專利名稱：用于從復雜混合物中選擇性吸附的固體組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的領域本發(fā)明涉及可用于分離復雜混合物(complex mixture)中的化學組分的固體組合物和方法，在所述混合物中，至少一種化學組分能夠被選擇性地吸附。本發(fā)明還涉及減少該混合物中的其它組分的非特定連接的方法。
本發(fā)明的背景混合物中的組分的分離在許多科學領域，如化學，生物化學和分子生物學中已變得重要?；旌衔镏械慕M分的分離使得分離出有價值的組分即分析物。在分析物分離之后，分析物的性能可被研究或利用。如果沒有分離，可能難以確定分析物的性能，因為無論使用何種測量技術，所述組分的性能可被該混合物中的其它組分所掩蓋或受到影響。因此，分離技術可被認為是科學研究的基礎。
如果包含分析物的混合物是一種復雜混合物，組分難以分離。復雜混合物的合適例子包括生物發(fā)酵介質，細胞培養(yǎng)物，轉基因技術制造的乳品，或轉基因植物物質的淤漿，其中特定分析物是所需的且需要被分離和純化。復雜混合物中的組分的分離通常通過親和性分離技術而實現(xiàn)。親和性分離技術通常包括，將混合物與具有特定地設計成與分析物結合的官能度，但基本上不與混合物中的其它組分反應的固體相接觸，這樣留下其它組分以被自由去除。在如通過將固體相用水或緩沖劑洗滌而去除非鍵接組分之后，分析物被留下鍵接到固體相上，這樣分析物從非鍵接組分中分離。隨后通過將分析物從固體相中分離，通常通過緩沖劑改變而分離分析物，這樣將分析物回收成游離分子。
已經(jīng)開發(fā)出多種用于純化的有價值的″親和性″技術。這些技術具有許多名稱，親和性色譜，親和性沉淀，免疫親和性分離，等，但它們都依賴于相同的原理，即，特定官能度或連接部分被化學連接到固體載體上，而后者非常選擇性地結合到目標分析物上。用于蛋白質純化的最常用連接部分是其它蛋白質如蛋白質A或蛋白質G，或單克隆抗體，螯合的金屬離子，多肽，或小有機分子。單克隆抗體可尤其有吸引力地用于蛋白質純化，因為它們可對于目標蛋白質高度選擇。如上所述，可使包含分析物的混合物與結合有連接部分的親和性固體載體接觸。分析物結合到載體上的連接部分上，而混合物中的其余組分被去除。分析物隨后通過洗脫從連接部分中去除，這通常通過改變溶劑而實現(xiàn)。可實現(xiàn)非常高的純化系數(shù)。在親和性技術方面有進一步的文獻1-8。
在選擇和生產(chǎn)單克隆抗體方面的最新進展已使得基于作為連接部分的單克隆抗體的親和性技術成為一種非常有力地用于純化蛋白質和生物藥物的技術。單克隆抗體本身是蛋白質，通常使用其中蛋白質A或蛋白質G用作配體的親和性純化技術而從細胞培養(yǎng)物或發(fā)酵物中純化。新的小有機蛋白質A擬似物也被描述為可用于單克隆抗體純化的配體。
盡管親和性純化已被證實為一種有力的技術，但其全部潛力還沒有被充分利用。最常見的是，載體成型為約0.05-0.5mm左右量級的小珠粒，并將通常被稱作介質的這些珠粒裝載到色譜柱中。所要純化的混合物隨后經(jīng)過該柱，然后分析物結合到與介質連接的連接部分上。該柱隨后被充分洗滌以去除包合的混合物。洗脫溶劑隨后經(jīng)過該柱以釋放溶液中的分析物。在大規(guī)模時，該工藝要求介質具有良好的物理強度以經(jīng)受在柱應用時所遇到的重量和湍流。
無論作為柱色譜或一些其它體系，目前用于親和性分離的某些載體是低表面積材料，如碳水化合物基材料或聚合物。這些低表面積載體可具有低容量。由于低容量，介質需要相對大的加載量以回收目標物質。但對于介質的大加載量，柱的流速由于壓降因素而局限于低速率。柱色譜也可在高壓下進行，其中使用較小珠粒以增加介質容量。因為這些珠粒必須具有較高強度以經(jīng)受壓力，碳水化合物凝膠被交聯(lián)，這樣降低所得珠粒的容量。因此，需要提供具有高容量和進一步在用于高壓液體色譜時物理性質強健的親和性載體。
開發(fā)高表面積載體是一種得到高容量親和性分離介質的途經(jīng)。有了較高容量材料，需要較小量的親和性載體以回收目標物質，柱壓降較低，流速較高，且包合的加料污染物較少。高表面積可以是10-500m2/g?？商峁└弑砻娣e的材料是硅膠，硅石，礬土，氧化鋯，碳水化合物，和聚合物材料如大孔丙烯酸珠粒。在硅膠的情況下，表面積可以從非常低即1m2/g變至非常高即超過800m2/g，同時孔尺寸形態(tài)從非常低即低于25埃變至超過1500埃。另外，無機氧化物基材料通常比基于較軟的碳水化合物的載體物理性質強健得多。
如果作為介質與所連接的連接部分一起用于親和性分離技術，這些氧化物基材料盡管具有必需的高表面積，但可遇到非所需材料的高度非選擇性連接的問題。不是所有的表面積用于親和性分離；某些實際上提供用于非選擇性吸附的表面區(qū)域。眾所周知的是，蛋白質例如有時不可逆地和非選擇性地非常牢固地結合到硅石上。因此，盡管連接部分可以是非常選擇性的，表面的未使用區(qū)域是非選擇性的。凈作用是降低高表面積材料的選擇性，從而減小總體工藝的純化系數(shù)。許多氧化物載體、尤其是硅石如硅膠的這種非選擇性吸附是這些材料目前沒有被廣泛用作親和性分離載體的原因。
