專利名稱：離心方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)從其混合物中分離出來(lái)的離心方法。
背景技術(shù)：
固液分離法是一種將高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)從其混合物中分離出來(lái)的方法，固液分離法可大致分為過(guò)濾分離法和沉淀分離法。過(guò)濾分離法是一種通過(guò)過(guò)濾操作將固體物質(zhì)和液體物質(zhì)分離的方法，所述過(guò)濾操作使用諸如濾紙、濾網(wǎng)、多孔薄膜之類(lèi)的過(guò)濾材料， 并且利用自然重力、壓縮力、減壓力、離心力等作為驅(qū)動(dòng)力。沉淀分離法是一種通過(guò)自然沉淀或離心力將混合物中的固體物質(zhì)沉淀下來(lái)，并由此將其與上清液中的液體物質(zhì)分離的方法，而利用離心力的方法稱為離心法。在諸如離心法之類(lèi)的沉淀分離法中，會(huì)出現(xiàn)這樣的情況當(dāng)將上清液與沉淀物分離時(shí)，沉淀物會(huì)進(jìn)入上清液并將其污染。特別是當(dāng)沉淀物的上部為漿液的形狀時(shí)，則難以避免沉淀物進(jìn)入并污染上清液。作為解決該問(wèn)題的手段，已知一種使用沉淀輔助劑的方法 (例如，專利文件1)。然而，需要根據(jù)固體物質(zhì)的種類(lèi)來(lái)選擇合適的沉淀輔助劑，而且還會(huì)存在合適的沉淀輔助物是未知的情況，所以該方法缺乏靈活性。此外，盡管離心方法也用于分離具有不同比重的液體混合物(液-液分離)。然而，即使是在離心輔助的液-液分離中，當(dāng)對(duì)離心后形成為最外層的層進(jìn)行分級(jí)時(shí)，仍會(huì)存在下層物質(zhì)被污染的情況。[專利文件 1]國(guó)際公布 No. W02005/063979

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種可解決上述問(wèn)題的離心方法。本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用了離心法的固-液分離中，通過(guò)使用熱可逆凝膠(thermoreversible gel)或能夠形成熱可逆凝膠的已溶解的膠凝劑，可防止沉淀物進(jìn)入并污染上清液。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在使用離心法的液-液分離中，通過(guò)使用熱可逆凝膠或者能夠形成熱可逆凝膠的已溶解的膠凝劑，可防止高比重物質(zhì)進(jìn)入并污染低比重物質(zhì)，由此完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明包括以下實(shí)施方案。[1] 一種分離高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)的離心方法，其包括將包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)、以及熱可逆凝膠和能夠形成熱可逆凝膠劑的已溶解的膠凝劑中的至少一種的混合物進(jìn)行離心，其中，所述熱可逆凝膠或者所述已溶解的膠凝劑可形成使所述低比重物質(zhì)和所述高比重物質(zhì)分離的凝膠層。[2]上述[1]所述的離心方法，其中，所述離心操作是在溫度等于或低于所述膠凝劑的膠凝溫度的條件下進(jìn)行的。[3]上述[1]或[2]所述的離心方法，其中，所述混合物包含固體和液體。[4]上述[1]所述的離心方法，其中，所述混合物通過(guò)如下方法得到(a)將所述高比重物質(zhì)、所述低比重物質(zhì)和所述膠凝劑混合，或者將包含所述高比重物質(zhì)和所述低比重物質(zhì)的組合物與所述膠凝劑混合；以及(b)將包含所述高比重物質(zhì)、所述低比重物質(zhì)和所述膠凝劑的混合物加熱，以使所述膠凝劑溶解。[5]上述[1]所述的離心方法，其中，所述混合物通過(guò)如下方法得到(A)獲得溶解有所述膠凝劑的溶液；以及(B)將所述溶液與所述高比重物質(zhì)和所述低比重物質(zhì)混合，或者使將所述溶液與包含所述高比重物質(zhì)和所述低比重物質(zhì)的組合物混合。[6]上述[1]_[5]所述的離心方法，其中，所述混合物包含離子交換樹(shù)脂。[7]上述[6]所述的離心方法，其中，所述離子交換樹(shù)脂為螯合樹(shù)脂。[8]上述[1]或[2]所述的離心方法，其中，所述混合物包含水成液和有機(jī)液體。[9]上述[8]所述的離心方法，其中，所述有機(jī)液體為選自苯酚、氯仿和異戊醇所組成的組中的至少一種。[10]上述[8]或[9]所述的離心方法，其中，所述水成液包含核酸。[11] [1]-[10]所述的離心方法，其中，所述膠凝劑為親水性膠凝劑。[12]上述[11]所述的離心方法，其中，所述親水性膠凝劑為瓊脂糖。[13]上述[1]_[12]所述的離心方法，其中，所述膠凝劑部分地溶解在所述混合物中。[14]上述[1]_[13]所述的離心方法，其還包括收集所述低比重物質(zhì)。[15] 一種組合物，包含能夠形成熱可逆凝膠的親水性膠凝劑和離子交換樹(shù)脂。根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，可容易地防止沉淀物進(jìn)入并污染上清液，其中沉淀物進(jìn)入并污染上清液是通過(guò)沉淀分離法對(duì)上清液進(jìn)行分級(jí)時(shí)所存在的問(wèn)題。此外，還可容易地防止高比重物質(zhì)進(jìn)入并污染低比重物質(zhì)，其中高比重物質(zhì)進(jìn)入并污染低比重物質(zhì)是使用離心進(jìn)行液-液分離時(shí)所存在的問(wèn)題。


