專利名稱：復(fù)合過濾制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于從包括一種或多種生物大分子溶液中特別是大規(guī)模地分離和提純生物大分子的制品和方法。提純的生物大分子用于治療劑或者診斷劑。

發(fā)明內(nèi)容
生物大分子是活細胞的成分或者產(chǎn)品，包括蛋白質(zhì)，碳水化合物，脂質(zhì)和核酸。這些材料的檢測和量化以及分離和提純長期以來是研究者的研究對象。檢測和量化例如是各種各樣的生理條件例如疾病重要的診斷指標(biāo)。分離和提純生物大分子對于治療目，例如當(dāng)給特定生物大分子缺乏的病人給藥時，或者用作一些藥劑的生物相容的載體，和在生物醫(yī)學(xué)的研究中是重要的。生物大分子例如酶，是特殊類別的能夠催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，同樣是工業(yè)有用的；酶已經(jīng)被分離，提純，然后用于生產(chǎn)增甜劑，抗菌素，和各種各樣的有機化合物，例如乙醇，乙酸，賴氨酸，天冬氨酸，和生物學(xué)有益的產(chǎn)品，例如抗體和類固醇。
在活體內(nèi)它們的天然狀態(tài)下，這些生物大分子的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的生物活性通常保持在相當(dāng)窄范圍的pH和離子強度內(nèi)。因此，任何分離和提純操作必須考慮這樣的因素以使得到的處理的生物大分子具有藥效。
色譜分離法是通常在生物產(chǎn)品混合物上實施的分離和提純操作。它是一項基于在流動相之間溶質(zhì)互換的技術(shù)，所述的流動相可以是氣態(tài)或者液態(tài)相和固定相。溶液混合物各種各樣的溶質(zhì)的分離是基于改變每一溶質(zhì)與固定相結(jié)合的相互作用實現(xiàn)的；與相互作用不太強的溶質(zhì)相比，當(dāng)經(jīng)受流動相去結(jié)合效應(yīng)作用時，較強的結(jié)合相互作用通常導(dǎo)致更長的保留時間，用這種方式，實現(xiàn)分離和提純。
已經(jīng)使用改進的過濾盒進行生物分離。U.S.5,155,144公開了多微孔網(wǎng)片，包括將典型的離子交換色譜固定相，改進的多糖顆粒狀物例如二乙基氨基乙基纖維素分散在聚合物介質(zhì)之內(nèi)。建議這些片可以更進一步地構(gòu)建為閉端過濾盒。
使用再循環(huán)流出物，評價通常作為兩個不銹鋼格柵之間淺柱用于分析分離D-木糖的鉛離子處理的樹脂(參看A.M.Wilhelm and J.P.Riba，J.Chromatog.，1989，484，211-223)。評價最終充填床層反應(yīng)器體系以確定在相對高體系壓力和低流速下生產(chǎn)液相色譜，用于柱中最后使用的粒子的水動力條件。
在分析規(guī)模上有用的相對新型色譜分離介質(zhì)是整料。通過用適當(dāng)?shù)膯误w，溶劑和引發(fā)劑填充色譜柱制備該類型介質(zhì)，在適當(dāng)?shù)奈恢眠M行聚合物形成反應(yīng)。形成完全填充柱的多孔聚合物塞子，因此消除了小心填塞柱的需要。整體的介質(zhì)相對于微粒介質(zhì)具有改進的分離特性。然而，因為在聚合過程期間遇到放熱和傳熱問題，升級到大柱是有問題的。

發(fā)明內(nèi)容
簡要地，本發(fā)明提供一種包括過濾元件的復(fù)合過濾介質(zhì)，包括至少一層多孔纖維性的過濾層(例如紡織或者非紡織多孔材料層)，和至少一個能夠與目標(biāo)分子結(jié)合的固定相顆粒狀物吸附劑層，所述固定相顆粒狀物選自平均直徑小于50微米的粒子，柔軟的聚合物粒子和壓碎的整塊聚合物粒子。
盡管在整個該申請中使用術(shù)語“生物大分子”作為優(yōu)選的方案，如本發(fā)明以下的描述應(yīng)當(dāng)理解固定相顆粒狀物也能夠吸附或者結(jié)合其他的目標(biāo)分子。所述顆粒狀物能夠通過例如吸附，離子交換，疏水性結(jié)合或者親和結(jié)合從而結(jié)合生物大分子。所述顆粒狀物比使用包括常規(guī)生產(chǎn)規(guī)模色譜樹脂顆粒狀物的過濾介質(zhì)所能實現(xiàn)的，可提供更高的結(jié)合容量和/或更高的吸收效率和處理量。
大規(guī)模的生物分離方法(例如在生物制藥過程中)通常在大直徑的填充柱中進行，其中可連續(xù)實施平衡，載荷，洗滌，洗脫和再生/清洗。因為蛋白質(zhì)吸收的動力學(xué)限制(在色譜粒子之內(nèi)蛋白質(zhì)分子緩慢的粒子內(nèi)部擴散)，這些柱通常僅載荷到它們靜平衡能力的一部分。結(jié)果是相對緩慢的過程，處理量相當(dāng)?shù)牡汀?br> 如本發(fā)明使用的“大規(guī)模的生物分離”定義為在生物制藥的制造過程中下游的一個步驟，其中完成分離和/或提純在容積為100公升或更大的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的生物大分子產(chǎn)品。為阻止生物分子產(chǎn)品的降解，該生物分離應(yīng)該在24小時或更少的時間內(nèi)進行。假定在生物反應(yīng)堆中生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基中典型的生物大分子濃度為大約1克/升，這接近在24小時提純至少100g產(chǎn)品的能力。
對于小規(guī)模分析提純，由于小直徑柱(例如，直徑小于大約5厘米的柱)提供的邊壁效應(yīng)能夠使用具有大小，形狀，剛性，孔隙度等各種各樣特性的色譜樹脂。在小的色譜柱中，色譜法樹脂的填充床被柱內(nèi)壁充分支持，因此可以利用具有相對寬范圍特性的樹脂，能承受充分超過200psi(1.38MPa)的分壓，而不引起對樹脂粒子的損害。這些邊壁效應(yīng)當(dāng)所述柱直徑增加時而減少，在直徑大于20厘米的情況下已無關(guān)緊要。
因此，在大規(guī)模提純治療蛋白質(zhì)需要的大直徑的柱情況下，對于色譜粒子有嚴格的要求以便達到經(jīng)濟可行的處理量。在相當(dāng)?shù)偷膲航登闆r下，這些柱必須能夠獲得相對快的流速。通常，希望至少150厘米/小時的表面速度(或者線性流速)，其中500-1000厘米/小時的流速是優(yōu)選的，在小于200psi(1380kPa)的分壓下，優(yōu)選小于50psi(345kPa)以實現(xiàn)合理的處理量。這些壓力/流動要求規(guī)定有用的色譜樹脂必須是十分剛性的(例如，在所述柱中使用的流速下具有低的壓縮性)，必須是相對大的平均尺寸(例如，超過大約50-150μm的粒徑)，必須具有相對窄的粒度范圍分布(例如，必須進行篩分以除去細微的和大的粒子使得在柱中充填容易而不產(chǎn)生溝流等)。
然而在實踐中，在1厘米直徑柱中的壓力/流動試驗是在大的生產(chǎn)規(guī)模柱中實際應(yīng)用的指示。例如，在1厘米直徑柱中在50psi下支持特定流速的樹脂通常僅支持當(dāng)填充在10厘米或者較大直徑柱(在相同的床層高度下)中那些值的30-40％的流速。通常認為當(dāng)樹脂填充在1厘米×10厘米柱中時在50psi(0.34MPa)必須支持＞300cm/hr的流速(4ml/min)，在50psi下優(yōu)選＞600cm/hr，以對于生產(chǎn)規(guī)模色譜生物分離具有任何的實用性。
各式各樣的色譜粒子可商業(yè)獲得用于提純生物分子。許多這些樹脂和它們的組合物的適當(dāng)?shù)拿枋鎏峁┯凇癐mmobilized Affinity LigandTechniques”，G.T.Hermanson，A.K.Mallia，and P.K.Smith，AcademicPress，NY，1992，pp.1-41中。盡管大部分這些材料用于分析規(guī)模的分離，但僅選擇的材料被認為在生產(chǎn)或者大規(guī)模上是有用的。例如，基于天然的聚糖瓊膠糖和纖維素的支撐物具有合乎要求的親水性，大容量，低的非特異性結(jié)合等性質(zhì)。為在生產(chǎn)規(guī)模中有用，瓊膠糖材料必須是相當(dāng)高水平(例如6％或更多)交聯(lián)的以達到支撐相當(dāng)高流速必要的剛性。然而，交聯(lián)工藝導(dǎo)致容量降低。聚丙烯酰胺基支撐物具有有利的優(yōu)良pH穩(wěn)定性，優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性，低非特異性結(jié)合，和對微生物侵襲耐受性的特性，但是通常是十分柔軟的，通常僅有幾cm/hr的流速?；诙嗵怯倚囚秃铣蓡误w復(fù)合物的聚丙烯酰胺葡聚糖支撐物，同樣是優(yōu)良的支撐物用于小規(guī)模提純，但是由于它們?nèi)彳浀目蓧嚎s的性質(zhì)通常因低流速受困擾。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供可以使用柔軟的可壓縮的固定相用于高效大規(guī)模生物分離的復(fù)合過濾介質(zhì)。這樣的復(fù)合過濾介質(zhì)使用柔軟的顆粒狀物提供大容量，高吞吐量，和優(yōu)良的流速。如本發(fā)明使用，“柔軟的”指沿著外加力軸可能變形至少10％的粒子。對于圓球形的小珠，這樣的柔軟粒子將經(jīng)受顆粒高徑比至少10％的變化。例如，在色譜柱中在至少50psi(0.34MPa)壓力下，柔軟的圓球形的小珠初始的高徑比為1，可能變形到0.9或者更小的高徑比。
可以制備基于無機和有機聚合物的十分剛性并能承受高壓的色譜樹脂。然而，粒子大小和粒度分布在獲得生產(chǎn)規(guī)模填充床柱需要的高線性流速同樣是十分重要的參數(shù)。盡管小粒子(例如直徑小于大約50μm的粒子)在分析規(guī)模上是有利的，但它們導(dǎo)致非常高的背壓(例如100-1000的psi)。因為在生產(chǎn)規(guī)模上不能耐受這樣的壓力，制造這些粒子通常包括分級或者粒子篩選操作以除去“細微的”或者小的粒子。除去大的，或者特大型粒子以提供相對窄的粒度分布范圍，在柱形式中實現(xiàn)均勻充填和流動分布。該分級處理導(dǎo)致產(chǎn)量降低，增加樹脂生產(chǎn)成本，最后導(dǎo)致增加生物制藥成品的成本。其他的剛性基質(zhì)例如可控孔度玻璃，是十分脆性的，因此必須小心翼翼地處理以避免破碎和粒子的磨碎，這將產(chǎn)生細粒物料而損害大規(guī)模生產(chǎn)中的壓力/流動性質(zhì)。