本發(fā)明的一個目的是描述一種要應用于高表面積材料的表面組合物，所述材料改善了非選擇性吸附，同時保持用于選擇性的親和性連接的高容量。
這些組合物在從復雜生物混合物進行″親和性分離″時具有極大的價值，其中特定生物物質，如蛋白質通過基因工程化有機體而生成。例如該復雜混合物可以是用于目標蛋白質的細胞或細菌生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)液是支持有機體生長的蛋白質、碳水化合物等以及通過發(fā)酵而產(chǎn)生的副產(chǎn)物的復雜混合物。目標物質也可發(fā)酵制成和通過有機體被制成培養(yǎng)液。在一些情況下，目標物質在細胞中產(chǎn)生。因此回收的復雜之處在于，細胞需要勻化且目標需要溶解。這些混合物對于目標物質分離和純化是尤其困難的。用于分離和純化發(fā)酵培養(yǎng)液中的目標物質的分離和純化方案是非常復雜的和昂貴的。分離和純化的成本在大規(guī)模生產(chǎn)時特別顯著。由于該問題在性質上具有挑戰(zhàn)性，純化和分離的領域是廣泛的。
本發(fā)明的綜述本發(fā)明固體組合物包含無機物質和位于所述無機物質的至少一個表面上的部分R10，其中所述無機物質是無機氧化物，所述R10基團選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
如果R10選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)，固體載體具有的一個明顯特征在于具有降低的對復雜混合物中的任何非分析物組分的非特定連接。R10成分具有一個共同性能，即具有零電荷和親水性。不局限于任何特殊理論，據(jù)信當固體載體具有位于其表面上的任何R10，即-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)時，混合物中的非分析物組分與表面的連接具有低于混合物水相中的剩余非分析物組分的熵變。來自溶液的任何組分，如，非分析物或分析物組分與表面的結合包括熵由于非分析物在表面上的定位化而降低。為了對連接有利，非分析物和表面之間必須存在一種相互作用，如庫侖電荷相互作用或憎水相互作用，以克服由于表面定位化而造成的熵下降。但用R10類中的任何一種或任何混合物進行覆蓋產(chǎn)生親水表面以及具有零凈電荷的表面，這降低了用于降低熵所需的相互作用，并從而降低了非分析物的非連接。
另外，包含無機物質、位于該無機物質的至少一個表面上的部分R10和至少一個能夠連接分析物的連接部分的固體也落入本發(fā)明的范圍內。該部分R10優(yōu)選位于一部分無機氧化物的表面上，而連接部分位于剩余的表面上。選擇連接部分以提供與特殊分析物的鍵接和提供用于親和性分離的高度選擇性連接，同時覆蓋有R10基團的表面降低了其它物質的非選擇性連接。在優(yōu)選的實施方案中，顯著的(如果不是大多數(shù)的)無機氧化物表面被R10基團例如以約1-10個基團/nm2基材的濃度覆蓋，且其余為連接部分所覆蓋。
另外，包含無機物質的固體在本發(fā)明的范圍內，其中連接部分任選地通過連接劑位于無機氧化物表面上。連接劑可通過使連接劑化合物與無機氧化物反應，并隨后使連接劑與連接部分反應而位于無機氧化物表面上。因此，本發(fā)明涉及包含連接劑基團和位于其表面上的R10部分的無機物質。該固體又可被轉移至最終用戶，后者可將特定設計的連接部分連接到連接劑上用于分離。
附圖的簡要描述
圖1示意性描繪了包含無機物質、R10表面部分、任選性的連接劑、連接部分和分析物的本發(fā)明的組合物。
圖2給出了實施例1和2的結果，其中欄數(shù)2和7表示Pharmacia3.6-9.3寬pI標準，欄數(shù)3和4表示實施例1，欄數(shù)5和6表示實施例2。該圖說明未處理的常規(guī)無機氧化物的非特定連接。
圖3給出了實施例3-5的結果。
圖4給出了實施例6-8的結果并用于說明本發(fā)明。
圖5-8包含為了定性描述本發(fā)明的特定實施方案(實施例8)而進行的分析的結果，其中圖5給出了實施例8的漫反射IR光譜，圖6為了對比給出了在實施例7中制成的組合物的同一光譜，圖7給出了實施例8的MAS Si29NMR光譜，圖8給出了實施例8的X-射線光電子光譜XPS。
圖9給出了實施例7的XPS光譜。
圖10給出了在連接上連接部分之后使用本發(fā)明在實施例9中制成的柱的加載、洗滌和洗脫時的色譜圖。
圖11描繪了純化兔多克隆IgG的尺寸排阻色譜的流出液在280nm處的吸光率，所述IgG得自在實施例9中進行的親和性色譜的洗脫液。
圖12描繪了被加入實施例9的細胞培養(yǎng)液的起始兔多克隆IgG的尺寸排阻色譜流出物在280nm處的吸光率。
圖13描繪了覆蓋劑的制備，該覆蓋劑由圖14所示反應得到-CH2OH作為R10。