圖IA為示出了本發(fā)明示例性實(shí)施方案的固-液分離法的例子的圖。圖IB為示出了本發(fā)明示例性實(shí)施方案的固-液分離法的例子的圖。圖2為示出了通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行用以大米DNA提取的離心后的狀態(tài)圖。圖3為示出了通過(guò)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的方法進(jìn)行用以大米DNA提取的離心后的狀態(tài)圖。圖4為示出了通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行用以從植物中提取DNA的離心后的狀態(tài)圖。圖5為示出了通過(guò)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的方法進(jìn)行用以從植物中提取DNA的離心后的狀態(tài)圖。
圖6為示出了通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行用以從福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片中提取DNA的離心處理后的狀態(tài)圖。圖7為示出了通過(guò)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的方法進(jìn)行用以從福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片中提取DNA的離心處理后的狀態(tài)圖。圖8為示出了實(shí)施例6中通過(guò)以鼠CCND基因中的164bp區(qū)段作為目標(biāo)序列而獲得的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的圖。泳道M表示IOObp DNA Ladder Marker。泳道1表示陰性對(duì)照。泳道2表示陽(yáng)性對(duì)照。泳道3和6分別表示使用2. 5 μ 1和1 μ 1的下述上清液作為PCR模板而獲得的PCR 產(chǎn)物，該上清液為使用不含膠凝劑的樣品，通過(guò)極為小心的方式以避免樹(shù)脂層的污染而收集得到的上清液。泳道4和7分別表示使用2. 5 μ 1和1 μ 1的下述上清液作為PCR模板而獲得的PCR產(chǎn)物，該上清液為使用不含膠凝劑的樣品，通過(guò)故意使樹(shù)脂層受到少量的污染而收集得到的上清液。泳道5和8分別表示使用2. 5 μ 1和1 μ 1的下述上清液作為PCR模板而獲得的PCR產(chǎn)物，該上清液為通過(guò)使用含有膠凝劑的樣品而收集得到的上清液。圖9為示出了實(shí)施例6中通過(guò)以鼠CCND基因中的416bp區(qū)段作為目標(biāo)序列而獲得的PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的圖。泳道M表示IOObp DNA Ladder Marker。泳道1表示陰性對(duì)照。泳道2表示陽(yáng)性對(duì)照。泳道3和6分別表示使用2. 5 μ 1和1 μ 1的下述上清液作為PCR模板而獲得的PCR 產(chǎn)物，該上清液為使用不含膠凝劑的樣品，通過(guò)極為小心的方式以避免樹(shù)脂層的污染而收集得到的上清液。泳道4和7分別表示使用2. 5 μ 1和1 μ 1的下述上清液作為PCR模板而獲得的PCR產(chǎn)物，該上清液為使用不含膠凝劑的樣品，通過(guò)故意使樹(shù)脂層受到少量的污染而收集得到的上清液。泳道5和8分別表示使用2. 5 μ 1和1 μ 1的下述上清液作為PCR模板而獲得的PCR產(chǎn)物，該上清液為通過(guò)使用含有膠凝劑的樣品而收集得到的上清液。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)描述本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。在此，除非另有注釋，否則在以下描述中 “％”是指“(重量/體積)％”。本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的離心方法是一種通過(guò)離心方式來(lái)分離高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)的方法，其中通過(guò)在存在熱可逆凝膠和/或能夠形成熱可逆凝膠的已溶解的膠凝劑的情況下進(jìn)行離心，形成了使低比重物質(zhì)與高比重物質(zhì)分離的熱可逆凝膠層。無(wú)論是固-液分離法還是液-液分離法中，本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的離心方法均可應(yīng)用。對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)沒(méi)有特別的限定，只要高比重物質(zhì)的比重高于低比重物質(zhì)的比重即可。低比重物質(zhì)可以是這樣的物質(zhì)、組合物、或者它們的混合物，其包含需要通過(guò)使用本發(fā)明的離心方法而與其它組分分離的組分。低比重物質(zhì)優(yōu)選為液體物質(zhì)，更優(yōu)選為水成液物質(zhì)。高比重物質(zhì)可以是這樣的物質(zhì)、組合物、或者它們的混合物，其包含需要通過(guò)使用本發(fā)明的離心方法而除去的組分。高比重物質(zhì)可以是固體物質(zhì)、液體物質(zhì)、或者它們的混合物。當(dāng)高比重物質(zhì)為液體物質(zhì)時(shí)，其可以是水成液或者有機(jī)液體，優(yōu)選為有機(jī)液體。對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方案中所使用的能夠形成熱可逆凝膠的膠凝劑(也簡(jiǎn)稱為膠凝劑)沒(méi)有特別的限定，只要其為能夠引起熱可逆的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的膠凝劑即可，其可以是親水性膠凝劑或者親油性膠凝劑。其優(yōu)選的例子包括這樣的膠凝劑，在制備該膠凝劑的溶解產(chǎn)物以及在等于或低于其膠凝溫度下進(jìn)行離心時(shí)，該膠凝劑能夠在所需位置上形成凝膠層。雖然沒(méi)有對(duì)膠凝劑加以特別的限定，但是當(dāng)?shù)捅戎匚镔|(zhì)為水成液物質(zhì)時(shí)，可適當(dāng)使用親水性膠凝劑。作為能夠形成熱可逆凝膠的親水性膠凝劑，可以列舉的有瓊脂糖、角叉菜膠、胞外多糖膠、羅望子膠、紅藻膠、果膠和明膠，最適合列舉的為瓊脂糖。可使用包含上述膠凝劑的組合物(例如，以瓊脂糖作為主要組分的瓊脂)作為膠凝劑。對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的熱可逆凝膠沒(méi)有特別的限定，只要其為熱可逆的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變即可?？捎缮鲜瞿z凝劑來(lái)制備熱可逆凝膠?？扇芜x地通過(guò)確定離心后凝膠層的形成條件來(lái)決定熱可逆凝膠和/或膠凝劑的用量。當(dāng)需要形成厚的凝膠層以確保防止離心后高比重物質(zhì)進(jìn)入并污染低比重物質(zhì)時(shí)， 可將包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)以及熱可逆凝膠和/或膠凝劑的混合物中的熱可逆凝膠和/或膠凝劑的濃度設(shè)定在較高水平上。當(dāng)需要提高低比重物質(zhì)的收集量(collection yield)時(shí)，可將混合物中熱可逆凝膠和/或膠凝劑的濃度設(shè)定為能夠在離心后形成凝膠層的范圍內(nèi)的較低水平上。盡管對(duì)膠凝劑的濃度沒(méi)有特別的限定，但是當(dāng)使用瓊脂糖作為膠凝劑時(shí)，包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)以及瓊脂糖的混合物中瓊脂糖的濃度優(yōu)選為0. 05% 至1.0%，更優(yōu)選為0. 075%至0. 75%，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 至0. 3%。對(duì)離心條件沒(méi)有特別的限定，但前提條件是在離心后，低比重物質(zhì)形成為上層， 并且會(huì)形成使低比重物質(zhì)與高比重物質(zhì)分離的凝膠層。可根據(jù)熱可逆凝膠和/或膠凝劑的種類(lèi)、混合物中熱可逆凝膠和/或膠凝劑的濃度、用作熱可逆凝膠和/或膠凝劑的溶劑的液體物質(zhì)的種類(lèi)等來(lái)確定離心條件。盡管對(duì)離心條件沒(méi)有特別的限定，但是當(dāng)使用瓊脂糖作為膠凝劑時(shí)，離心力優(yōu)選為5000G至30000G，更優(yōu)選為10000G至20000G，進(jìn)一步優(yōu)選為 12000G至18000G。此外，離心時(shí)間優(yōu)選為1分鐘至1小時(shí)，更優(yōu)選為3分鐘至30分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選為5分鐘至20分鐘。離心溫度可等于或低于膠凝劑的膠凝溫度。盡管對(duì)離心溫度沒(méi)有特別的限定，但是當(dāng)將Agarose L03 "TaKaRa"(由TAKARA BIO INC.生產(chǎn))用作膠凝劑時(shí)，離心溫度優(yōu)選低于37°C，更優(yōu)選低于34°C，進(jìn)一步優(yōu)選低于10°C。