本發(fā)明克服本領(lǐng)域中的這些問題，通過提供復(fù)合過濾介質(zhì)，可以使用平均粒度小于50μm，優(yōu)選小于30μm的固定相用于高效大規(guī)模的生物分離。這樣的復(fù)合過濾介質(zhì)使用這些顆粒狀物提供大容量，料想不到的高處理量，和優(yōu)良的流速，同時壓降低。本發(fā)明同樣允許使用未分級的樹脂用于高效大規(guī)模的生物分離。
在另外的方面，本發(fā)明提供一種分離(這可以包括提純)生物大分子的方法，包括提供包括過濾盒的分離系統(tǒng)的步驟，所述的過濾盒包括復(fù)合過濾介質(zhì)，能夠與生物大分子結(jié)合的固定相顆粒狀物位于其上游表面上，以使有選擇地將所述生物大分子(或者在有關(guān)生物大分子情況下，多于一種生物大分子)結(jié)合到固定相顆粒狀物上，以形成生物大分子固定相顆粒狀物產(chǎn)物。優(yōu)選，所述過濾盒是閉端過濾盒。所述使用的方法可以包括儲液槽，包括含至少一種生物大分子作為溶質(zhì)的溶液，和機泵和相關(guān)的管道，優(yōu)選形成閉合環(huán)路組件，將所述溶液泵送通過所述過濾盒，任選，將洗脫溶液泵送通過能夠反轉(zhuǎn)生物大分子固定相顆粒狀產(chǎn)物結(jié)合相互作用以釋放生物大分子的閉合環(huán)路組件。在另外的方面，提供含復(fù)合過濾介質(zhì)的過濾盒。
在本發(fā)明的又一個方面，提供一種分離過濾器組件，包括過濾盒和過濾盒外殼，本發(fā)明的復(fù)合過濾介質(zhì)的固定相顆粒狀物能夠結(jié)合生物大分子。更進一步地，本發(fā)明提供一種從包括其他生物大分子溶質(zhì)化合物中分離，提純或者濃縮生物大分子的方法。所述方法在相對低的壓力下進行，特別適用于大規(guī)模生物分離。
更特別的，本發(fā)明的方法提供一種液體過濾盒，包括復(fù)合過濾介質(zhì)，其包含在適當(dāng)連接到機泵和溶液儲液槽的外殼之內(nèi)。所述復(fù)合過濾介質(zhì)通過如下方法制備，其中包括在液體(通常水)中至少一種吸附，離子交換，親和性和疏水固定相顆粒狀物的漿料泵送以使過濾層部分載荷，因此固定相顆粒狀物主要位于所述多孔過濾層的上游表面上。要分離的生物混合物溶液然后泵送通過過濾盒，以使所述的生物溶質(zhì)通過與固定相結(jié)合締合從溶液中分離。通常實施該步驟以回收分離(即，結(jié)合)的生物溶質(zhì)。
在洗脫或者分離步驟期間，然后將可實現(xiàn)與固定相結(jié)合反轉(zhuǎn)的溶液泵送通過所述過濾盒，優(yōu)選溶液的體積小于生物溶液混合物的初始體積。從通過所述過濾元件的溶液中結(jié)合選擇的生物大分子溶質(zhì)可以通過吸附作用或者化學(xué)相互作用實現(xiàn)。優(yōu)選結(jié)合機制包括吸附，離子交換，疏水締合和親和結(jié)合。在分離步驟中，所述結(jié)合可被反轉(zhuǎn)以分離和提純預(yù)先結(jié)合的生物大分子。
在本申請中
“生物大分子”是指分子量至少500的細胞組分或者產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)，碳水化合物，脂質(zhì)，或者核酸；“過濾層”是指可以包含一個或多個單層的片狀紡織或者非紡織多孔材料，可以結(jié)合提供單片；平均孔徑大于1μm，最高達50μm。
“復(fù)合過濾介質(zhì)”或者“復(fù)合過濾器介質(zhì)”是指包括位于其上游表面上固定相顆粒狀物層的過濾層；所述介質(zhì)在過濾盒壓力最多0.25兆帕(MPa)可以維持至少0.01cm/min的通量率，“復(fù)合過濾介質(zhì)”包括一個或多個過濾層和布置在設(shè)置為流體通道的其上游表面上的吸附劑顆粒狀物層；它是完成過濾/分離/提純操作的分離過濾組件的實際組件；“目標(biāo)分子”指一種或多種化學(xué)物種，本發(fā)明描述的復(fù)合過濾制品設(shè)計成能從液體原料流或者溶液混合物原料流中分離所述的化學(xué)物種。目標(biāo)分子可以包括例如藥品物種，生物大分子，例如蛋白質(zhì)和抗體(單克隆的或者多克隆的)，DNA，RNA，由細菌表達的物種，酵母，哺乳動物，植物，或者昆蟲細胞，礦物質(zhì)，和人造的化學(xué)物種，例如合成小的有機分子，縮氨酸和縮多氨酸，低聚糖，和糖改性的蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，所述目標(biāo)分子可以是一種或多種雜質(zhì)或者廢產(chǎn)物，包括蛋白質(zhì)，無機物種，例如金屬，金屬離子，或者離子，例如碳酸鹽，硫酸鹽，氧化物，磷酸鹽，碳酸氫鹽，及其他通常在工業(yè)，住宅和生物原料流中存在的離子，小的有機分子，例如包含但是不局限于染料，殺蟲劑，肥料，添加劑，穩(wěn)定劑，工藝副產(chǎn)品和污染物，DNA，RNA，磷脂，毒素，或者其他的來自生物過程的細胞碎片的那些。在又一另外的實施方式中，浸出的配位體例如來自上游親和性分離過程的蛋白質(zhì)或者其他的親和配體同樣可以是目標(biāo)分子。在其他的實施方式中，本發(fā)明描述的復(fù)合過濾制品例如通過吸附或者酶促反應(yīng)可用于除去各種各樣的來自廢水或者飲用水物流的化學(xué)或者生物學(xué)物種。
“過濾盒”是指固定相顆粒狀物可以負載到其上的過濾設(shè)備；“過濾盒外殼”是指過濾盒的支承結(jié)構(gòu)；“大孔的”指甚至在干燥狀態(tài)也具有永久多孔結(jié)構(gòu)的粒子。盡管所述樹脂當(dāng)與溶劑接觸時可以溶脹，但通過多孔結(jié)構(gòu)進入所述粒子的內(nèi)部不需要溶脹。
“凝膠類型樹脂”或者“凝膠”在干燥狀態(tài)不具有永久的多孔結(jié)構(gòu)，但必須通過適當(dāng)?shù)娜軇┤苊浺赃M入所述粒子的內(nèi)部。大孔的和凝膠粒子另外描述在Sherrington，Chem.Commun.，2275-2286(1998)中。所述大孔的離子交換樹脂通常的孔大小為20-3000埃(即，使用氮吸附在各種各樣的相對壓力低溫條件下或者通過水銀侵入孔隙率測定法表征孔徑大小)。
“分離過濾組件”是指包括過濾盒，優(yōu)選閉端過濾盒的外殼，所述的過濾盒包括在設(shè)置固定相顆粒狀物的上游表面上的復(fù)合過濾介質(zhì)；“分離系統(tǒng)”是指包括位于儲液槽中的至少一種生物大分子溶質(zhì)的溶液混合物，分離過濾組件或者色譜柱，機泵和相關(guān)管道；“分離設(shè)備”是指一種容器，包括至少一種流體通過所述設(shè)備的裝置和將固定相顆粒狀物保留在設(shè)備之內(nèi)的裝置；“通量率”表示通過過濾元件的液流速度，等于流速除以過濾層的橫截面表面積。如這種方法描述，可以表征液流通量率，與過濾層的尺寸無關(guān)。通量率同樣成為整個濾器壓降的原因之一，即增加通量率通常意謂著增加系統(tǒng)壓力。在工業(yè)用過濾盒應(yīng)用場合中，高度希望提供最小尺寸能處理最大量液流的過濾器。因此，最好通過增加流速增加通量率；“固定相顆粒狀物”是指可以與溶液混合物中所關(guān)心的組分形成結(jié)合締合的不溶性顆粒狀物。特定的結(jié)合締合包括吸附，離子交換，疏水和親和性相互作用；“不可溶的”表示在23℃100份溶劑中溶解不超過1份顆粒狀物；和“過濾盒壓力”表示在分離系統(tǒng)中貫穿整個過濾盒單元在進口或者上游與出口或者下游之間的壓力差。
本發(fā)明方法克服現(xiàn)有技術(shù)包括常規(guī)的用于分離生物大分子的大孔顆粒狀物過濾器的問題。包括在過濾元件之內(nèi)的固定相顆粒狀物的現(xiàn)有技術(shù)過濾器存在制造難題，僅提供有限的容量。顆粒狀物的較高載荷導(dǎo)致過濾元件孔隙度減少，伴隨操作系統(tǒng)壓力增加。本發(fā)明通過在相對低過濾盒壓力下提供高載荷容量的顆粒狀物克服這些現(xiàn)有技術(shù)過濾器的問題。
附圖簡述

圖1是包括過濾層的復(fù)合過濾介質(zhì)橫截面的示意圖，所述的過濾層包括位于其上游表面上的固定相顆粒狀物的層；圖2是在本發(fā)明復(fù)合過濾介質(zhì)上壓花圖案的透視圖；圖3是本發(fā)明圓柱折疊過濾器元件的透視圖；圖4是本發(fā)明筒式過濾盒的支承構(gòu)件的透視圖；圖5是本發(fā)明分離過濾組件的透視圖；圖6是本發(fā)明分離系統(tǒng)的示意圖；附圖的詳細說明圖1是復(fù)合過濾介質(zhì)10的橫截面示意圖，包括優(yōu)選的非紡織織物作為表面過濾層11，所述的表面過濾層11可以是一個或多個單層，不可溶的固定相顆粒狀物12位于表面過濾層11的上游表面上。具有均勻的孔隙度和恰當(dāng)限定的孔的所述非紡織過濾層11可以包含粗糙的上游預(yù)濾層13，包括多個越來越多更微細下游孔隙度的非紡織過濾層的過濾層14，和下游的非紡織覆蓋層15。
圖2是本發(fā)明優(yōu)選方案的舉例說明。顯示了在用于生產(chǎn)過濾盒的復(fù)合過濾介質(zhì)20上壓花形狀圖樣22的非折疊部分。進行壓花以增加正面表面積，更完全地限定表面過濾元件。為清楚起見，在舉例說明中省略不可溶的固定相顆粒狀物。
圖3是本發(fā)明優(yōu)選方案縱向延長圓柱折疊過濾器元件30的透視圖；本發(fā)明優(yōu)選的復(fù)合徑向折疊過濾元件30的徑向褶層32；再次，為清楚起見，省略固定相顆粒狀物。
圖4是說明本發(fā)明優(yōu)選方案的筒式過濾盒40的內(nèi)部和外部輔助支承構(gòu)件的透視圖。外部支承結(jié)構(gòu)41，例如具有許多空穴的纖維織品或者篩網(wǎng)，以內(nèi)外流體流動模式可以提供另外的支撐以減少過濾元件破裂的可能性。類似地，由纖維織品或者篩網(wǎng)或者多孔外殼或者類似的結(jié)構(gòu)組成的內(nèi)部支承結(jié)構(gòu)42可以提供支撐，以防止過濾元件(未示意)在優(yōu)選外內(nèi)流體流動情況高壓應(yīng)用場合下坍塌。在兩種情況下，所述輔助的支承結(jié)構(gòu)通常連接到過濾盒的末端43以提供整體部件。