圖14示出了通過不是硅石一部分的硅原子而連接有R10的硅石的制備，其中R10是-CH2OH，這樣-Si-CH2OH直接連接到硅石上(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基團)。
圖15描繪了覆蓋劑的制備，該覆蓋劑由圖16所示反應得到-CH2OH作為R10。
圖16示出了通過不是硅石一部分的硅原子而間接連接有R10的硅石的制備，這樣-Si-R10基團被連接到硅石表面上，其中R10是-CH(OH)2(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基團)。
圖17給出了覆蓋劑的制備，該覆蓋劑由圖18所示反應得到羥基乙基作為R10。
圖18給出了一種用于制備包含硅石和連接到硅石表面上的-Si-R10基團的固體的方法，即R10通過不是硅石一部分的硅原子間接連接到硅石表面上，其中R10是1，2-二羥基乙基。
圖19給出了另一種用于制備包含硅石和連接到硅石表面上的-Si-R10基團的固體的方法，即R10通過不是硅石一部分的硅原子間接連接到硅石表面上，其中R10是1，2-二羥基乙基。
圖20給出了本發(fā)明的一個實施方案，其中-Si-R10基團在連接到硅石表面上時被交聯(lián)，其中R10是羥基甲基(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基團)。
圖21給出了得到在單個點上連接到硅石表面上的-Si-R10基團的覆蓋劑的制備，其中R10是羥基甲基，得自圖22所示的反應。
圖22描繪了本發(fā)明的一個實施方案，其中Si-R10基團在單個點上連接到硅石表面上，其中R10是羥基甲基(HO-Si---表示硅石表面上的硅烷醇基團)。
本發(fā)明的詳細描述無機物質適用于本發(fā)明的無機物質包括作為色譜介質購得的那些產(chǎn)品。這些物質可使用本領域已知的方法而制成。無機物質也可被認為是一種用于以下將要描述的連接部分的載體，且無機物質有時在本文中稱作″載體″。一般來說，本發(fā)明的無機物質是一種無機氧化物，更合適地是無機金屬氧化物、硅酸鹽或硅鋁酸鹽。無機金屬氧化物是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的無機氧化物具有能夠鍵接至其它化學官能度或與其反應的游離羥基基團。正是通過那些羥基基團，R10表面部分和連接部分和/或連接劑進行反應或鍵接。一般來說，合適的無機氧化物包括具有約1-約10個羥基基團/平方納米固體無機氧化物的那些。
優(yōu)選的無機金屬氧化物的例子包括硅石如色譜級硅石或硅膠，礬土，硅石-礬土，氧化鋯，鋯酸鹽，受控孔玻璃或二氧化鈦。無機金屬氧化物優(yōu)選是硅石，更優(yōu)選色譜級硅石或硅膠。磁響應無機金屬氧化物，如公開于WO 98/31461(其公開內容作為參考并入本發(fā)明)的硅氧化物涂覆磁性顆粒也是合適的。也可使用混合無機金屬氧化物，如硅石和礬土的共凝膠，或共沉淀物。由硅酸鈉制成的固體是合適的硅酸鹽的例子，沸石是合適的鋁硅酸鹽的一個例子。本發(fā)明固體的物理形式可以是顆粒、纖維和板。
表面部分(R10)如上所述，R10基團選自-CH2OH，-CH(OH)2，-CH(OH)CH3，-CH2CH2OH，-C(OH)2CH3，-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。R10優(yōu)選選自-CH2OH，-CH(OH)CH3，-CH2CH2OH，和-CH(OH)CH2(OH)。更優(yōu)選，R10選自-CH2OH，-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH。最優(yōu)選R10是-CH2OH。
部分R10位于無機物質的至少一個表面上?！逦挥凇迨侵窻10可直接連接到起始無機物質的表面上的官能團上。R10可位于存在于無機物質外周的表面區(qū)域上，或位于存在于孔中的表面區(qū)域上，所述孔進入到無機物質的內部和在物質的外周上具有(孔)開口。
R10也可通過二價部分或原子(-X-)連接到無機物質表面上而″位于″無機物質的表面上，這樣形成具有式-X-R10的基團。該實施方案中連接R10的二價部分或原子在起始無機物質與反應物反應之前不存在于該物質的組成中。該部分或原子可來自用于產(chǎn)生R10的反應物，如，來自硅烷反應物的殘余金屬原子(如硅原子)。該殘余部分或原子直接連接到所述無機物質上，并優(yōu)選通過無機物質表面上的羥基基團連接。這些反應物中的-X-基團對于不同的反應物是不同的，但可以是金屬原子或其它化學部分。例如，X可衍生自金屬原子如硅，鋁，鋯或類似物。所選的無機物質也可決定對-X-和其相關反應物的選擇。一般，包含-X-的任何反應物可與無機物質上的反應性官能度反應。在無機氧化物的情況下，合適的反應物通常是能夠與羥基基團反應的那些。