熱可逆凝膠和/或可溶性膠凝劑在離心后形成了使低比重物質(zhì)與高比重物質(zhì)分離的凝膠層。術(shù)語(yǔ)“使低比重物質(zhì)與高比重物質(zhì)分離”是指凝膠層形成為使低比重物質(zhì)的層(上層)與高比重物質(zhì)(其可形成為層)分離的層(下層)。在此，該說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ) “下層”是指通過(guò)離心而形成于液體層(其形成為上層)的下方的層。除了能夠與最下層區(qū)分開(kāi)的上述上層(中間層)之外的其他層均包括在本說(shuō)明書(shū)的術(shù)語(yǔ)“下層”的范圍內(nèi)。當(dāng)離心后形成三個(gè)以上的層時(shí)，可在能夠防止高比重物質(zhì)進(jìn)入并污染低比重物質(zhì)這樣的范圍內(nèi)，在這兩個(gè)以上的下層中的任意位置處形成凝膠層。當(dāng)離心后高比重物質(zhì)發(fā)生沉淀并且沉淀物未形成層時(shí)，會(huì)出現(xiàn)所形成的凝膠層為包含沉淀物的形式的情況。此外，例如當(dāng)混合物中存在比沉淀物的比重更高的物質(zhì)時(shí)，則離心后沉淀物或沉淀物層不總是位于最下層。本發(fā)明離心方法的實(shí)施方案為固-液分離法。固-液分離法包括以下步驟對(duì)包含固體(高比重物質(zhì))、液體(低比重物質(zhì))以及熱可逆凝膠和/或能夠形成熱可逆凝膠的已溶解的膠凝劑的混合物進(jìn)行離心，其中熱可逆凝膠和/或已溶解的膠凝劑形成為與液體層(上層)分離的凝膠層(下層)。優(yōu)選在等于或低于膠凝劑的膠凝溫度的條件下進(jìn)行離CN 102258892 A
說(shuō)明書(shū)
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心操作。該方法還可進(jìn)一步包括收集低比重物質(zhì)的步驟。如圖IA和圖IB所示，其示意性地示出了本發(fā)明示例性實(shí)施方案的固-液分離法的例子。圖IB示出的是沉淀物未形成層、 并且凝膠層形成為包含沉淀物的形式的實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的固-液分離法，在獲得包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)和已溶解的用以形成熱可逆凝膠的膠凝劑的混合物之后，在等于或低于膠凝劑的膠凝溫度的溫度下，上述混合物的全部或者一部分可能會(huì)膠凝化，之后可對(duì)膠凝化的混合物進(jìn)行離心處理。當(dāng)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的固-液分離法包括收集低比重物質(zhì)(液體)的步驟時(shí)，對(duì)收集方法沒(méi)有特別的限定。甚至當(dāng)由于沉淀物的上部變?yōu)闈{液形成而難以通過(guò)常規(guī)的沉淀分離法來(lái)防止沉淀物進(jìn)入并污染液體時(shí)，也可通過(guò)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的固-液分離法來(lái)防止沉淀物進(jìn)入并污染液體，從而使得可通過(guò)(例如)傾析來(lái)收集液體。對(duì)獲得包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)和熱可逆凝膠和/或能夠形成熱可逆凝膠的已溶解的膠凝劑的混合物的方法沒(méi)有特別的限制。在本發(fā)明的固-液分離法的示例性實(shí)施方案中，通過(guò)以下步驟來(lái)獲得該混合物(a)將高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)和膠凝劑混合，或者將包含高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)的組合物與膠凝劑混合；以及(b)將包含高比重物質(zhì)、 低比重物質(zhì)和膠凝劑的混合物加熱，以使膠凝劑溶解。例如，當(dāng)目標(biāo)是通過(guò)用固體物質(zhì)從而從作為樣品的液體中除去不需要的物質(zhì)(例如，通過(guò)使不需要的物質(zhì)附著在固體物質(zhì)上而將其除去)時(shí)，可通過(guò)預(yù)先制備膠凝劑和固體物質(zhì)的混合物、并隨后將該混合物加入到液體中以進(jìn)行本發(fā)明示例性實(shí)施方案的離心方法，從而除去不需要的物質(zhì)。在這種情況下，可將膠凝劑和固體物質(zhì)的混合物以懸浮液的形式使用，以有助于其加入到樣品中。此外，當(dāng)目標(biāo)是從作為樣品的固體中提取所需物質(zhì)時(shí)， 可通過(guò)預(yù)先制備包含待用作萃取溶劑的液體和膠凝劑的混合物、并隨后將其加入到樣品中以進(jìn)行本發(fā)明示例性實(shí)施方案的離心方法，從而提取所需物質(zhì)。