圖5是本發(fā)明優(yōu)選方案的分離過濾組件70的透視圖。過濾外殼71包含過濾盒(未示意)。在分離回路中，入口72可使溶液混合物以優(yōu)選的外內(nèi)模式進入所述過濾盒。所述液體通過出口73離開分離過濾組件70。在優(yōu)選組件中，分離端蓋74通過機械夾具75使用具有張力調(diào)節(jié)控制旋鈕76的螺栓(未示意)結(jié)合到過濾外殼71上。在分離回路中，入口77可以使去結(jié)合的溶液以優(yōu)選的外內(nèi)模式進入過濾盒，現(xiàn)在包括希望的生物大分子溶質(zhì)的所述產(chǎn)品溶液通過出口78離開分離過濾組件。
圖6是本發(fā)明分離系統(tǒng)80的示意圖。儲液槽81包含固定相顆粒狀物漿料水溶液82和/或生物大分子溶液混合物82，同時通過攪拌裝置83提供攪拌。通過機泵85從出口管84將漿料或者溶液82泵送通入分離過濾組件86(包含位于過濾盒過濾層上游表面上的固定相顆粒狀物(未顯示))，并通過入口管87(箭頭記號顯示液體流動方向)返回所述儲液槽。
詳細描述本發(fā)明提供一種分離和提純生物大分子的包括分離過濾組件的制品和方法，所述的分離過濾組件包括在過濾層上游表面上含有可以結(jié)合生物大分子的固定相顆粒狀物的復(fù)合過濾介質(zhì)。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種使用分離設(shè)備大規(guī)模生物分離的方法，所述的分離設(shè)備包括在過濾層上游表面上可以結(jié)合生物大分子的固定相顆粒狀物。所述固定相顆粒狀物可以包含平均直徑小于50μm的有機的或者無機的粒子，柔軟的顆粒狀物和壓碎的多孔整塊材料。
所述分離過濾組件包括液體過濾盒，所述的液體過濾盒包括上述的復(fù)合過濾介質(zhì)和適當(dāng)?shù)挠糜趯⑦^濾元件連接到包括一種或者優(yōu)選兩種或多種生物大分子的溶液儲液槽的盒外殼。所述過濾盒通過適當(dāng)?shù)呐涔苓B接到能夠傳送所述溶液的機泵，所述的溶液可以包括選擇的要分離的生物大分子，通過結(jié)合到顆粒狀物或者洗脫溶液可以釋放結(jié)合的生物大分子，通過復(fù)合過濾介質(zhì)并返回所述儲液槽，因此產(chǎn)品溶液可以重復(fù)循環(huán)通過復(fù)合過濾介質(zhì)用于更進一步捕獲自由生物大分子以完成分離，或者如果希望，以洗脫結(jié)合的生物大分子。所述制品和方法在大規(guī)模生物分離中是有用的。
更特別，本發(fā)明提供一種分離或者提純生物大分子的方法，所述方法包括如下的步驟1)提供分離系統(tǒng)，包括過濾盒(優(yōu)選閉端過濾盒)，所述的過濾盒包括復(fù)合過濾介質(zhì)，能夠吸附，離子交換，疏水或者親和性與生物大分子結(jié)合的固定相顆粒狀物(如本發(fā)明描述)位于復(fù)合過濾介質(zhì)上游表面上，儲液槽，包括含一種或多種生物大分子溶質(zhì)的溶液混合物，機泵和相關(guān)配管(優(yōu)選形成閉環(huán)系統(tǒng))；2)泵送所述溶液混合物通過過濾盒組件以完成選擇的生物大分子與固定相顆粒狀物的結(jié)合(任選再循環(huán))，所述通過過濾元件的泵送在通量率至少0.01厘米/分鐘，優(yōu)選至少0.10厘米/分鐘，更優(yōu)選至少0.30厘米/分鐘的通量率，過濾盒壓力最多0.34MPa，優(yōu)選最多0.25MPa下進行；3)任選，在開路或者一道工序中，用適當(dāng)?shù)囊后w洗滌所述生物大分子固定相顆粒狀物產(chǎn)物以除去不希望有的生物大分子及其他未與固定相顆粒狀物通過選擇吸附，離子交換，疏水或者親和性結(jié)合相互作用結(jié)合的溶質(zhì)；和
4)任選泵送，優(yōu)選體積減少的(與原始溶液混合物體積相比)去結(jié)合溶液，所述的去結(jié)合溶液使生物大分子固定相顆粒狀物結(jié)合相互作用反轉(zhuǎn)以釋放分離的和提純的生物大分子。
通過過濾液流除去顆粒狀物可以通過應(yīng)用以下的過濾機制的一種或多種完成，由每一機制操作的液體過濾盒現(xiàn)今是市場上可買到的。本發(fā)明利用這些過濾機制，由此在流動分離系統(tǒng)中所述過濾層保持固定相顆粒狀物i)深層過濾-該方法是其中包括顆粒狀物的液流迎頭與過濾元件相遇的方法，所述的過濾元件具有選擇尺寸的空穴或者孔分布并提供顆粒狀物相當(dāng)彎曲通道通過所述過濾層。在現(xiàn)有技術(shù)中，顆粒狀物主要通過吸附和/或夾持在過濾層本身之內(nèi)而除去。深層過濾，通常為應(yīng)用于系統(tǒng)粗糙或者頭道過濾步驟，設(shè)計成能除去大小從幾百μm(最大直徑尺寸)到大約1μm的顆粒狀物，存在由于孔徑大小限定不清楚而顆粒狀物除去不完全，以及當(dāng)過濾器載荷時過濾盒壓力穩(wěn)定迅速增加的問題。
ii)表面(濾餅)過濾--該方法是本發(fā)明優(yōu)選的，在液流處理中通常在深部過濾之后進行。在現(xiàn)有技術(shù)中，通常使用多層的具有界限分明的孔徑大小的玻璃或者聚合物微纖維進行，在所述過濾層之內(nèi)，所述顆粒狀物通常不穿透，但是保持被捕獲在所述層的上游表面上。顆粒狀物尺寸降至大約0.1μm可以高效率地載荷。容易實現(xiàn)高的通量率，相對大量的顆粒狀物在相對低的系統(tǒng)壓力下載荷直到過濾器接近完全。在本發(fā)明中，有利的是在過濾層表面上載荷，或者通過多路反向液體流重新排列過濾層表面上過濾的粒子；對于深層過濾不存在該機會。
iii)膜(濾網(wǎng)或者篩分)過濾--該過濾機制十分類似于表面過濾，不同之處在于存在準(zhǔn)確限定的微細的孔，所述的微細的孔能夠載荷尺寸低到0.05μm的顆粒狀物。
本發(fā)明可以用于切向流動和“封端”的筒式過濾器。在切向流動或者徑向膜的筒式過濾器中，所述過濾元件存在于與液流流動平行的平面內(nèi)，產(chǎn)生兩種流出物或者滲透物一個過濾(或者通過過濾元件進行處理)，另外的一個不過濾。盡管這些過濾器裝置在低壓下操作，理論上未處理的滲透物可以再循環(huán)，但這些體系本質(zhì)上更復(fù)雜，更慢地完全處理液流，因為通過所述元件的流動相對低；同樣，如果過濾元件以某種方式進行改變以保留生物大分子，那么需要在一次通過所述元件時實現(xiàn)完全固持。
在“閉端”過濾器中，所有的液流需要通過元件，僅產(chǎn)生一種滲透物?？紤]作為通過與在過濾元件上或者在過濾元件之內(nèi)的固定相相互作用實現(xiàn)分離的分離單元，閉端筒式過濾器類似于十分寬但是薄層的柱。在高流速下，生物大分子的單程固持率可能相對低，但是通過反復(fù)循環(huán)，可以保持生物大分子高的流出物百分數(shù)。
本發(fā)明的有用的表面過濾盒包括US 3,058,594中標(biāo)準(zhǔn)直立的折疊過濾器，特別優(yōu)選的，U.S.4,842,739中的水平的復(fù)合徑向折疊過濾器。本發(fā)明中優(yōu)選水平的褶層結(jié)構(gòu)(如圖3所示)，因為過濾盒通常直立使用，當(dāng)流動中止時更大百分數(shù)的粒子保持在水平的褶層之內(nèi)，在使用之間貯藏盒。所述水平的褶層結(jié)構(gòu)通常允許將更大量的過濾層表面積充填到盒中，因此比在直立折疊盒情況下導(dǎo)致更大的顆粒狀物負載容量。同樣可以使用其他的過濾盒例如纏繞線的，結(jié)合樹脂的，和噴紡的深層過濾器，但通常缺乏如表面型濾油器一樣有能力接受作為顆粒狀物，同時保持相對低的系統(tǒng)壓力。
可以從Ametek/US Filter(Warrendale，PA)獲得具有過濾元件材料，例如，纖維素，纖維素-聚酯，玻璃-纖維素，聚酯，聚丙烯和陶瓷，以及平均標(biāo)稱孔徑例如1，2，3，5，10，20，30，和50μm的各種尺寸的標(biāo)準(zhǔn)圓柱的，直立的折疊過濾盒。優(yōu)選圓柱的，復(fù)合水平徑向折疊的所有聚丙烯結(jié)構(gòu)表面過濾盒可以從3M Filtration Products(St.Paul，Minn.)以各種尺寸購買，平均標(biāo)稱孔徑為2，5，10，和20μm。用于較小規(guī)模分離的小的一次性使用的膜盒過濾器可以從Pall Corporation(East Hills，NY)以各種尺寸獲得，含有過濾元件材料，例如，聚酰胺例如丙烯酸涂敷的尼龍，和聚丙烯，平均標(biāo)稱孔徑，例如為1，3和5μm。
盡管結(jié)合(分離步驟)和洗脫或者去結(jié)合(分離步驟)相互作用可以使用從過濾盒制造商得到的過濾盒外殼進行，但這些外殼通常僅具有一套進口和出口。因此，當(dāng)引入去結(jié)合溶液時，難以實現(xiàn)所希望的高濃度提純的生物大分子。優(yōu)選的過濾盒外殼具有另外尺寸較小的一套進口和出口?？梢杂欣厥褂迷撎纵^小的孔口通常以顯著減少的溶液總體積實現(xiàn)所述生物大分子的去結(jié)合，因此在處理中也可在更濃縮的溶液中獲得提純的生物大分子。
優(yōu)選，本發(fā)明過濾介質(zhì)的構(gòu)造包括在上游表面上的一個或多個非紡織層，在那個上游表面上隨機布置不可溶的固定相顆粒狀物。從機械學(xué)的觀點和使用的溶劑而言，當(dāng)進行生物分離時過濾介質(zhì)的結(jié)構(gòu)不是關(guān)鍵性的，因為幾乎唯一地使用水，基本上所有上述特定的過濾層材料通常在水中表現(xiàn)很好。優(yōu)選的材料是聚丙烯，因為其可供應(yīng)性，成本和惰性。
過濾層孔徑大小的選擇直接依賴于在其上游表面上要保持的固定相顆粒狀物的尺寸范圍，通常對應(yīng)于最小的顆粒狀物尺寸。然而，已經(jīng)確定即使顆粒狀物的一部分具有小于過濾層孔徑大小的尺寸，也可以獲得有用的復(fù)合過濾介質(zhì)。這些較小的顆粒狀物將在初期的循環(huán)中通過所述過濾元件，在后來的循環(huán)中，當(dāng)顆粒狀物床層累積時，所述設(shè)備呈現(xiàn)深層過濾器的性質(zhì)，本發(fā)明中也可以除去并利用這些較小的粒子。為時間效率和利用過濾盒的目的，然而在所述優(yōu)選的表面過濾模式中，優(yōu)選利用表面過濾盒單元，其中在首次通過所述過濾器中除去至少95％的所述固定相顆粒狀物。
