專利名稱：微型高效萊克多巴胺免疫親和純化富集柱制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物分離、純化富集裝置，尤其是一種微型高效萊克多巴胺免疫親和層析柱的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
萊克多巴胺均屬于β_興奮劑，可以提高瘦肉率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因其經(jīng)濟(jì)效益明顯，利益驅(qū)使養(yǎng)殖戶或養(yǎng)殖企業(yè)大量使用，導(dǎo)致畜產(chǎn)品中萊克多巴胺大量殘留，人食用這類畜產(chǎn)品后，可引發(fā)肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過(guò)敏、頭痛、目眩、惡心等中毒癥狀，特別是對(duì)血壓、心臟病患者危害更大，長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤。萊克多巴胺在許多國(guó)家，特別是歐盟和中國(guó)，被禁止用做家畜促生長(zhǎng)劑。所以，對(duì)動(dòng)物來(lái)源的食品中萊克多巴胺殘留進(jìn)行嚴(yán)格地檢測(cè)是非常重要。由于生物樣本成分復(fù)雜，待測(cè)物濃度低，大多數(shù)取樣量少，而我國(guó)明確規(guī)定禁止萊克多巴胺及其衍生物在動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程中使用。這就對(duì)分析方法的靈敏度、準(zhǔn)確度有更高的要求。采用免疫親和色譜柱提取樣品中萊克多巴胺，再與高效液相色譜法(HPLC-UV)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC-UV)、膠體金快速試紙條檢測(cè)法確證是必然的趨勢(shì)。但是，現(xiàn)有的提取萊克多巴胺免疫親和色譜柱的技術(shù)與工藝存在活化后填料不穩(wěn)定、非親和法提純的抗體特異性差、抗體和填料偶聯(lián)不穩(wěn)定，造成偶聯(lián)在填料上的抗體脫落、裝柱體積偏大(裝柱體積I毫升以上)，提取萊克多巴胺時(shí)造成洗脫體積大、富集效率低，減低了確證的準(zhǔn)確度和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、準(zhǔn)確純化富集萊克多巴胺的免疫親和純化富集柱及其制備方法和用途。本發(fā)明釆取的技術(shù)方案:
本發(fā)明的目的是提供一種高效、特異性分離純化、富集萊克多巴胺(Sal)的免疫親和純化富集柱制備方法及其應(yīng)用。為達(dá)上述目的，本發(fā)明2次采用抗原抗體的特異性反應(yīng)和可離解的特性Ag + Ab(固相) Ag-Ab (固相)原理，具體如下:
首先利用這一原理將萊克多巴胺乙酰酯偶聯(lián)到活化瓊脂糖(Agarose)上制得Sal -Agarose親和柱,用于提取萊克多巴胺特異性多克隆抗體。再利用這一原理將提取所得的抗萊克多巴胺特異性抗體(Ant1-Sal)偶聯(lián)到Agarose上制得Ant1-Sal- Agarose免疫親和柱,用于分離純化、富集待檢樣品中的萊克多巴胺。根據(jù)上述機(jī)理， 本發(fā)明采用如下具體技術(shù)步驟: 一種萊克多巴胺免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:
1)將經(jīng)免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體和過(guò)碘酸活化的瓊脂糖混勻，在搖床上室溫反應(yīng)30分鐘，然后在4°C冰箱靜置30分鐘后加入硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結(jié)合的抗體，用磷酸緩沖液清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干磷酸緩沖液后加入等體積甘油，混勻，得到萊克多巴胺免疫親和填料；