此外，當(dāng)樣品中不需要物質(zhì)的除去(通過(guò)使用固體物質(zhì)以除去不需要的物質(zhì))和所需物質(zhì)的提取(通過(guò)使用萃取劑來(lái)提取所需物質(zhì))需要同時(shí)進(jìn)行時(shí)，可通過(guò)預(yù)先制備包含膠凝劑、固體物質(zhì)和萃取劑的混合物、并隨后將其加入到樣品中以進(jìn)行本發(fā)明示例性實(shí)施方案的方法。盡管對(duì)上述膠凝劑的形狀沒(méi)有特別的限定，但是可以列舉的有可通過(guò)后續(xù)加熱而容易地溶解的粉末或微凝膠。微凝膠為微細(xì)凝膠的松散材料，是指類(lèi)似于水溶液狀的具有流動(dòng)性的凝膠，它可以通過(guò)在冷卻時(shí)對(duì)由溶解膠凝劑而制備得到的溶液施加攪拌力或類(lèi)似的力，以破壞凝膠的形成而制備得到。通過(guò)使用微凝膠形式的膠凝劑，使得膠凝劑易于分散在經(jīng)過(guò)混合處理的產(chǎn)物中?？砂凑宅F(xiàn)有文獻(xiàn)(例如，日本專利文獻(xiàn)No. 2513506)中描述的方法來(lái)制備微凝膠。盡管對(duì)上述用于除去不需要物質(zhì)的固體物質(zhì)沒(méi)有特別的限定，但是可以列舉的有離子交換樹(shù)脂、活性炭、硅膠以及親合樹(shù)脂。作為離子交換樹(shù)脂，可以列舉的有陰離子交換樹(shù)脂、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和螯合樹(shù)脂。此外，作為待提取的特定物質(zhì)，可以列舉的有(例如) 核酸，如DNA、RNA等。在“ (b)將包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)和膠凝劑的混合物加熱，以使膠凝劑溶解”中，膠凝劑溶解在成為溶劑的液體中。加熱條件可以是使膠凝劑完全溶解在液體中的條件、或者是使膠凝劑部分溶解在液體中的條件，前提是在隨后的離心操作中可形成凝膠層° 例如，在 Naomichi Kunizaki 禾口 Masao Sano 的"Food polysaccharides-Knowledge on Emulsif ication, Viscosity Improvement and Gelation (日文版)，，(Heibunsha 出版，2001 年11月25日)中描述了各種膠凝劑的溶解度。在設(shè)置加熱條件時(shí)，也可參考現(xiàn)有文獻(xiàn)。例如，在將瓊脂糖粉末溶解在水中的情況中，可用肉眼確定膠凝劑在溶劑中的溶解狀態(tài)。盡管未溶解的瓊脂糖粉末的水懸浮液是白色的，但是可觀察到部分溶解于水中的瓊脂糖粉末為透明顆粒、或者為中心部分呈白色而表面透明的顆粒(所謂的未溶解粉塊)。盡管對(duì)加熱條件沒(méi)有特別限定，但是(例如)當(dāng)使用瓊脂糖作為膠凝劑時(shí)，溫度優(yōu)選為46°C至120°C， 更優(yōu)選為50°C至110°C，進(jìn)一步優(yōu)選為55°C至100°C。此外，加熱時(shí)間優(yōu)選為1分鐘至1小時(shí)，更優(yōu)選為2分鐘至30分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選為5分鐘至20分鐘。在此，可存在這樣的情況 在該步驟中通過(guò)加熱以溶解膠凝劑的同時(shí)，可進(jìn)行樣品中特定物質(zhì)的提取以及不需要物質(zhì)的除去。在本發(fā)明固液分離法的另一實(shí)施方案中，通過(guò)以下步驟來(lái)獲得混合物(A)獲得其中溶解有膠凝劑的溶液；以及(B)將該溶液與高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)混合，或者將該溶液與包含高比重物質(zhì)以及低比重物質(zhì)的組合物混合。本發(fā)明還包括一種組合物，該組合物包含能夠形成熱可逆凝膠的膠凝劑以及可用于分離或純化所需物質(zhì)的固體物質(zhì)。該組合物優(yōu)選用于(例如)上述本發(fā)明示例性實(shí)施方案的固液分離法中。該組合物優(yōu)選包含用于形成熱可逆凝膠的親水性膠凝劑和吸附載體。 作為吸附載體，可以列舉的有離子交換樹(shù)脂、活性炭、硅膠、螯合樹(shù)脂和親合樹(shù)脂，可將選自其中的一種用作PCR抑制劑的吸附樹(shù)脂。吸附載體優(yōu)選為離子交換樹(shù)脂。例如，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明示例性實(shí)施方案的離心方法，通過(guò)使用PCR抑制劑吸附樹(shù)脂而從福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片中提取DNA[例如，使用市售可得的DEXPAT (注冊(cè)商標(biāo)，由TAKARA BIO株式會(huì)社生產(chǎn))提取DNA]時(shí)，本發(fā)明示例性實(shí)施方案的組合物可包含能夠形成熱可逆凝膠的親水性膠凝劑、PCR抑制劑吸附樹(shù)脂(螯合樹(shù)脂)以及表面活性劑水溶液。將完全懸浮的上述組合物倒入盛有福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片的容器中， 于約100°C下加熱大約10分鐘，之后在等于或低于膠凝劑的膠凝溫度的溫度下進(jìn)行離心處理，此時(shí)在最下層中形成有螯合樹(shù)脂沉淀物，其上為凝膠層，上層為包含從福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片中提取出的DNA的水層。