通常，額定名義上平均尺寸為0.1-10μm的過濾盒滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，提供高效的用于本發(fā)明使用的顆粒狀物的過濾元件，以及能夠在低過濾盒壓力下輸送相對高的流量。平均孔徑小于0.1μm，例如多孔非纖維的膜的過濾層通常沒有用，因為它們不僅被來自可能存在的外來粒子，而且甚至通常被在高度濃縮生物溶液混合物中遇到的懸浮生物試樣堵塞。
對于本發(fā)明的目的，通過以下相互作用的一種或組合，固定相顆粒狀物與在溶液混合物中所關(guān)心的生物大分子結(jié)合或者強烈締合吸附，離子交換，疏水締合，和親和性結(jié)合。用于本發(fā)明的多于一種類型的活化吸附劑可以任何比例預(yù)混合。
用于本發(fā)明固定相顆粒狀物的尺寸范圍取決于使用的過濾盒的性質(zhì)，從其中小的部分例如小于5％是亞微米(最大的平均直徑)的分布到高達幾個毫米壓碎的整塊顆粒狀物，到1000μm柔軟的顆粒狀物，和到高達50μm的硬質(zhì)無機或者有機的顆粒狀物。
優(yōu)選柔軟的固定相顆粒狀物的粒子大小直徑為在亞微米到400μm范圍內(nèi)，更優(yōu)選1-200μm，最優(yōu)選5-100μm。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在有些情況下使用在寬范圍之內(nèi)的兩種或多種粒度范圍的顆粒材料是有利的。任何硬質(zhì)或者柔軟的顆粒狀物可以為球形，規(guī)則形狀或者不規(guī)則的形狀。壓碎的整塊顆粒狀物具有不規(guī)則的形狀。
使用本發(fā)明的復(fù)合過濾介質(zhì)，可以使用尺寸小于50μm的硬質(zhì)顆粒狀物。在一些實施方式中，可以使用尺寸小于30，20或者10μm的粒子。在此以前，這樣的“細粒物料”由于在充填和使用柱期間遇到的高壓而不認為有用。本發(fā)明的復(fù)合過濾器允許通常在小于0.34MPa壓力下使用這樣的細粒物料用于大規(guī)模的生物分離。特別是，使用尺寸小于50μm的粒子是有利的，因為較小直徑的粒子在吸附過程中具有較小的擴散阻擋層。因此，將小的粒子結(jié)合進入本發(fā)明的分離設(shè)備中可以導(dǎo)致在生物分離過程中快速的捕獲動力學(xué)和總的處理量增加。
在一些實施方式中，用于本發(fā)明的粒子與粒子重量相比具有高的吸水能力。在此以前，由于水的可膨脹性或者緩沖液或者pH變化而經(jīng)受尺寸變化的粒子認為是不太所希望的，因為它們在使用期間會引起尺寸變化。在填充色譜柱中這是特別不希望的，因為它會導(dǎo)致壓力的急劇變化引起溝流，或者限制流動。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的尺寸變化，典型柔軟的凝膠顆粒狀物的尺寸變化，在本發(fā)明的分離裝置中不產(chǎn)生不良影響。更進一步，與此相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種柔軟的凝膠顆粒狀物比常規(guī)的色譜法粒子具有更高的容量。
本發(fā)明重要的特征是使用具有相對高濃度涉及與所關(guān)心的生物大分子相互結(jié)合作用的官能團的顆粒狀物支撐體，通?？梢苑蛛x更大量的選擇的生物大分子。對于支撐體顆粒狀物，希望相對高的表面積以提供高濃度可利用的官能團。
優(yōu)選，所述顆粒狀物的表面積至少為10m2/g，更優(yōu)選至少為50m2/g，最優(yōu)選至少為100m2/g，并且甚至最高達5000m2/g(根據(jù)氣體吸附測量確定)。對于柔軟的或者凝膠類型顆粒狀物，官能團的濃度通?？梢酝ㄟ^降低交聯(lián)密度增加，這同樣導(dǎo)致柔軟的粒子。最佳的交聯(lián)密度取決于所述顆粒材料的化學(xué)組成。例如，對于瓊膠糖基支撐物，交聯(lián)密度小于6％將提供支撐物高的官能團密度和同時高的生物大分子容量。對于丙烯酸和苯乙烯基顆粒狀物，交聯(lián)密度小于20％將允許包含更大量的適當(dāng)?shù)墓倌軋F。
在溶質(zhì)和固定相顆粒狀物之間的各種各樣的相互作用可以包括相對弱的吸引力例如偶極-偶極，離子-偶極和離子-離子相互作用。在本發(fā)明中使分子量至少500的生物大分子有效結(jié)合的是在生物大分子和固定相之間相對大接觸面積上發(fā)生的這些相互作用中的幾種相互作用，導(dǎo)致最終強的吸引力。
利用在固定相上的極性基團和生物大分子上廣泛的多種多樣的極性基團的結(jié)合締合實現(xiàn)吸附分離。這些結(jié)合締合通常為偶極-偶極和離子-偶極相互作用的形式。所述提純操作的結(jié)合或者分離階段通常從相對低離子強度的水緩沖溶劑中進行，因此上述提到的在固定相和生物大分子溶質(zhì)之間結(jié)合締合可以達到最大值實現(xiàn)結(jié)合。在用低離子強度的緩沖水溶液洗滌之后，通常使用的洗脫溶液包含相對大量的溶解鹽并伴隨高離子強度，因此在固定相和溶解鹽之間的相互作用可從固定相中置換生物大分子，所述生物大分子再溶解，可以從分離系統(tǒng)中以更純的形式回收。
優(yōu)選的吸附固定相顆粒狀物包括羥磷灰石，氧化鋁和氧化鋯(公開在U.S.5,015,373)。離子交換分離利用許多生物大分子是離子帶電的事實。此外，許多這些離子帶電基團，例如質(zhì)子化的胺和羧酸酯，可以通過改變pH使其為中性和不帶電荷。這提供敏感和十分強大的基于它們等電點的分離生物大分子的技術(shù)，所述的等電點通常由pI值指示，所述的pI值是在此時存在電中和，或者在分子之內(nèi)帶陰電荷基團和帶陽電荷基團的數(shù)目相同的pH。如果pH保持大于pI，則陰離子交換樹脂可用于結(jié)合生物大分子；相反的，如果pH小于pI，則陽離子交換樹脂可以實現(xiàn)結(jié)合從所述溶液混合物中除去生物大分子。對于該技術(shù)，生物大分子上可利用的或者表面電荷甚至小的差異能導(dǎo)致有效的分離。在洗滌不溶解的生物大分子固定相顆粒狀物產(chǎn)物之后，通常通過引入相對高濃度的鹽溶液從離子交換固定相顆粒狀物洗脫結(jié)合的生物大分子，所述的鹽溶液可與固定相顆粒狀物中的生物大分子交換并替換生物大分子。做為選擇，通過改變洗脫溶液的pH完成洗脫。這種硬質(zhì)的無機顆粒狀物的平均粒子直徑小于50μm，優(yōu)選小于30μm。
顆粒狀物的聚合物基體可能包含多種物質(zhì)，包括而不是限于交聯(lián)瓊膠糖，交聯(lián)聚苯乙烯，親水聚醚樹脂，丙烯酸樹脂和甲基丙烯酸酯基樹脂。所述離子交換劑官能團組份可以包含但是不局限于選自磺丙基陽離子交換劑，羧甲基陽離子交換劑，磺酸交換劑和膦酸交換劑陽離子交換劑。在其他的實施方式中，離子交換劑組份可以為但是不局限于選自二乙氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)，和二甲基氨基乙基(DMAE)的陰離子交換劑。某種實施方式可以包括陽離子的，陰離子的和疏水性相互作用的組合。
有用的陰離子交換樹脂特征在于瓊膠糖，右旋糖酐和已經(jīng)被改性為包含叔和季銨基團的纖維素聚合物。陽離子交換樹脂特征在于相同的基礎(chǔ)聚合物，但是具有羰酸酯和磺酸酯基團。
有用的離子交換樹脂可以通過在Meitzner等人的U.S.4,501,826，4,382,124，4,297,220和4,224,415中描述的通用的技術(shù)制備。在一些實施方式中，使用較小量的交聯(lián)劑-足以生產(chǎn)凝膠顆粒狀物，而不是描述的大孔顆粒狀物。交聯(lián)劑的量可提供大于0.5的溶脹度，通常基于100份總的聚合物小于20重量份。基于丙烯酰胺類型單體有用的離子交換樹脂公開在受讓人共同未決專利申請U.S.S.N.10/849,700中。
疏水性相互作用和反相色譜法利用許多生物大分子的疏水性。生物大分子的疏水部分與固定相顆粒狀物的疏水官能團的相互作用導(dǎo)致結(jié)合締合，從所述溶液混合物中分離所述生物大分子。通常通過相對高離子強度水溶液的結(jié)合實施所述方法。在該方式中，所述生物大分子的溶解性開始有點兒不確定，幾乎從溶液中“鹽析”，容易與疏水載體結(jié)合。通常通過使用離子強度減少的水溶液(并增加所述生物大分子的溶劑效率)實施洗脫；做為選擇，含量最高達50重量百分數(shù)的有機溶劑例如丙酮，乙腈，乙醇，甲醇，和N，N-二甲基甲酰胺，可以與作為共溶劑的水使用從含有固定相顆粒狀物不可溶的復(fù)合物除去所述生物大分子。
有用的疏水性相互作用固定相顆粒狀物包括但是不局限于通過夾雜例如丁基，辛基和苯基改性的瓊膠糖基支撐物和丙烯酸支撐物。有用的反相顆粒狀物包括但是不局限于苯乙烯-二乙烯基苯支撐物和有機硅烷改性的二氧化硅支撐物。
通常通過將配位體或者生物特性的效應(yīng)物共價結(jié)合到固定相顆粒狀物操作親和色譜法。選擇該配位體或者效應(yīng)物，因為其具有通過“加鎖和開鎖”關(guān)系與生物大分子相互作用的能力。如果例如蛋白質(zhì)是希望分離的生物大分子，那么通常共價結(jié)合的配位體或者效應(yīng)物是與所述蛋白質(zhì)活性部位(“加鎖”)強烈結(jié)合的基材或者抑制劑(“開鎖”分子)。該過程的高選擇性可以允許從復(fù)雜混合物中一步提純生物大分子。盡管洗脫通常通過簡單改變pH實現(xiàn)，但對于每一生物大分子-配位體對的去結(jié)合溶液和技術(shù)是特定的，可以從廠商獲得具體的指導(dǎo)。