2)在特制的塑料柱內(nèi)下端裝上過(guò)濾膜，將萊克多巴胺免疫親和填料裝入柱中，25μ L/柱，填料上層蓋上過(guò)濾膜，即得所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱。所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱，包括偶聯(lián)有免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該填料的特制塑料柱。所述的免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體是用萊克多巴胺與溴乙酰氯反應(yīng)得到衍生物萊克多巴胺溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色譜HPLC純化該溶液，得到純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯，將純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與載體蛋白偶聯(lián)，得到該偶聯(lián)物作為免疫原免疫動(dòng)物，得到抗血清，同時(shí)用該純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與經(jīng)活化的瓊脂糖珠反應(yīng)制備純化抗體用的免疫親和柱，用該親和柱一步提取抗血清得到萊克多巴胺特異性多克隆抗體。所述的萊克多巴胺溴乙酰酯制備方法是將萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品在三乙胺催化下與溴乙酰氯反應(yīng)得到衍生物萊克多巴胺溴乙酰酯溶液。將此萊克多巴胺溴乙酰氯酯溶液用制備型高效液相色譜儀反向柱色譜分離純化出相對(duì)于萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品峰后移，且具有萊克多巴胺紫外光吸收光譜特征的單一主峰組分，收集該主峰組分得到純化的萊克多巴胺溴乙酰酯。所述的萊克多巴胺溴乙酰酯與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原，是用十二烷基硫酸鈉SDS變性牛血清蛋白BSA或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酸-羥基琥珀酰亞胺酯即NHS-碘乙酸反應(yīng)，再用二硫蘇糖醇DTT還原，得到巰基化的BSA或OVA ;通過(guò)葡聚糖凝膠G25 Sephadex脫鹽去掉多余的二硫蘇糖醇后，將萊克多巴胺溴乙酰酯與巰基化的BSA或OVA混合，調(diào)ρΗ=8.5，在室溫?fù)u動(dòng)反應(yīng)60分鐘，經(jīng)G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。所述的用純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與經(jīng)活化的瓊脂糖反應(yīng)制備純化抗體用的免疫親和柱，是將經(jīng)活化的瓊脂糖與賴氨酸反應(yīng)得到氨基花的瓊脂糖，再將氨基化的瓊脂糖與NHS-碘乙酸反應(yīng)后，再用DTT還原，得到巰基化的瓊脂糖，將巰基化的瓊脂糖和萊克多巴胺溴乙酰酯快速混勻，室溫反應(yīng)60分鐘，得到化學(xué)共價(jià)鍵復(fù)合體萊克多巴胺溴乙酰-瓊脂糖填料，將填料裝柱，洗去多余的DTT，得到提純?nèi)R克多巴胺特異性抗體用的免疫親和柱。所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱和萊克多巴胺膠體金試紙條聯(lián)用的技術(shù)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
I)本親和柱所用偶聯(lián)的抗體為經(jīng)過(guò)免疫親和一步法提純的，抗體特異性高；采用高密度、大容量將特異性抗體偶聯(lián)于活化的瓊脂糖填料，使得本發(fā)明親和柱抗體和填料結(jié)合穩(wěn)定，柱容量、回收率明顯優(yōu)于當(dāng)前同類產(chǎn)品，達(dá)到排除雜質(zhì)干擾、提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性。2)本親和柱裝載填料的微型化，填料裝柱體積僅需25 μ L/柱，能使洗脫體積縮小，非常明顯地提高檢測(cè)的靈敏度。3)本發(fā)明轉(zhuǎn)載填料的塑料柱為特制的，能達(dá)到靈活掌握上樣體積、提高過(guò)柱效率的效果。


圖1為經(jīng)制備型高效液相色譜分離純化的萊克多巴胺色譜圖，及主要衍生組分收集峰。圖2為萊克多巴胺多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的IC50圖。圖3為萊克多巴胺免疫親和純化富集柱和萊克多巴胺膠體金試紙條聯(lián)用效果圖，圖中的1、2為用膠體金試紙條測(cè)試萊克多巴胺豬陰性尿液；2、3為用膠體金試紙條檢測(cè)在萊克多巴胺陰性尿液中加入萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品使?jié)舛仁?.01ng/mL ;5、6為用膠體金試紙條檢測(cè)在萊克多巴胺陰性尿液中加入萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品使?jié)舛葹?.0lng/mL經(jīng)過(guò)萊克多巴胺免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液。