化合物，如，能夠產(chǎn)生R10的那些，與無機物質反應的化學過程是本領域已知的，如，Smith，Organic Synthesis，John Wiley & Sons，1994；March，Advanced Organic Chemistry，John Wiley & Sons，第四版，1992；Larock，Comprehensive Organic Transformations，John Wiley & Sons，第二版，1999；Greene等人，Protective Groupsin Organic Chemistry，John Wiley & Sons，第三版，1999；Brook，Silicon in Organic，Organometallic，and Polymer Chemistry，JohnWiley & Sons，2000；Hermanson等人，Immobilized Affinity LigandTechiniques，1992；Weetall，″用于無機載體材料的共價偶聯(lián)方法″，Methods in Enzymology，vol.XLIV，由K.Mosbach編輯，第134-148頁，1976；Abbott，US 4,298,500；和Arkles，US 5,371,262；這些文件的公開內容在此作為參考并入本發(fā)明。例如，包含位于無機物質的表面上的R10基團的固體可由帶有R10的前體基團的反應物或覆蓋劑如烷氧基硅烷、二烷氧基硅烷或三烷氧基硅烷制成。例如，乙酰氧基甲基可以是羥基甲基的前體基團。然后使覆蓋劑與無機物質的表面反應，隨后前體水解得到連接有R10基團的無機物質。
一種制備具有-CH2OH作為位于硅石表面上的R10的硅石的方法在圖13和14中給出。圖13描繪了覆蓋劑乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷(參見化合物(2))的制備，該物質用于將Si-R10基團引入硅石表面上的硅烷醇基團，即HO-Si---，其中R10是羥基甲基(參見在圖14中給出的反應，其中化合物(5)是具有直接連接在表面上的Si-R10的硅石，其中R10是羥基甲基)。換句話說，在圖14中，給出了一種通過Si原子將R10基團引入至硅石表面的方法，而Si原子是上述殘余部分或原子X的一個例子，它是來自反應物的殘余物且不是起始無機物質的一部分。
圖15和16給出了一種用于制備包含R10的硅石的方法，其中R10是-CH(OH)2。圖15描繪了覆蓋劑二乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷(參見化合物(7))的制備，用于將-CH(OH)2基團作為R10基團引入到硅石的表面(參見在圖16中給出的反應和化合物(9))。
圖17給出了一種用于制備覆蓋劑乙酰氧基乙基三乙氧基硅烷(參見化合物(11))的方法，用于將2-羥基乙基引入到硅石的表面。
圖18和19給出了兩種用于制備包含硅石和作為R10基團連接到硅石表面上的1，2-二羥基乙基的固體的方法。
另外，在本發(fā)明范圍內的固體包括具有通過來自硅烷反應物的殘余金屬(如Si)連接到固體表面上的R10基團的無機物質，其中每個所得Si-R10基團通過三個共價鍵連接到無機物質上(如參見圖14、16、18和19中的反應方案的最終產(chǎn)物，它得自具有三個硅烷醇基團的覆蓋劑的反應)。
從圖21和22可以看出，另外據(jù)信可選擇覆蓋劑以使得殘余原子也可通過一個或兩個共價鍵連接到無機物質上，或某些實施方案包括Si原子的交聯(lián)。這些交聯(lián)可以是Si-O-Si鍵或另一鍵如Si-O-C(O)-O-Si、Si-O-亞烷基-O-Si或Si-O-C(O)-亞烷基-O-Si)。圖22中的反應方案的最終產(chǎn)物即化合物(20)說明本發(fā)明固體的一個實施方案，其中Si-R10基團具有與硅石表面的單個連接點。該具體形式由固體無機物質和單乙氧基硅烷的反應制成(關于為一種單乙氧基硅烷的覆蓋劑的制備，參見圖21)。
連接部分本發(fā)明固體可進一步包含至少一個任選地通過連接劑連接在所述無機物質的表面或以其它方式位于所述無機物質的表面上的連接部分。該連接部分是能夠連接至另一部分或分子基分析物(如通過憎水相互作用、共價鍵接或庫侖相互作用而連接)的任何分子或分子片段。這些部分是分離工業(yè)的熟練技術人員所熟知的。通常用于生物分離工業(yè)的部分包括(如生物素、抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素)，天然或非天然蛋白質，肽，抗原和核酸。作為本發(fā)明固體的連接部分，蛋白質優(yōu)選為受體或抗體。
另外優(yōu)選的是，在本發(fā)明的固體中，連接部分是配體，受體，抗體，抗原，DNA或RNA，包括用于核酸的雜化探頭。如果配體是抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，則分析物可以是生物素或被生物素化，反之亦然。