有用的親和色譜固定相顆粒狀物具有多種基質(zhì)，包括瓊膠糖，纖維素，和(對于相應(yīng)的生物大分子親和力)具有幾個配位體的乙烯基聚合物，所述的配位體包括精氨酸和芐脒(絲氨酸蛋白酶)，汽巴克隆(活性染料)藍色(需要酶的腺嘌呤-包括協(xié)同因子，白蛋白，組織凝血活酶，干擾素)，鈣調(diào)素(腺苷三磷酸酶，蛋白激酶，磷酸二酯，神經(jīng)遞質(zhì))，凝膠(纖維結(jié)合蛋白)，谷胱甘肽(絲氨酸轉(zhuǎn)移酶，谷胱甘肽相關(guān)的蛋白質(zhì)，融合附加物)，肝素(增長因子，凝結(jié)蛋白質(zhì)，類固醇受體，限制性核酸內(nèi)切酶，脂蛋白，脂肪酶)，蛋白質(zhì)A和G(IgG和亞綱)，L-賴氨酸(纖溶酶原，血纖維蛋白溶解酶原活化劑，核糖體RNA)，普施安紅顏料，(NADP+相關(guān)的酶，羧肽酶G)，刀豆素A和植物凝血素(糖蛋白，膜蛋白，糖脂，聚糖)，和DNA(DNA聚合酶，RNA聚合酶，T-4多核苷酸激酶，核酸外切酶)。
使用本發(fā)明的復(fù)合過濾介質(zhì)，可以使用尺寸小于50μm的固定相粒子大小。在此以前，這樣的“細粒物料”由于在充填和使用柱期間遇到的高壓而不認為有用。令人驚訝地，本發(fā)明的復(fù)合過濾器允許使用這種細粒物料在壓力小于大約50psi(0.34MPa)下用于大規(guī)模生物分離。更進一步地，可以使用柔軟的顆粒狀物。在此以前，柔軟的顆粒狀物不認為對于制備分離有用，由于所述膠粒變形導(dǎo)致高壓和/或低流速。
在優(yōu)選方案中，壓碎或者磨碎的整塊樹脂可以用作吸附劑固定相顆粒狀物。在傳統(tǒng)的整塊材料中，色譜柱填充有必需的單體和生孔劑，原位聚合形成固體連續(xù)的樹脂填塞料。在此以前該方法僅適用于在相對小規(guī)模的柱中分離。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些整塊材料可以在適當(dāng)?shù)娜萜髦兄苽湟援a(chǎn)生填塞料，然后磨碎生產(chǎn)不規(guī)則形狀的粒子。這些生產(chǎn)的粒子具有相對寬廣的粒度分布(通常大約0.1-1000μm)，可以用于本發(fā)明的復(fù)合過濾器中。在該方式中，整塊材料獨特的孔隙度和動力學(xué)吸附能力可以適應(yīng)大規(guī)模的生物分離。如果需要，磨碎的不規(guī)則形狀的粒子可以按大小篩分，或者如剛生產(chǎn)的形式使用。在此以前，通過懸浮聚合生產(chǎn)的規(guī)則的成形(即圓球形的)粒子篩分為窄范圍的粒子大小和/或除去所述細粒。這種細粒，如果不除去，將塞滿在較大的粒子之間的孔隙空間，減少流動和/或顯著地增加壓力。未分級的磨碎的整塊粒子不需要這種分級，或者除去細粒，可以用于本發(fā)明的復(fù)合過濾器，同時保持足夠的流動并避免超過50psi(0.34MPa)的高壓。
所述聚合物整料由存在于混合物中的單體組成，所述的混合物適于原位聚合導(dǎo)致形成這種多孔整塊的聚合物。這種混合物例如包括單體或者單體，生孔劑和引發(fā)劑的混合物。
通常，所述聚合物整料包括聚合的單體單元，帶有親水基，親水基的前體，可電離的基團或者其前體，疏水基或者其前體，或者它們的混合物。任選，所述聚合物整料也可以包含親和配體。上述單體單元的任意組合意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在包含聚合的帶有親水基或者親水基前體的單體單元的所述多孔聚合物整料中，這種單體通常是丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯或者苯乙烯，其選自2-甲基丙烯酸羥乙酯，甲基丙烯酸丁酯，丙烯酸2-羥乙酯，甲基丙烯酸縮水甘油酯，丙烯酸縮水甘油酯，乙酰氧基苯乙烯，氯甲基苯乙烯，叔丁氧基羰基氧苯乙烯和其組合。
在包含帶有疏水基或者疏水基前體的聚合單體單元的所述多孔聚合物整料中，這種單體通常選自丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酸酯酰胺，甲基丙烯酸酯酰胺，苯乙烯，苯乙烯衍生物和其組合，其中包括疏水基的所述優(yōu)選的單體是丙烯酸烷基酯，甲基丙烯酸烷基酯，苯乙烯，烷基苯乙烯或者其組合。
在包含帶有可電離的基團或者所述可電離基團前體的聚合單體單元的多孔聚合物整料中，這種聚合單體通常包含官能度例如氨基，羧基，磺酸基和磷酸基團(或者其鹽)，其中優(yōu)選可電離的單體選自丙烯酸，甲基丙烯酸，衣康酸，馬來酐，苯乙烯磺酸，2-丙烯酰氨基-2-甲基-3-丙磺酸，2-(甲基丙烯酰氧基)磷酸三乙酯，氨基酸的丙烯酰胺，氨基酸的甲基丙烯酸酰胺，2-乙烯吡淀，4-乙烯吡淀，2-(二烷基氨基)丙烯酸乙酯，2-(二烷基氨基)甲基丙烯酸乙酯，2-(嗎啉代)丙烯酸乙酯，2-(嗎啉代)甲基丙烯酸乙酯，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基銨氯化物，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基銨硫酸單甲酯，和其組合物。用于制造所述整料的優(yōu)選單體是丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯和其衍生物。
所述多孔聚合物整料另外包括交聯(lián)單體。所述交聯(lián)單體優(yōu)選是多乙烯基單體，其選自二丙烯酸酯，二甲基丙烯酸酯，三丙烯酸酯，三甲基丙烯酸酯，二丙烯酰胺，二甲基丙烯酰胺，或者二乙烯基芳香單體，其中優(yōu)選的多乙烯基單體是二丙烯酸乙二酯，二甲基丙烯酸乙酯，三羥甲基丙烷三丙烯酸酯，三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，或者哌嗪二丙烯酰胺，二乙烯基苯或者二乙烯基萘。
在一個優(yōu)選方案中，所述多孔聚合物整料包括大約10-大約90％的一種或多種單乙烯基單體，大約5-大約90％的一種或多種多乙烯基單體和相對于所述單體大約0.01-大約2％的引發(fā)劑。
本發(fā)明多孔聚合物整料也可以任選包含大約1-大約50％的親和配體。所述配位體在已經(jīng)形成的整料之內(nèi)共價固定化，或者以單體形式加入到聚合物混合物中之后聚合。所述配位體可以是生物或者合成化合物，其中所述生物親和配體選自聚糖，抗體，酶，植物凝血素，抗原，細胞表面受體，細胞內(nèi)受體，病毒外殼蛋白，DNA，和其混合物，和其中所述合成親和配體選自活性染料，鞣酸，五倍子酸，亞氨基二乙酸，亞乙基二胺三乙酸，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基(3-磺丙基)氫氧化銨惰性鹽，和其混合物。
為實現(xiàn)希望的孔結(jié)構(gòu)，聚合通常包括成孔材料。它們的功能首先溶解所有的單體和引發(fā)劑，然后形成均勻的溶液，第三在聚合期間控制相分離過程。
通常，所述成孔材料是水，有機溶劑或者其混合物。所述成孔有機溶劑選自烴，醇，酮，醛，有機酸酯，醚，可溶性聚合物溶液，和其混合物，例如環(huán)己醇，1-十二烷醇，甲醇，己烷，丙醇，十二烷醇，乙二醇，聚乙二醇，丁二醇，甲基-叔丁基醚，二異丙基甲酮，乙酸丁醇乙酯，醋酸丁酯，聚(甲基丙烯酸甲酯)和其混合物。所述成孔材料通常的含量為大約30vol％-大約80vol％，優(yōu)選大約40vol％-大約60vol％。
本發(fā)明的整料通過原位引發(fā)聚合制造。原位聚合可以是當(dāng)這種混合物沉積在?；蛘咂渌倪m當(dāng)容器之內(nèi)，將所述聚合混合物有效聚合為整體結(jié)構(gòu)的任意過程或者方法。所述原位聚合過程生產(chǎn)多孔質(zhì)固體整料。這種過程可以通過加熱，氧化還原反應(yīng)或者光引發(fā)作用引發(fā)。
各種各樣的整塊聚合物材料在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。參見Frechetet al.，Adv.Matls.，1999，vol.11，No.14，pp.1169-1181和在其中的參考資料，及U.S.5,453,185，U.S.5,334,310，和6,887,384。一種有用的用于形成所述聚合整料的技術(shù)見U.S.申請公開2004/0166534(Roscoe et al.)中。
通常聚合為整塊聚合物之后除去成孔材料。然后磨碎或者壓碎聚合的整料得到粒徑分布為大約0.1-1000μm不規(guī)則形狀的粒子。所述孔徑大小范圍取決于選擇的聚合混合物，特別取決于成孔材料的使用。得到的孔徑大小通常小于大約200μm，優(yōu)選小于100μm，更優(yōu)選小于50μm。
可以使用任意適當(dāng)?shù)哪ニ榛蛘邏核榧夹g(shù)，所述聚合物可以冷卻到低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以便于磨碎。
因此已經(jīng)描述了過濾盒，過濾器外殼和固定相顆粒狀物，現(xiàn)在詳述制備所述分離系統(tǒng)的方法。所述方法包括如下的步驟i)提供包括過濾盒的組件，包括包含在外殼中的本發(fā)明的復(fù)合過濾介質(zhì)，和能夠輸送流速至少0.01cm/分鐘的機泵和相關(guān)配管；ii)將包括至少一種生物大分子溶質(zhì)的生物溶液混合物引入到儲液槽中，因此在所述分離過濾組件中經(jīng)受循環(huán)實現(xiàn)生物大分子的分離。
所述復(fù)合過濾器包括平均粒度小于50μm的固定相顆粒狀物，柔軟的顆粒狀物或者壓碎的整塊顆粒狀物能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的生物分離，即能夠分離和/或提純在體積100升或更大的生物反應(yīng)堆中產(chǎn)生的生物大分子產(chǎn)物。在許多實施方式中，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的1000升，和10,000升或更大的分離。
用于本發(fā)明的機泵提供通過所述過濾盒的流速超過0.01厘米/分鐘，優(yōu)選超過0.10厘米/分鐘，更優(yōu)選超過0.30厘米/分鐘。流動通過它們的至少一種包括多于一種生物大分子溶質(zhì)的漿料和溶液混合物的所述機泵和相關(guān)的墊圈和配管/管路，優(yōu)選相對地化學(xué)上不受所述溶液的影響。優(yōu)選機泵包括蠕動泵，薄膜泵，齒輪泵和離心驅(qū)動泵，其中接觸所述溶液的實際的機泵組件由不銹鋼或者聚四氟乙烯(PTFE)建造。大多數(shù)類型的橡膠或者塑料管/管路適于在水中介質(zhì)中實施填裝和分離，但是如果使用有機溶劑的水溶液混合物，則優(yōu)選使用聚丙烯，聚乙烯，聚四氟乙烯，不銹鋼和玻璃管。優(yōu)選成為過濾盒與過濾器外殼與其余分離系統(tǒng)連接的界面的襯墊料包括聚四氟乙烯和聚丙烯。