具體實(shí)施例方式提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1萊克多巴胺特異性多克隆抗體的制備。1.1萊克多巴胺溴乙酰脂的制備:
1.1.1取50 mg的萊克多巴胺溶于500 μ L的富馬酸二甲酯(DMF)溶液中，充分溶解冰凍10分鐘，再與40 μ 的溴乙酰氯搖勻冰凍2分鐘后加入25 μ 三乙胺搖勻，在60°C反應(yīng)30分鐘；加入500 μ 的50%甲醇。1.1.2離心，取上清用制備型高效液相色譜儀(C-18 HPLC)反向柱色譜分離純化。分別收集相對(duì)于萊克多巴胺 標(biāo)準(zhǔn)品峰后移的峰，且有萊克多巴胺紫外光(UV)吸收光譜特征的主要組分(大約20 mg)，凍干。1.1.3收集凍干后的衍生物立即用I mL甲醇復(fù)溶，用0.1 mo I/L Na2CO3調(diào)PH>8。1.2萊克多巴胺免疫原、配對(duì)檢測(cè)抗原制備 1.2.1萊克多巴胺免疫原
取 250 mg BSA,加入 5 mL 0.1 mol/L Na2C03、0.5 mL 10% 的 SDS 混勻后煮沸 5 分鐘變性后冷卻至室溫，加入100 mg現(xiàn)制的NHS-碘乙酸活性酯(碘乙酸-NHS)，4°C避光反應(yīng)30分鐘，立即脫鹽，收集10 mL，然后加入50 mg的二硫蘇糖醇(DTT)保持pH>8.5下室溫避光反應(yīng)60分鐘，再加入50 mg DTT煮沸5分鐘還原。冷卻至室溫，還原后的BSA經(jīng)過(guò)脫鹽柱G25 S印hadex去掉多余的DTT后加入上述1.1.3的經(jīng)HPLC純化的萊克多巴胺溴乙酰酯400 μ L，用0.1 mol/L Na2CO3調(diào)pH=8.5，室溫避光反應(yīng)60分鐘后生成萊克多巴胺溴乙酰-BSA共價(jià)鍵復(fù)合體，經(jīng)G25 Sephadex脫鹽、分裝保存待用。1.2.2配對(duì)檢測(cè)抗原
取 10 mg 卵清蛋白 0VA，溶解于 400 μ 含 0.1 mol/L EDTA 的 0.1 mol/L Na2CO3 溶液，充分溶解后，加入40 μ 10%的SDS混勻后煮沸5分鐘變性，然后加入6 mg的DTT煮沸10分鐘還原。冷卻至室溫，還原后的OVA經(jīng)脫鹽柱G25 Sephadex去掉多余的DTT后加入上述經(jīng)HPLC純化的萊克多巴胺溴乙酰酯200 μ L，用0.1 mol/L Na2CO3調(diào)ρΗ=8.5，室溫避光反應(yīng)60分鐘后，生成萊克多巴胺溴乙酰-OV共價(jià)鍵復(fù)合體，經(jīng)G25 S印hadex脫鹽后得到的為配對(duì)檢測(cè)抗原。1.3萊克多巴胺多克隆抗血清制備
用新西蘭大白兔為免疫動(dòng)物，疫苗濃度為I mg/mL，首次免疫用0.5 mL疫苗加0.5 mLPBS加I mL完全佐劑混勻多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫用0.25 mL疫苗加0.75 mLPBS加I mL不完全佐劑混勻分2點(diǎn)注射，首次免疫后，每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，35-40天采集0.5 mL血清檢測(cè)滴度，用配對(duì)檢測(cè)抗原包被做血清的間接ELISA檢測(cè)，血清滴度達(dá)到1:6400后進(jìn)行大量血清制備。
權(quán)利要求
1.一種微型高效萊克多巴胺免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于: 1)將經(jīng)免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體和過(guò)碘酸活化的瓊脂糖混勻，在搖床上室溫反應(yīng)30分鐘，然后在4°C冰箱靜置30分鐘后加入硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結(jié)合的抗體，用磷酸緩沖液清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干磷酸緩沖液后加入等體積甘油，混勻，得到萊克多巴胺免疫親和填料； 2)在特制的塑料柱內(nèi)下端裝上過(guò)濾膜，將萊克多巴胺免疫親和填料裝入柱中，25μ L/柱，填料上層蓋上過(guò)濾膜，即得所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱，包括偶聯(lián)有免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該填料的特制塑料柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體是用萊克多巴胺與溴乙酰氯反應(yīng)得到衍生物萊克多巴胺溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色譜HPLC純化該溶液得到純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯，將純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與載體蛋白偶聯(lián)，得到的偶聯(lián)物作為免疫原免疫動(dòng)物，得到抗血清，同時(shí)用該純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與經(jīng)活化的瓊脂糖反應(yīng)制備純化抗體用的免疫親和柱，用該親和柱一步提取抗血清得到萊克多巴胺特異性多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的萊克多巴胺溴乙酰酯是將萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品在三乙胺催化下與溴乙酰氯反應(yīng)得到衍生物萊克多巴胺溴乙酰酯溶液。
5.將此萊克多巴胺溴乙酰氯酯溶液用制備型高效液相色譜儀反向柱色譜分離純化出相對(duì)于萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品峰后移，且具有萊克多巴胺紫外光吸收光譜特征的單一主峰組分，收集該主峰組分得到純化的萊克多巴胺溴乙酰酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的萊克多巴胺溴乙酰酯是將萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品在三乙胺催化下與溴乙酰氯反應(yīng)得到衍生物萊克多巴胺溴乙酰酯溶液。
7.將此萊克多巴胺溴乙酰氯酯溶液用制備型高效液相色譜儀反向柱色譜分離純化出相對(duì)于萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品峰后移，且具有萊克多巴胺紫外光吸收光譜特征的單一主峰組分，收集該主峰組分得到純化的萊克多巴胺溴乙酰酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于:所述的用純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與經(jīng)活化的瓊脂糖反應(yīng)制備純化抗體用的免疫親和柱，是將經(jīng)活化的瓊脂糖與賴氨酸反應(yīng)得到氨基化的瓊脂糖，再將氨基化的瓊脂糖與NHS-碘乙酸反應(yīng)后，再用DTT還原，得到巰基化的瓊脂糖，將巰基化的瓊脂糖和萊克多巴胺溴乙酰酯快速混勻，室溫反應(yīng)60分鐘，得到化學(xué)共價(jià)鍵復(fù)合體萊克多巴胺溴乙酰-瓊脂糖填料，將填料裝柱，洗去多余的DTT，得到提純?nèi)R克多巴胺特異性抗體用的免疫親和柱。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱和萊克多巴胺膠體金試紙條聯(lián)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效、準(zhǔn)確富集萊克多巴胺的免疫親和純化富集柱及其制備方法和用途，本發(fā)明所提供的免疫親和純化富集柱包括偶聯(lián)有萊克多巴胺特異性抗體的活化瓊脂糖填料和裝載該親和填料的塑料柱。所述的親和填料偶聯(lián)的萊克多巴胺特異性抗體是用免疫親和法提取得到，所述的免疫親和純化富集柱是將免疫親和填料裝載入特制的塑料柱得到。該免疫親和純化富集柱裝載填料體積小、富集萊克多巴胺能力強(qiáng)，與色譜法、膠體金試紙條聯(lián)合使用，可高效、準(zhǔn)確檢測(cè)萊克多巴胺的含量。
文檔編號(hào)B01D15/22GK103100237SQ20121058931
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者謝體三, 李軍, 寧歡歡, 潘麗金, 葉云峰, 韋良云, 蕭浩 申請(qǐng)人:南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司, 廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所