由于通過(guò)利用所述組合物而在上層和沉淀物之間形成了凝膠層，使得在對(duì)水層進(jìn)行分級(jí)時(shí)引發(fā)PCR抑制劑吸附樹(shù)脂的污染的可能性大幅下降，從而使得水層的分級(jí)變得容易。例如，可通過(guò)傾析來(lái)收集水層。在使用常規(guī)方法的情況中，離心后PCR抑制劑吸附樹(shù)脂沉淀物的上部成為漿液狀態(tài)，并且PCR抑制劑吸附樹(shù)脂為透明的，因此在水層分級(jí)過(guò)程中，會(huì)存在因不小心而引起樹(shù)脂污染的情況。由于PCR抑制劑吸附樹(shù)脂可能會(huì)抑制隨后的核酸處理(例如PCR)，因此需要盡可能避免PCR抑制劑吸附樹(shù)脂進(jìn)入并污染DNA溶液。在含有通過(guò)上述方法提取的DNA的水層中，除去了來(lái)自福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片的物質(zhì)，該物質(zhì)可抑制隨后的核酸處理(例如PCR)。在此盡管沒(méi)有特別的限定，但是當(dāng)通過(guò)本發(fā)明示例性實(shí)施方案并使用PCR抑制劑吸附樹(shù)脂而從福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片提取DNA時(shí)，使用瓊脂糖作為親水性膠凝劑是有利的。本發(fā)明包括含有能夠形成熱可逆凝膠的親水性膠凝劑和吸附載體的試劑盒。該試劑盒還可包含(例如)用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的熱穩(wěn)定聚合酶、緩沖液、鎂鹽、dNTP混合液等。 能夠形成熱可逆凝膠的親水性膠凝劑和吸附載體的例子包括上文所述的那些。
本發(fā)明離心方法的一個(gè)實(shí)施方案為液-液分離法。本發(fā)明示例性實(shí)施方案的液-液分離法為基于比重的差別，通過(guò)利用熱可逆凝膠和/或能夠形成熱可逆凝膠的膠凝劑而將液體混合物分離成兩個(gè)以上的液體層的離心方法，其中所述熱可逆凝膠和/或能夠形成熱可逆凝膠的膠凝劑會(huì)在所需位置上形成層。通過(guò)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的液-液分離法，在進(jìn)行上層中低比重物質(zhì)的分級(jí)時(shí)，可防止高比重物質(zhì)的污染。本發(fā)明示例性實(shí)施方案的液-液分離法可用于分離兩種以上不會(huì)相互溶混的液體。作為上述高比重物質(zhì)，可以適當(dāng)?shù)亓信e有機(jī)液體，而作為上述低比重物質(zhì)，可以適當(dāng)?shù)亓信e水成液(例如，水性溶液)。 即，液-液分離法的優(yōu)選實(shí)施方案為包括以下步驟的方法獲得包含有機(jī)液體、水成液和熱可逆凝膠和/或能夠形成熱可逆凝膠的膠凝劑的混合物；以及通過(guò)對(duì)上述混合物進(jìn)行離心處理而形成為最下層的有機(jī)層、為上層的凝膠層、以及為最上層的含水層。當(dāng)離心后還包括收集低比重物質(zhì)的步驟時(shí)，對(duì)收集方法沒(méi)有特別的限定，也可 (例如)通過(guò)傾析來(lái)收集包含低比重物質(zhì)的液體層。對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的液-液分離法中所使用的有機(jī)液體沒(méi)有特別的限定， 前提是其比重大于水的比重，例如，可以列舉的有苯酚、氯仿和異戊醇，也可以是包含兩個(gè)或以上上述液體的混合液體。此外，作為上述含水液體，可以列舉的有核酸水溶液。對(duì)上述熱可逆凝膠沒(méi)有特別的限定，前提是在離心后熱可逆凝膠能夠在所需位置上形成凝膠層， 優(yōu)選在高比重物質(zhì)(例如，有機(jī)液體)和低比重物質(zhì)(例如，含水液體)之間形成凝膠層。盡管對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方案的液-液分離法的用途沒(méi)有特別的限定，但是本發(fā)明示例性實(shí)施方案的液-液分離法可用作從核酸水溶液中除去蛋白質(zhì)的方法，例如苯酚處理、苯酚/氯仿處理、氯仿/異戊醇處理等。在這些除去蛋白質(zhì)的方法中，離心后有機(jī)層形成為下層，含有變性蛋白質(zhì)的層形成為上層，含水層形成為最上層，但是當(dāng)收集含水層時(shí)卻容易引起變性蛋白質(zhì)的污染。當(dāng)將本發(fā)明示例性實(shí)施方案的液-液分離法應(yīng)用于從核酸水溶液中除去蛋白質(zhì)的方法中時(shí)，則可在包含變性蛋白質(zhì)的層以及含水層之間形成熱可逆凝膠層，從而可以便捷地防止變性蛋白質(zhì)進(jìn)入并污染含水層。在此，在苯酚/氯仿處理中通常使用的是包含體積比為25 24 1的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液體，并且在氯仿/異戊醇處理中通常使用的是包含體積比為M 1的氯仿和異戊醇的混合液體。