所述過濾盒可以通過包括如下步驟的“濕的”密封技術(shù)進行載荷i)提供包括過濾盒的組件，包括包含在外殼中的本發(fā)明的復(fù)合過濾介質(zhì)，和能夠輸送流速至少0.01厘米/分鐘的機泵和相關(guān)配管；ii)提供在適當(dāng)溶劑中的顆粒狀物的漿料；和iii)以循環(huán)模式將漿料泵送通過所述過濾盒，直到固定相顆粒狀物已經(jīng)載荷希望的量；優(yōu)選所述過濾盒壓力小于大約0.15MPa，更優(yōu)選小于0.10MPa，最優(yōu)選小于0.05MPa。
與常規(guī)的“干燥”充填制造工藝相反，將“濕的”顆粒狀物通過利用液體載體充填在過濾層上可保證所述顆粒狀物位于過濾元件隨后可接觸溶液混合物的區(qū)域內(nèi)。因為不預(yù)先選定它們的位置，顆粒狀物隨機位于過濾層上，盡管液體載體的流動可能影響顆粒狀物最后的位置。在通過上述方法充填所述過濾盒中，在每一次充填期間，希望使用在液體中相當(dāng)稀濃度的顆粒狀物以實現(xiàn)過濾元件相對均勻的部分載荷。所述顆粒狀物以逐份(加入)方式加入到儲液槽中(在沒有溶劑的情況下，如果適當(dāng)?shù)臐?，用水潤濕或者預(yù)泥漿化)，在每一次配送之間目視識別儲液槽中的容量。
填充操作的流速優(yōu)選至少為0.01厘米/分鐘，更優(yōu)選至少0.10厘米/分鐘，最優(yōu)選至少0.30厘米/分鐘。在分離階段期間除數(shù)量和時間上高效地分離希望的生物大分子之外，在顆粒負載階段期間，相對高的流速是希望的，特別對于優(yōu)選的復(fù)合徑向折疊過濾盒，因此所述顆粒狀物可以更好地透過折疊過濾器元件的折層，因此接觸更多的過濾元件從而有利于實現(xiàn)高載荷。用于淤漿化固定相顆粒狀物的液體通常是溶液混合物的溶劑，通常是水，優(yōu)選為緩沖的水。對于疏水性相互作用或者固定相顆粒狀物反轉(zhuǎn)，特別是在洗脫步驟中，有必要利用有機液體并與水結(jié)合使用。有用的有機液體包括含量最高達50重量百分數(shù)的甲醇，乙醇，異丙醇，乙腈，和N，N-二甲基甲酰胺。
將所述顆粒狀物裝入所述儲液槽中，最后填充到過濾元件的上游表面上，直到過濾盒壓力到達不超過0.15MPa，優(yōu)選不超過0.10MPa，更優(yōu)選不超過0.05MPa。對于滿載荷的優(yōu)選復(fù)合徑向折疊過濾盒而言，實際的過濾盒壓力極限大約為0.25MPa。作為應(yīng)用過濾盒的一般規(guī)則，當(dāng)過濾盒壓力達到超過大約0.05MPa時，隨后負載的另外的顆粒狀物導(dǎo)致越來越高的過濾盒壓力。然而，特別對于以下推薦的過濾盒壓力，傳送通過所述過濾盒的溶液流速保持很高，并在用于本發(fā)明目的希望的范圍內(nèi)。以這種方式，所述單元可以仍然響應(yīng)在隨后的分離和處理操作期間可能遇到的外來的顆粒狀物。對于實際運轉(zhuǎn)，通過保留一些微粒載荷容量，能防止由于過濾器堵塞導(dǎo)致的停車，可以延長過濾盒壽命。
所述裝填固定相顆粒狀物的過濾盒目前已準(zhǔn)備好用作分離過濾組件從通入的溶液混合物中分離生物大分子。所述分離過濾器組件和盒在圖1-5中用圖解法舉例說明。
在裝填所述顆粒狀物提供復(fù)合過濾介質(zhì)之后，從所述儲液槽(或者保留連接，如果所述充填儲液槽同樣起分離儲液槽作用)移去進口和出口配管端，連接到包括生物溶液混合物的儲液槽。生物溶液混合物可以包含多于一種生物大分子溶質(zhì)。希望的生物大分子可以源自于發(fā)酵介質(zhì)，細胞裂解液，和體液，例如血，和血成分，腹水和尿。
通常希望在最短的一段時間獲得最大量的提純生物大分子，即高生產(chǎn)量。高生產(chǎn)量通常在文獻中定量為生產(chǎn)能力(或者生產(chǎn)率)，或者每一升色譜法樹脂每小時提純的產(chǎn)物量。Fahrner等人在Biotechnol.Appl.Biochem.，1999，30，121-128中已經(jīng)報告市場上可買到的蛋白質(zhì)A樹脂的典型的生產(chǎn)量為13-23g/L/hr。使用本發(fā)明的分離系統(tǒng)，可以實現(xiàn)俘獲效率和/或生產(chǎn)量＞25g/l/hr，＞40g/l/hr，＞70g/l/hr，和＞100g/l/hr。溶液混合物通過復(fù)合過濾介質(zhì)的速度即流速，和(溶液混合物)循環(huán)已經(jīng)確定認為是本發(fā)明性能重要的標(biāo)準(zhǔn)。一個十分重要的因素是本發(fā)明的分離過濾組件主要因為低壓運轉(zhuǎn)因此容許在給定時間處理較大量的溶液混合物。其他的有助于本發(fā)明分離過濾組件高效率的因素是1)利用具有相對高表面面積的較少固定相顆粒狀物的能力，與在填充柱中較大的粒子相比減少擴散限制；2)生物大分子溶質(zhì)和固定相顆粒狀物在高流速下更好地切剪混合；和3)在更高流速下接觸更大量的深含在過濾元件褶層或者折層之內(nèi)的顆粒狀物。溶液混合物通過的流速至少0.01厘米/分鐘是優(yōu)選的，更優(yōu)選至少0.10厘米/分鐘，最優(yōu)選至少0.30厘米/分鐘。
本發(fā)明的過濾元件在包括蛋白質(zhì)，碳水化合物，脂質(zhì)，核酸及其他生物試樣的多種生物分離中具有實用性。分離和提純的大分子是有用的治療的和診斷劑。
本發(fā)明的目的和優(yōu)點通過以下實施例進一步說明，但是在這些實施例中列舉的特定材料和其量，及其它的條件和細節(jié)，不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)亟忉尀閷Ρ景l(fā)明的限制。
實施例這些實施例僅僅是用于說明性的目的，而不意謂著是對附加權(quán)利要求范圍的限制。在實施例中和說明書其余地方所有的份數(shù)，百分數(shù)，比率等是按重量計算，除非另外注釋。使用的溶劑及其他試劑從Sigma-Aldrich Chemical Company；Milwaukee，Wisconsin獲得，除非另外注明。
試驗方法對于溶菌酶的陽離子交換容量用1ml的離子交換樹脂填充0.8×4厘米一次性使用的聚丙烯色譜柱(Poly-Prep Column，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。通過用ml的荷載緩沖液，pH為7.5的10mM的MOPS(4-嗎啉代丙烷磺酸)溶液，洗滌使柱床層平衡。所述柱床層然后裝填30ml在MOPS緩沖液中濃度為12mg/ml的蛋白質(zhì)溶液(雞蛋白溶菌酶，約95％純度，Sigma ChemicalCo.)。所有的緩沖液和蛋白質(zhì)溶液用去離子水制備。用30ml的MOPS緩沖液(三個10ml份)洗去任何非結(jié)合的溶菌酶。最后，用在MOPS緩沖液中15ml的1M NaCl洗出結(jié)合的蛋白質(zhì)。
通過使用Hewlett-Packard Diode Array Spectrophotometer，Model8452A測量在280nm處的紫外線吸收確定在不同部分中回收的蛋白質(zhì)量。使用純?nèi)芫钢苽錁?biāo)準(zhǔn)曲線。在NaCl洗脫物中回收的蛋白質(zhì)量等于支撐體的平衡陽離子交換容量。
對于免疫球蛋白G(IgG)的陽離子交換容量通過混合小珠和水制備在去離子水中50％v/v的陽離子交換小珠的漿料，在3000相對離心力(rcf)下離心分離20分鐘，然后調(diào)整水量，因此總體積數(shù)是填充的小珠床層的兩倍。所述漿料充分地混合以懸浮小珠，然后400微升所述漿料樣品用移液管加入5毫升0.45μm醋酸纖維素Centrex MF離心式的微過濾器中(Schleicher & Schuell，availablethrough VWR，Eagan，MN)。通過在3000rcf下離心作用5分鐘除去水，用pH為4.5的包括80mM氯化鈉的4mL 50mM的乙酸鈉混合，再次在3000rcf下離心作用10分鐘。棄去濾液。然后，向包括所述小珠的過濾器中加入在相同的乙酸酯緩沖液中4.5mL人IgG(大約7mg/ml)樣品。通過翻滾混合所述混合物整夜，然后，通過在3000rcf下離心作用20分鐘從小珠中除去上層清液。
通過紫外光譜學(xué)分析濾液，比較(過濾后IgG溶液)在280納米處的吸收和所述起始IgG溶液在280納米處的吸收；所述差用于計算所述小珠的IgG容量。進行三次試驗并求平均數(shù)。
粒度測量使用Horiba LA-910 instrument(Horiba Laboratory Instruments，Irvine，CA)通過光散射測量粒度。
壓力/流動表征計算機控制試驗臺由1cm×10cm玻璃柱，柱端接頭，機泵，壓力計和適當(dāng)?shù)倪B接到包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)儲液槽的配管組成。所述柱用要測量的粒子填充。通過打開機泵開始流過所述柱，通常以2ml/min(大約150cm/hr)起始。保持以這個速度流動以確保壓降穩(wěn)定(通常5-15分鐘)，然后通過2或者4mL/min的增量增加流速，再次監(jiān)控整個柱的壓降。連續(xù)該過程直到柱失效。失效定義為壓力超過170psi，在該點計算機自動關(guān)閉所述系統(tǒng)。
通過蛋白質(zhì)A親和性捕獲人IgG通過泵送小珠漿料通過所述過濾器，繼之以泵送PBS緩沖液用于緩沖液交換，待試驗人IgG捕獲的粒子負載有蛋白質(zhì)A并填充在筒式過濾器上(Pall裝料機膜盒，5μm孔徑大小，300cm2的過濾層面積，或者CUNO Betapure膜過濾盒，2μm孔徑大小，900cm2的過濾層面積)。在從簡式過濾器外殼中排空緩沖液之后，人IgG溶液(在10mM pH為7.2的PBS中1.0mg/mL，500mL總體積)裝填進入所述儲液槽，泵送進入過濾盒外殼并返回到所述儲液槽再循環(huán)。流速為400mL/min，壓降小于35psi(0.24MPa)。再循環(huán)溶液4-30分鐘直到IgG俘獲率達到接近于零，這可通過280納米波長處紫外線吸收在線監(jiān)控IgG濃度確定。從所述過濾器外殼通過入口管排出所述溶液，通過洗滌洗脫俘獲的IgG以及緩沖液交換再生所述過濾盒中的小珠。在所述筒式過濾器中再生的小珠用于捕獲所述溶液中剩余的IgG。該循環(huán)重復(fù)5次以捕獲所述溶液中大部分的IgG(93-99％)。記錄每一循環(huán)中的捕獲性能和總的俘獲率。