連接部分使用本領域已知的方法連接到無機物質上(如Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press，1992和較早引用的有關連接R10部分的其它參考文件)。在包含無機氧化物的固體中，連接部分可通過與起始無機氧化物上的表面官能團如羥基反應而連接。
或者，連接部分可通過連接劑連接到無機物質上。連接劑可以是任選地被取代的二價化學基團。該任選地被取代的二價化學基團可包含n個-R-基團，其中n是-R-基團的數(shù)目，n是至少為1，優(yōu)選不大于30，和更優(yōu)選不高于15的整數(shù)。更通常，從連接部分至無機物質度量的二價化學基團的長度是約1-約30原子，優(yōu)選約1-約20原子，更優(yōu)選約5-約15原子?；瘜W基團-R-可選自-C(R1)H-，-C(R2)＝C(R3)-和-C≡C-，其中R1、R2和R3獨立地是H，烷基，取代的烷基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，環(huán)鏈烯基，取代的環(huán)鏈烯基，炔基，取代的炔基，環(huán)炔基，取代的環(huán)炔基，芳基，取代的芳基，芳烷基或取代的芳烷基，所述-R-基團任選地被替代為-O-，-S-，羰基，硫代羰基，-OC(O)-，-C(O)O-，-SC(O)-，-C(O)S-，-OC(S)-，-C(S)O-，-C(S)S-，-SC(S)-，-N(R4)-，-N(R4)C(O)-，-C(O)N(R4)-，-C(R5)＝N-，-N＝C(R5)-，-C(R5)＝NO-，-ON＝C(R5)-，-P-，-P(OH)O-，亞芳基，取代的亞芳基，亞環(huán)烷基，取代的亞環(huán)烷基，亞環(huán)鏈烯基，取代的亞環(huán)鏈烯基，二價雜環(huán)基或二價取代的雜環(huán)基，其中R4和R5獨立地是H，烷基，取代的烷基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，環(huán)鏈烯基，取代的環(huán)鏈烯基，炔基，取代的炔基，環(huán)炔基，取代的環(huán)炔基，芳基，取代的芳基，芳烷基或取代的芳烷基?；瘜W基團的例子是包含n個-R-基團的″烴基″且其中n如上所述，至少一個-R-基團是-CH2-，且(n-1)個-R-基團任選地被替代為上述的R基團，如，-O-，-S-，等。
″取代的″在本文中用于表示包含不改變取代的R基團的主要化學性質，如，烴基的烴性質的側取代基基團。
術語″烷基″是指飽和的支化或未支化烴基基團，優(yōu)選具有1-30，更優(yōu)選1-20和甚至更優(yōu)選1-6個碳原子的那些。″烷基″的例子包括甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基，正戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，異戊基，新戊基，1，1-二甲基丙基，正己基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，異己基和新己基。術語″環(huán)烷基″是指飽和環(huán)狀烴基基團，優(yōu)選具有3-10，和更優(yōu)選3-6個碳原子。″環(huán)烷基″的例子包括環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，雙環(huán)庚基和十氫萘?！彐溝┗迨蔷哂兄辽僖粋€C＝C鍵的支化或未支化烴基基團，其中烴基基團優(yōu)選具有2-30，更優(yōu)選2-20和甚至更優(yōu)選2-6個碳原子?！彐溝┗宓睦影ㄒ蚁┗┍?，1-丙烯基，異丙烯基，2-丁烯基，1，3-丁二烯基，3-戊烯基和2-己烯基?！瀛h(huán)鏈烯基″是指具有至少一個C＝C鍵的環(huán)狀烴基基團，優(yōu)選具有3-10，優(yōu)選3-6個碳原子?！迦不迨蔷哂兄辽僖粋€-C≡C-鍵的支化或未支化烴基基團，優(yōu)選具有2-30，更優(yōu)選2-20和甚至更優(yōu)選2-6個碳原子。″炔基″的例子包括乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，2-丁炔基，3-丁炔基和2-戊烯-4-炔基。″環(huán)炔基″是優(yōu)選具有3-10，更優(yōu)選3-6個碳原子的具有至少一個-C≡C-鍵的環(huán)狀烴基基團?！瀛h(huán)炔基″的例子包括戊炔基和己炔基。″芳基″是優(yōu)選具有6-14個碳原子的芳族環(huán)狀烴基基團?！宸蓟宓睦影ū交?，萘基，蒽基和菲基，其中苯基是優(yōu)選的芳基?！宸纪榛迨潜灰粋€或多個芳基基團取代的烷基基團。
