm，寬度為2?15cm，芯片厚度為0.2?0.7cm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型大通道電泳微芯片，其特征在于，分離通道直徑為1_。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型大通道電泳微芯片，其特征在于，所述內(nèi)制冷毛細(xì)管外徑為 400-700 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述新型大通道電泳微芯片，其特征在于，所述內(nèi)制冷毛細(xì)管外徑為 690 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型大通道電泳微芯片，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移通道為多個(gè)平行設(shè)置。
6.一種權(quán)利要求1所述新型大通道電泳微芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，電泳緩沖液中需添加0.3%?1% HEC或HPMC添加劑以增加粘度，施加分離電壓前，預(yù)先逆向通入內(nèi)制冷水使體系溫度達(dá)到平衡。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述新型大通道電泳微芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，所述添加劑為 0.6%的 HEC。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述新型大通道電泳微芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，所述冷卻水溫度控制在10°C，流速3-15mL/min，根據(jù)實(shí)際室溫環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)。
【文檔編號(hào)】B01L3/00GK104148123SQ201410355409
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】李優(yōu)鑫, 包建民, 趙璐萌 申請(qǐng)人:天津大學(xué)