縮寫詞表

制備實施例1如U.S.專利5,403,902中描述的通過反相懸浮聚合制備按重量計算35∶65的AMPS/MBA共聚物。聚合物穩(wěn)定劑(0.28克)，甲苯(132mL)和庚烷(243mL)加入到配備有機械攪拌器(攪拌速度450rpm)，氮氣進口，溫度計，有溫度控制器的加熱罩和冷凝器的燒瓶中。所述聚合穩(wěn)定劑是按重量計算91.8∶8.2的丙烯酸異辛酯和2-丙烯酰氨基異丁酰胺的共聚物(如Rasmussen等人，Makromol.Chem.，Macromol.Symp.，54/55，535-550(1992)中描述的制備)。在所述燒瓶中的非水溶液攪拌下加熱到35℃，用氮氣鼓泡15分鐘。
制備的水溶液包含MBA(9.10克)，AMPS(9.80克的按重量計50％的水溶液)，甲醇(50mL)和去離子水(45.1mL)。攪拌該第二溶液，在30-35℃加熱溶解MBA。向第二溶液中加入過硫酸鈉(0.5克)，進一步攪拌溶解所述過硫酸鹽。水溶液加入到包括非水溶液的反應(yīng)燒瓶中。攪拌得到的混合物并氮氣鼓泡5分鐘。加入TMEDA(0.5mL)引發(fā)聚合。所述反應(yīng)溫度迅速上升到42.5℃，然后緩慢降低。從添加TMEDA時刻起攪拌所述反應(yīng)混合物總共2.5小時，使用燒結(jié)玻璃漏斗過濾，用丙酮(5×250mL)洗滌，在室溫真空下干燥得到15.7克無色粒子。
制備實施例2-3遵循制備實施例1中描述的相同的反相聚合過程，其中調(diào)節(jié)試劑含量得到按重量計算65∶35的AMPS/MBA共聚物(制備實施例2)和按重量計算40∶60的AMPS/MBA共聚物(制備實施例3)。
實施例1通過如制備實施例2描述的反相懸浮聚合制備按重量計算65∶35的AMPS/MBA共聚物。測量溶菌酶平衡陽離子交換容量為160mg/mL。顯微鏡觀察顯示球狀顆粒直徑為大約10-200μm。試圖度量壓力/流動性質(zhì)導(dǎo)致在最低的流速下柱過度加壓。分級這些粒子樣品提供大約45-110μm的粒度范圍。該分級的樣品的壓力/流動表征在2mL/min(150cm/hr)下產(chǎn)生20psi的壓降(～0.14MPa)，但是在3mL/min(大約230cm/hr)下失效(＞170psi＝1.17MPa)。
評價在以下系統(tǒng)中未分級的小珠樣品過濾盒Pall Versapor盒，3μm孔徑大小，1480cm2的過濾層面積小珠AMPS/MBA(65/35)；5mL水合床體積負載溶菌酶溶液在10mM，pH＝7.5，1000mL MOPS中2mg/mL緩沖液10mM MOPS pH＝7.5
系統(tǒng)體積(外殼和配管的)450ml流速1120mL/minmL/min，壓降＜5psi步驟通過填充，排空和測量體積三次并平均結(jié)果確定系統(tǒng)體積。對于具體的機泵設(shè)值用秒表和量筒測量流速(同樣平均三次試驗的結(jié)果)。通過用50mL緩沖液制造小珠的漿料，然后將小珠填充在過濾器上。
該漿料分為兩份加入到一定體積(大約1000mL)的緩沖液中，然后泵送通過所述過濾器，使所述緩沖液在加入部分之間澄清。通過兩次漂洗原始的容器使殘余的小珠載荷，在漂洗澄清之后允許再循環(huán)所述緩沖液另外15分鐘。關(guān)閉機泵，將管線轉(zhuǎn)換到溶菌酶溶液，起動機泵開始再循環(huán)。再循環(huán)溶液90分鐘，將樣品定期移開度量(紫外線吸收)在載荷溶液中剩余溶菌酶的量。這些結(jié)果顯示于表1中。
對比例1通過如制備實施例3描述的反相懸浮聚合制備按重量計算40∶60的AMPS/MBA共聚物。分級形成的小珠以提供大約40-110μm的粒度范圍。溶菌酶的平衡容量的測量結(jié)果為113mg/mL。該篩分樣品的壓力/流動表征在10mL/min(760cm/hr)下產(chǎn)生穩(wěn)定的50psi(0.34MPa)的壓降，然后在較高流速下壓降略微增加，最后在＞1000cm/hr時失效。同樣在實施例1描述的系統(tǒng)中評價該小珠，所述結(jié)果顯示于表1中。
表1

NM＝未測量對比例2如制備實施例2描述的，從AMPS(36.4的50％的水溶液)，MBA(9.8g)，去離子水(31.8mL)和異丙醇100mL)通過反相懸浮聚合制備按重量計算65∶35的AMPS/MBA共聚物。測量的溶菌酶平衡陽離子交換容量為25mg/mL，測量的IgG的平衡陽離子交換容量是7mg/mL。
實施例2制備具有與比較實施例2含水相相同組成的整塊的介質(zhì)?；旌螹BA(0.993g)，50wt％的AMPS水溶液(3.649)，去離子水(2.88mL)和異丙醇(10mL)，在玻璃容器中溫和加熱并攪拌。在所述混合物完全溶解之后，將它輸送到聚乙烯小袋(大約10cm×7cm×0.15mm壁厚)中，過硫酸鈉(0.0512g)的水(0.3mL)溶液和TMEDA(0.05mL)一起加入。立即熱密封小袋，然后在室溫下定軌振蕩器上輕輕搖動。切開小袋，將聚合物物質(zhì)輸送到過濾器漏斗，其中用水然后用丙酮充分洗滌它，在真空下干燥過夜。所述干燥樣品用研缽和研棒輕輕地磨碎。粒子大小測量表明具有十分寬廣的分布，其中粒子尺寸為1μm-700μm。
當(dāng)在實施例1中描述的盒系統(tǒng)中評價時，磨碎的整料十分迅速地結(jié)合溶菌酶，在15分鐘之內(nèi)實現(xiàn)容量＞46mg/mL。相對于比較例2的動力學(xué)和容量，該材料迅速吸收的動力學(xué)和增加的容量可能通過在整塊的介質(zhì)中改進的質(zhì)量傳遞和孔隙度進行解釋。
實施例3如實施例1描述的制備按重量計算65∶35的AMPS/MBA共聚物，不同之處為聚合時間從2.5小時延長到5小時。通過洗脫將該樣品分級為三種粒度范圍-小的下料，中等的下料和大的下料。棄去中等的下料，所述小的和大的下料的平均粒度確定為37.6μm(小珠)和160.0μm(大珠)。然后在實施例1描述的所述盒中評價這兩個樣品。所述溶菌酶捕獲結(jié)果列于表2。
表2

NM＝未測量實施例4對于小規(guī)模蛋白質(zhì)提純，CM-Sephadex C50是有用的離子交換樹脂。制造商推薦的最大流速為45cm/hr，表明該樹脂對于大規(guī)模柱使用太柔軟。樣品通過在40℃，10mM的磷酸鈉緩沖液中混合過夜水合。10mL沉降的樹脂裝填到實施例1中描述的分離系統(tǒng)中，通過以1134mL/min的流速循環(huán)兔子IgG(在10mM磷酸鹽中0.17mg/mL，pH 7.2)的溶液通過裝填的過濾器膜盒評價IgG吸附。隨著時間的推移取出樣品進行紫外線分析表明IgG迅速吸附，在6分鐘樹脂吸附3.9mg/mL，在25分鐘之內(nèi)達到吸附平衡4.5mg/mL。制造商聲稱的有效容量(飽和容量)是7mg/mL。在試驗期間沒有觀察到流速變化或者壓力增加。
實施例5根據(jù)制備實施例1中描述的一般方法制備按重量計算95∶5的MBA/VDM共聚物珠。所述有機相由庚烷(348ml)，穩(wěn)定劑(0.13g)，和VDM(0.72g)組成。所述含水相由異丙醇(90ml)，水(55ml)，MBA(13.33g)，過硫酸鈉(0.55g)，和TMEDA(0.55ml)組成。如描述于P.R.Johnson，et al.，J.Chromatogr.A，1994，667，1-9中的方法，在去離子水中評價該珠(5A)的水合體積和肌紅蛋白結(jié)合容量。結(jié)果顯示于表3中。使用相同的成分和量制備第二MBA/VDM共聚物，不同之處為異丙醇體積增加到125mL，水增加到75ml。同樣評價該珠(5B)的水合體積和肌紅蛋白結(jié)合容量，結(jié)果列于表3中。
表3

實施例6-8根據(jù)在實施例5A中描述的方法制備按重量計算95∶5的MBA/VDM共聚物珠，不同之處為甲苯(188mL)加入到有機相中，總水體積增加到60毫升。對于實施例6，使用的聚合物穩(wěn)定劑是丙烯酸異辛酯和丙烯酸按重量計算92.5∶7.5的共聚物(0.27g)，攪拌速度增加到600rpm；對于實施例7，使用的聚合物穩(wěn)定劑是丙烯酸異辛酯和丙烯酸按重量計算90∶10的共聚物，向含水相中加入氫氧化鈉(3.7mL 0.1M溶液)以中和丙烯酸；和對于實施例8，聚合物穩(wěn)定劑是丙烯酸異辛酯和丙烯酸按重量計算95∶5的共聚物(1.06g)，向含水相中加入氫氧化鈉(0.74mL 1M溶液)中和所述丙烯酸，向含水相中加入十二烷基磺酸鈉(3mL的按重量計算10％的水溶液)，攪拌速度增加到750rpm。干燥之后，干燥分級所述珠獲得下料，送入32μm篩子中。
根據(jù)US 5,907,016的教導(dǎo)，蛋白質(zhì)A結(jié)合到實施例6-8的珠上。蛋白質(zhì)A結(jié)合方法反應(yīng)之前，所有的溶液在25℃水浴中平衡。在圓底燒瓶中，通過在40mL去離子水中溶解797.2mg重組蛋白質(zhì)A(Repligen Corp.，Waltham，MA)制備溶液。向該溶液中加入112mL的緩沖液A。用高架的攪拌器攪拌混合物，加入11.44g干燥珠。連續(xù)攪拌15分鐘，然后加入304mL緩沖液B，連續(xù)攪拌1小時。使用燒結(jié)玻璃漏斗過濾小珠。所述小珠返回到反應(yīng)燒瓶中，加入pH為9.5的560mL的3.0M乙醇胺，攪拌所述混合物1小時。然后過濾所述珠，用pH 7.5的265mL的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，用pH 10.5的265mL 0.1M的碳酸鈉緩沖液洗滌6次，用200mL PBS洗滌2次，用在2％乙酸中的160mL 2M胍洗滌3次，用200mL PBS洗滌3次，用265mL去離子水洗滌6次，然后貯藏在160mL 20％乙醇/去離子水中直到使用。