″芳烷基″的例子包括芐基，苯乙基，二苯基甲基和三苯甲基，其中芐基是優(yōu)選的芳烷基?！宥r雜環(huán)基″通常是具有3-10，優(yōu)選3-7，更優(yōu)選4-6個環(huán)原子的二價環(huán)狀基團，其中1-4個環(huán)原子是O，S或N原子，或O，S和/或N原子的混合物。二價雜環(huán)基的例子包括硫雜丙烯環(huán)，環(huán)氧乙烷，氮丙啶，1H-azirine，2H-azirine，2H-thiete，thietane，2H-氧雜環(huán)丁二烯，氧雜環(huán)丁烷，氮雜環(huán)丁二烯，氮雜環(huán)丁烷，1，2-氧氮雜環(huán)丁烷，噻吩，呋喃，吡咯，咪唑，噁唑，異噁唑，噻唑，異噻唑，吡唑，1，3-二氧戊環(huán)，1，2，3-噻二唑，1，3，4-噻二唑，1，2，4-噻二唑，1，2，3-噁二唑，1，2，4-噁二唑，1，3，4-噁二唑，1，2，5-噁二唑，1，2，3-三唑，1，2，4-三唑，四唑，噁二唑，吡啶，喹啉，異喹啉，喹嗪，喹唑啉，蝶啶，咔唑，苯并噁唑，1，3-噁嗪，2H-1，3-噁嗪，吩嗪，吩噻嗪，噠嗪，嘧啶，吡嗪，苯并[b]呋喃，苯并[b]噻吩，吲哚，異吲哚，吲唑，嘌呤，異苯并呋喃，四氫呋喃，1，4-二噁烷，吡咯烷，四氫吡喃，1，2-二氫吡啶，1，4-二氫吡啶，哌啶，哌嗪，嗎啉，硫代嗎啉，苯并二氫吡喃，異苯并二氫吡喃，苯并吡喃，1H-氮雜，3H-氮雜，1，2-二氮雜，1，3-二氮雜，1，4-二氮雜，三氮雜和吖辛因的二價基團。
″雜芳基″是指芳族雜環(huán)基團。″亞烷基″、″亞鏈烯基″、″亞炔基″、″亞環(huán)烷基″，″亞環(huán)鏈烯基″和″亞芳基″相應是烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基和芳基基團的二價等同物。
″取代的烷基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氮基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，?；?優(yōu)選乙?；捅郊柞；?，硫代?；榛鶃喠蝓；?，烷基磺?；?，烷基磺酰氨基，烷基氨磺?；?，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲?；趸?，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲?；?，芳基(優(yōu)選苯基)，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的烷基。
″取代的鏈烯基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氮基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，?；?優(yōu)選乙?；捅郊柞；?，硫代?；榛鶃喠蝓；榛酋；?，烷基磺酰氨基，烷基氨磺?；?，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲?；趸?，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲?；?，芳基(優(yōu)選苯基)，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的鏈烯基。
″取代的炔基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氮基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，酰基(優(yōu)選乙?；捅郊柞；?，硫代?；?，烷基亞硫?；榛酋；榛酋０被?，烷基氨磺酰基，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲?；趸?，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲酰基，芳基(優(yōu)選苯基)，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的炔基。
″取代的環(huán)烷基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自烷基，鏈烯基，炔基，芳烷基，羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氮基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，酰基(優(yōu)選乙?；捅郊柞；?，硫代?；榛鶃喠蝓；?，烷基磺酰基，烷基磺酰氨基，烷基氨磺酰基，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲?；趸?，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲?；蓟?優(yōu)選苯基)，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的環(huán)烷基。