在此，在核酸水溶液的上述苯酚處理、苯酚/氯仿處理以及氯仿/異戊醇處理中，可使用已預(yù)先膠凝化的膠凝劑，而無(wú)須將其溶解。實(shí)施例以下將參照實(shí)施例來(lái)示意性地描述本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，但是本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1在從大米中提取DNA的離心操作中，使用了利用膠凝劑的離心方法，以對(duì)該方法進(jìn)行測(cè)試。在此，作為從大米中提取DNA時(shí)所用的各試劑，使用了貼于大米DNA提取試劑盒 [(可用于20粒精米)(用于大米鑒定的PCR試劑盒)，由TAKARA BIO株式會(huì)社制造]上的那些試劑。分別將4. 5mg、9mg、15mg 和 22. 5mg 的 SeaKem(注冊(cè)商標(biāo))GTG 瓊脂糖(由 Lonza 生產(chǎn))加入到500μ1的Lysis Buffer A中并使其懸浮，從而制得四種懸浮液。將所制得的4種懸浮液轉(zhuǎn)移至沸水浴中，以使瓊脂糖完全溶解。接下來(lái)，將200 μ 1的已在沸水浴中預(yù)熱的Lysis Buffer B加入到各懸浮液中并混合，在將這些瓊脂糖溶液用于接下來(lái)的測(cè)試之前一直將其置于沸水浴中。準(zhǔn)備5只試管分別將20粒大米置于容積為2ml的小試管中，之后加入540 μ 1 的無(wú)菌水，室溫下靜置過(guò)夜。在各試管中加入300μ 1的Lysis Buff erA，將米粒粉碎直至完全沒(méi)有塊狀物，然后加入120μ 1的LysisBuffer B并加以混合。再加入10μ1的 Protease K(由TAKARA BIO株式會(huì)社生產(chǎn))并混勻，隨后立即加熱至55°C并在該溫度下保溫1小時(shí)。在此過(guò)程中，在開(kāi)始加熱后的第10分鐘、第20分鐘和第40分鐘時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)混合(reversion mixing)0接下來(lái)，加入200 μ 1的上述4種瓊脂糖溶液從而制得4個(gè)樣品。在此方面，加入 200μ IWLysis Buffer 混合物(Lysis Buffer A =Lysis BufferB = 5 2)而非瓊脂糖溶液來(lái)制備樣品以作為對(duì)照。將上述5個(gè)樣品在4°C下以17，000G的離心力進(jìn)行離心處理 10分鐘。離心后分別收集全部上清液(在下層形成為凝膠層的例子中，上清液為含水層) 并稱重。表1所示的是離心時(shí)各樣品的瓊脂糖的濃度、離心后各樣品的狀態(tài)以及離心后各上清液(含水層)的收集量。[表 1]
瓊脂糖濃度(％)是否形成凝膠層離心后的狀態(tài)
0(對(duì)照) -770圖2 0.15形成760圖 3
0.30形成490
0.50形成300
0.75形成20通過(guò)在離心前向各樣品中加入瓊脂糖溶液并在瓊脂糖膠凝溫度或更低的溫度下進(jìn)行離心操作，使得含水層形成為上層，凝膠層形成為下層，并且大米粉碎產(chǎn)物的沉淀物形成為最下層。由于在大米粉碎產(chǎn)物和含水層之間形成了凝膠層，所以無(wú)需考慮大米粉碎產(chǎn)物的污染即可容易的分離出含水層。另一方面，在對(duì)照例中，當(dāng)收集上清液時(shí)大米粉碎產(chǎn)物發(fā)生了污染。在這一方面，與對(duì)照例相比，雖然加入了瓊脂糖的樣品的含水層收集量較低， 但是發(fā)現(xiàn)隨著瓊脂糖濃度的下降，含水層的收集量有上升的趨勢(shì)。實(shí)施例2在通過(guò)氯化芐法從植物中提取DNA的離心操作中，使用了利用膠凝劑的離心方法，以對(duì)該方法進(jìn)行測(cè)試。在此，作為氯化芐法中所用的各試劑，使用了貼于Plant DNA Isolation Reagent (由TAKARABI0株式會(huì)社生產(chǎn))上的那些試劑。分別將Iml無(wú)菌水加入到4個(gè)容量為1. 5ml的小試管中，并分別向其中加入 4. 5mg、9mg、15mg或22. 5mg的kaKem(注冊(cè)商標(biāo))GTG瓊脂糖(由Lonza生產(chǎn))并使其懸浮，從而制得四種懸浮液。將所制得的4種懸浮液轉(zhuǎn)移至沸水浴中，以使瓊脂糖完全溶解。 在將這些瓊脂糖溶液用于接下來(lái)的測(cè)試之前一直將其置于沸水浴中。將菠菜切成3mm2以下的小塊，并在5個(gè)容量為1. 5ml的小試管中放入50mg菠菜， 在-20°C下冷凍，隨后在室溫下解凍。用Pipetman的尖端按壓各小試管底部的菠菜約10次， 以粉碎植物組織。加入400 μ 1的提取液1，用Vortex Mixer攪拌5秒。待旋轉(zhuǎn)減慢后，加入80 μ 1的提取液2，并用Vortex Mixer攪拌5秒。待旋轉(zhuǎn)減慢后，加入150 μ 1的提取液 3，用Vortex Mixer攪拌5秒后至其旋轉(zhuǎn)減慢。接下來(lái)，加入120μ 1的上述濃度不同的瓊脂糖溶液，從而制得4種樣品。在這一方面，加入120 μ 1的未添加瓊脂糖的提取液混合液體來(lái)制備樣品，以作為對(duì)照。將上述5 個(gè)樣品在4°C下以17，OOOG的離心力進(jìn)行離心處理15分鐘。離心后將全部上層收集至容量為1.5ml的小試管中并稱重。根據(jù)Plant DNA Isolation Reagent的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行后續(xù)操作，以由收集到的各上層制備DNA溶液。表2所示的是離心時(shí)各樣品的瓊脂糖的濃度、離心后各樣品的狀態(tài)以及離心后各上層的收集量。[表 2]