在另外的分級之后，獲得包括每一mL水合珠體積有大約6.5-7.5mg結(jié)合蛋白質(zhì)A的珠樣品，尺寸注明在表4中。使用上面描述的方法試驗裝填蛋白質(zhì)A的珠對于人IgG的捕獲，結(jié)果見表5(實施例6)，表6(實施例7)和表7(實施例8)?？偟姆@率(或者捕獲生產(chǎn)量)是實施例6為40g/l/hr；對于實施例7為72g/l/hr，對于實施例8為125g/l/hr。通過對比，在該系統(tǒng)中使用60μm直徑的蛋白質(zhì)A粒子導(dǎo)致大約20g/l/hr的俘獲率，十分類似于在標(biāo)準(zhǔn)大型色譜法柱中實現(xiàn)的生產(chǎn)能力。
表4

表5實施例6

表6實施例7

表7實施例8

實施例9通過在氮氣清洗的密封小玻璃管中聚合所述單體制備與實施例2組成相同的整料。所述小瓶被放入33℃的水浴中過夜。破碎所述小瓶；所述整塊填塞料用水和丙酮洗滌，用研缽和研棒輕輕磨碎，然后在真空下干燥。在去離子水中制造這些壓碎粒子的漿料，填充到Bio-RadPoly-Prep柱中到1mL的床層深度。通過改造溶菌酶方法適應(yīng)IgG，測量IgG的平衡陽離子交換容量，測得為35mg/ml。
這些壓碎粒子的漿料填充到具有0.25μm玻璃料的0.35mL，3×50mm Omnifit柱中，使用AKTA Explorer色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)測量人IgG的動力學(xué)結(jié)合容量。所述IgG荷載緩沖液是在50mM乙酸鈉中的3.5mg/mL的IgG，80mM的氯化鈉，pH 4.5。在300cm/hr和500cm/hr下，確定在10％穿透時的動力學(xué)載荷容量分別測得為20.8和15.3mg/mL。
實施例10與實施例9的整料組成相同的整料，不同之處用1.5mL的PEG 400取代1.5mL的異丙醇。所述過程和操作與實施例9相同。以實施例9描述的方式測量IgG的平衡陽離子交換容量，測得為23mg/mL。
實施例11與實施例9整料組成相同的的整料，不同之處用1.68mL的1-辛醇取代1.68mL的異丙醇作為成孔劑。所述過程和操作與實施例9相同。以實施例9描述的方式測量IgG的平衡陽離子交換容量，測得為30mg/mL。
實施例12通過在氮氣清洗的Bio-Rad Poly-Prep柱中在室溫下聚合1mL的單體混合物過夜，制備與實施例10整料組成相同的整料。向所述整塊填塞料的頂部加入去離子水(10mL)，然而不流過所述柱。向所述柱頂部施加微小的氮氣壓力，但是仍然不發(fā)生流動。切掉包括玻璃料的柱的底部，但是仍然不發(fā)生流動。最后，以實施例9描述的方式壓碎，洗滌和干燥所述整料。以實施例9描述的方式測量IgG的平衡陽離子交換容量，測得為31mg/mL。
實施例13-15
制備與實施例10整料組成相同的整料，不同之處為用等重量的丙烯酸正丁基酯代替5wt％的AMPS單體(實施例13)，用等重量的丙烯酸正丁基酯代替10wt％的AMPS單體(實施例14)，用等重量的丙烯酸正丁基酯代替15wt％的AMPS單體(實施例15)。所述過程和操作與實施例9相同。以實施例9描述的方式測量IgG的平衡陽離子交換容量，測得為24mg/mL(實施例13)，16mg/mL(實施例14)和5mg/mL(實施例15)。
權(quán)利要求
1.一種包括過濾元件的復(fù)合過濾介質(zhì)，其包括至少一層多孔纖維性的過濾層，和至少一個能夠與目標(biāo)分子結(jié)合的固定相顆粒狀物的層，所述固定顆粒狀物選自平均直徑小于50微米的粒子，柔軟的聚合物粒子，和壓碎的整塊聚合物粒子。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的多孔纖維性的過濾層是平均標(biāo)稱孔徑范圍為1-50微米的紡織或者非紡織多孔材料。
3.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的固定相顆粒狀物選自能夠通過吸附、離子交換、疏水性結(jié)合和親和性結(jié)合進行結(jié)合的顆粒狀物。
4.權(quán)利要求3的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的離子交換顆粒狀物選自陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂。
5.權(quán)利要求3的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的親和色譜法固定相顆粒狀物包含瓊膠糖、纖維素、右旋糖酐和含有與目標(biāo)分子有親和性的配位體的乙烯基聚合物。
6.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的固定相顆粒狀物是平均粒子直徑小于50微米的有機的或者無機的顆粒狀物。
7.權(quán)利要求6的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的固定相顆粒狀物的平均粒度小于30微米。
8.權(quán)利要求6的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述粒子的尺寸的偏離系數(shù)大于30％。
9.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的過濾元件包括上游表面和下游表面，所述的顆粒狀物層布置在所述的上游表面上。
10.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述過濾元件的所述過濾介質(zhì)是表面過濾介質(zhì)。
11.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述過濾元件的所述過濾介質(zhì)是深層過濾介質(zhì)。
12.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述的壓碎的整塊顆粒狀物的粒徑分布為0.1-1000微米。
13.權(quán)利要求1的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述柔軟的顆粒狀物在施加50psi壓力下經(jīng)受至少10％的顆粒高徑比變化。
14.權(quán)利要求13的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述柔軟的顆粒狀物的平均直徑小于50微米。
15.權(quán)利要求14的復(fù)合過濾介質(zhì)，其中所述柔軟的顆粒狀物的平均直徑小于30微米。
16.一種包括過濾元件的過濾盒，包括權(quán)利要求1-15任一項的復(fù)合過濾介質(zhì)。
17.一種用于大規(guī)模分離生物大分子的分離系統(tǒng)，包括權(quán)利要求16的過濾盒，含有包括至少一種目標(biāo)生物大分子作為溶質(zhì)的溶液混合物的儲液槽，用于泵送所述溶液混合物通過所述過濾盒的機泵和相關(guān)配管，以將所述的至少一種生物大分子結(jié)合到所述固定相顆粒狀物上從而形成目標(biāo)分子固定相顆粒狀物產(chǎn)物。
18.權(quán)利要求17的分離系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)能夠在24小時內(nèi)提純至少100g目標(biāo)生物大分子。
19.權(quán)利要求17的分離系統(tǒng)，其中所述的過濾盒是閉端過濾盒。
20.權(quán)利要求17的分離系統(tǒng)，其中所述的機泵和相關(guān)配管形成閉合環(huán)路組件，所述閉合環(huán)路組件提供循環(huán)泵送所述溶液混合物。
21.權(quán)利要求20的分離系統(tǒng)，進一步包括用于泵送洗脫溶液通過所述閉合環(huán)路組件的裝置，所述的洗脫溶液能夠使生物大分子固定相顆粒狀物產(chǎn)物結(jié)合相互作用反轉(zhuǎn)以便釋放所述目標(biāo)分子。
22.一種從溶液混合物中分離目標(biāo)分子的方法，包括如下的步驟a)提供分離系統(tǒng)，包含包括權(quán)利要求1-15任一項的能夠與目標(biāo)分子結(jié)合的復(fù)合過濾介質(zhì)的過濾盒，含有包括至少一種目標(biāo)分子作為溶質(zhì)的溶液混合物的儲液槽，和機泵和相關(guān)配管，和b)在壓力最多為50psi下將所述溶液混合物泵送通過所述過濾盒，以使所述的至少一種生物大分子與所述固定相顆粒狀物結(jié)合以便形成目標(biāo)分子固定相顆粒狀物產(chǎn)物。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述的目標(biāo)分子選自蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)和核酸。
全文摘要
一種包括過濾元件的復(fù)合過濾介質(zhì)，所述的過濾元件包括至少一個多孔纖維性的過濾層，和至少一個吸附固定相顆粒狀物的層，所述的固定相顆粒狀物選自平均直徑小于50μm的有機的或者無機顆粒狀物，柔軟的顆粒狀物和壓碎的整塊顆粒狀物。所述顆粒狀物能夠與目標(biāo)分子例如通過吸附，離子交換，疏水性結(jié)合和親和性結(jié)合實現(xiàn)結(jié)合。與使用包含常規(guī)的生產(chǎn)規(guī)模色譜樹脂顆粒狀物的過濾介質(zhì)實現(xiàn)的結(jié)合容量相比較，本發(fā)明的顆粒狀物提供較高的結(jié)合容量。
文檔編號B01J47/02GK101060924SQ200580039391
公開日2007年10月24日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月1日
發(fā)明者杰拉爾德·K·拉斯穆森, 安德魯·W·拉賓斯, 詹姆斯·I·亨布里, 凱南·塞沙德里, 凱利·J·吉本斯, 中村雅之, 小羅伯特·T·菲茨西蒙斯, 西蒙·K·香農(nóng), 史蒂芬·B·羅斯科, 拉里·J·卡森 申請人:3M創(chuàng)新有限公司