″取代的環(huán)鏈烯基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自烷基，鏈烯基，炔基，芳烷基，羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氮基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，?；?優(yōu)選乙?；捅郊柞；?，硫代酰基，烷基亞硫?；?，烷基磺酰基，烷基磺酰氨基，烷基氨磺?；?，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲?；趸?，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲?；蓟?優(yōu)選苯基)，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的環(huán)鏈烯基。
″取代的環(huán)炔基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自烷基，鏈烯基，炔基，芳烷基，羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氨基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，?；?優(yōu)選乙酰基和苯甲?；?，硫代?；榛鶃喠蝓；榛酋；榛酋０被?，烷基氨磺?；?，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲?；趸?，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲?；?，芳基(優(yōu)選苯基)，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的環(huán)炔基。
″取代的芳基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自烷基，鏈烯基，炔基，芳烷基，羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氮基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，酰基(優(yōu)選乙?；捅郊柞；?，硫代?；?，烷基亞硫?；?，烷基磺酰基，烷基磺酰氨基，烷基氨磺?；?，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲酰基氧基)，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲酰基，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基，芳基(優(yōu)選苯基)和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的芳基。
″取代的雜環(huán)基″是被1-5，優(yōu)選1-3個選自烷基，鏈烯基，炔基，芳烷基，羥基，巰基，烷氧基，烷基硫代，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，N，N-芳基烷基氨基，二芳基氨基，疊氮基，脒基，脲基，氟，氯，溴，碘，硝基，氰基，?；?優(yōu)選乙?；捅郊柞；?，硫代?；?，烷基亞硫?；?，烷基磺?；?，烷基磺酰氨基，烷基氨磺?；?，羧基，烷基羰基氧基(優(yōu)選乙酰氧基)，芳基羰基氧基(優(yōu)選苯甲?；趸?，烷氧基羰基氧基，芳基氧基羰基氧基，氨基甲?；蓟?優(yōu)選苯基)，苯乙烯基，環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基和雜環(huán)基(優(yōu)選雜芳基)的取代基所取代的雜環(huán)基基團。
″取代的亞芳基″、″取代的亞環(huán)烷基″、″取代的亞環(huán)鏈烯基″、″取代的二價雜環(huán)基″和″取代的芳烷基″是″取代的芳基″、″取代的環(huán)烷基″，″取代的環(huán)鏈烯基″和″取代的雜環(huán)基″的二價等同物。
連接連接劑的化學基團-R-和無機物質的鍵取決于用于使連接劑和無機物質反應的化學原理。該鍵可以是醚，硫醚，酯，硫代酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，磷酸酯，膦酸酯，磷酯，氨基磷酸酯，胺，酰胺，酰亞胺，脲，硫脲，磺酰胺，亞砜，砜，二硫化物，肟，O-?；浚琌-氨基甲?；?，O-酰基氧基烷基肟，O-酰基氧基烷基氧基肟，O-肟基磷酸鹽，O-肟基膦酸鹽，O-肟基氨基磷酸酯或-C＝C-鍵。連接化學基團-R-和連接部分的鍵也可是前述鍵之一。