權(quán)利要求
1.一種分離高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)的離心方法，其包括將包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)、以及熱可逆凝膠和能夠形成熱可逆凝膠劑的已溶解的膠凝劑中的至少一種的混合物進(jìn)行離心，其中，所述熱可逆凝膠或者所述已溶解的膠凝劑形成為使所述低比重物質(zhì)和所述高比重物質(zhì)分離的凝膠層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其中，所述離心操作是在溫度等于或低于所述膠凝劑的膠凝溫度的條件下進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其中，所述混合物包含固體和液體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其中，所述混合物通過(guò)如下方法得到(a)將所述高比重物質(zhì)、所述低比重物質(zhì)和所述膠凝劑混合，或者將包含所述高比重物質(zhì)和所述低比重物質(zhì)的組合物與所述膠凝劑混合；以及(b)將包含所述高比重物質(zhì)、所述低比重物質(zhì)和所述膠凝劑的混合物加熱，以使所述膠凝劑溶解。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其中，所述混合物通過(guò)如下方法得到(A)獲得溶解有所述膠凝劑的溶液；以及(B)將所述溶液與所述高比重物質(zhì)和所述低比重物質(zhì)混合，或者使將所述溶液與包含所述高比重物質(zhì)和所述低比重物質(zhì)的組合物混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的離心方法，其中，所述混合物包含離子交換樹(shù)脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的離心方法，其中，所述離子交換樹(shù)脂為螯合樹(shù)脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其中，所述混合物包含水成液和有機(jī)液體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的離心方法，其中，所述有機(jī)液體為選自苯酚、氯仿和異戊醇所組成的組中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的離心方法，其中，所述水成液包含核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其中，所述膠凝劑為親水性膠凝劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的離心方法，其中，所述親水性膠凝劑為瓊脂糖。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其中，所述膠凝劑部分地溶解在所述混合物中。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心方法，其還包括收集所述低比重物質(zhì)。
15.一種組合物，包含能夠形成熱可逆凝膠的親水性膠凝劑和離子交換樹(shù)脂。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將高比重物質(zhì)和低比重物質(zhì)從其混合物中分離的離心方法，該方法可防止在離心操作后收集低比重物質(zhì)的過(guò)程中高比重物質(zhì)的污染。該離心方法包括將包含高比重物質(zhì)、低比重物質(zhì)、以及熱可逆凝膠和能夠形成熱可逆凝膠劑的已溶解的膠凝劑中的至少一種的混合物進(jìn)行離心，其中，所述熱可逆凝膠或者所述已溶解的膠凝劑可形成使所述低比重物質(zhì)和所述高比重物質(zhì)分離的凝膠層。所述離心操作優(yōu)選在等于或低于所述膠凝劑的膠凝溫度的條件下進(jìn)行。
文檔編號(hào)B01D15/04GK102258892SQ20111012610
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者向井博之, 岸田小百合, 田中友美, 碓井圭名子 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社