連接劑與物質(如，無機物質)反應的化學原理在文獻中得到很好描述(參見Hermanson等人，Immobilized Affnity LigandTechniques，1992和Weetall，Methods in Enzymology，vol.XLIV，第134-148頁，1976)。連接劑與無機物質反應的具體化學原理取決于所用的無機物質和連接劑。同樣，連接劑與連接部分反應的化學原理取決于所用的連接劑和連接部分。合適的連接劑/連接部分偶聯(lián)化學的具體例子在表1中給出。根據(jù)表1，連接部分可通過氨基，巰基，羰基或羥基基團或連接部分上的活性氫原子偶聯(lián)到連接劑上。
表1常規(guī)連接劑/連接部分偶聯(lián)化學的例子由下列形成的連接劑連接部分偶聯(lián)基團溴化氰(CNBr) 氨基N-羥基琥珀酰亞胺酯氨基羰基二咪唑氨基還原胺化 氨基FMP活化* 氨基EDC媒介的酰胺鍵形成** 氨基有機磺酰氯甲苯磺酰氯和tresyl氯化物 氨基二乙烯基砜氨基二氫唑酮 氨基氰尿酰氯(三氯-s-三嗪) 氨基碘乙酰基或溴乙?；罨椒◣€基馬來酰亞胺巰基吡啶基二硫化物巰基二乙烯基砜巰基環(huán)氧 巰基TNB-硫醇*** 巰基酰肼 羰基還原胺化 羰基環(huán)氧(二環(huán)氧乙烷) 羥基二乙烯基砜羥基氰尿酰氯 羥基重氮化合物活性氫Mannich縮合 活性氫
*FMP是指2-氟-1-甲基-吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽**EDC是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺***TNB-硫醇是指2-亞氨基硫代戊環(huán)5，5-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)在制造包含連接劑基團的固體載體時，可以改變產(chǎn)生連接劑基團以及將R10基團加入無機物質的順序。R10可在連接連接劑之后在無機表面上產(chǎn)生，或它可在連接劑反應之前產(chǎn)生?；蛘?，可產(chǎn)生和/或連接R10或連接劑或兩者的前體，且前體隨后反應以產(chǎn)生最終的R10和/或連接劑。
可以改變連接劑基團在無機表面上的濃度。在本發(fā)明某些實施方案中，連接部分包含可″遮蔽″大部分載體表面區(qū)域的大蛋白質分子。結果，連接劑位在載體表面上的濃度無需較高。該濃度可根據(jù)所考慮的連接部分/分析物配合物的尺寸進行優(yōu)化。
決定R10和連接部分的濃度的因素包括R10基團和連接部分的特性、在無機物質上活性位的濃度、連接劑基團的濃度、和分析物的特性。
一般來說，R10的濃度可以是約1-約10個基團/平方納米(nm2)載體表面積，基于通過BET測定的表面積計。在某些實施方案中，連接部分濃度主要取決于在使用該組合物時所要回收的分析物。如上所述，連接部分的濃度也可取決于所用的任何任選性的連接劑的濃度。但一般來說，連接部分的濃度可以是0.04-約4個基團/平方納米。另外，連接部分并不總是以1比1的化學計量連接到連接劑上。在某些實施方案中，如，當連接部分由大蛋白質分子制成時，連接部分可通過幾個連接劑基團連接。在采用較小鍵接劑部分的其它實施方案中，使用低于化學計量量的連接部分，且當本發(fā)明用于分離時任何未反應的連接劑基團被″封端″以避免干擾。
R10和連接部分的量也可表示為起始無機物質上有多少官能團被R10、連接部分、和/或任選性的連接劑反應或″覆蓋″。例如，所述無機物質的約50％-約99％的表面羥基基團可被R10表面部分覆蓋，約1％-約50％的表面羥基基團可被通過連接劑任選地連接到無機物質上的連接部分覆蓋。
在本發(fā)明固體的某些實施方案中，所述無機物質的約75％-約99％的表面羥基基團被R10表面部分覆蓋，約1％-約25％的表面羥基基團被直接或通過連接劑間接連接到無機物質上的連接部分覆蓋。
如上所述，包含至少一個連接部分和R10的本發(fā)明固體可用于分離已知結合到連接部分上的分析物。因此，本發(fā)明包括一種分離與混合物中的至少一種其它組分混合的分析物的方法，所述方法包括以下步驟1.將本發(fā)明固體與所述混合物接觸，其中至少一個連接部分具有對所述分析物的特定親和性；2.使所述分析物結合到所述至少一個連接部分上；3.從其上鍵接有所述分析物的固體中去除所述至少一種其它組分；4.回收所述固體；和5.從固體中分離分析物。
在本發(fā)明方法的一個實施方案中，連接部分以足以提供與所需分析物的特定連接的量存在。所述至少一種其它組分在步驟(3)中通過用流體洗滌固體并丟棄洗滌液而去除；并且其中所述分析物在步驟(5)中通過將洗脫劑放在固體上和收集洗脫劑而分離。
在分離分析物的方法中，優(yōu)選的是，所述無機物質表面的約50％-約99％的羥基基團被表面部分覆蓋，約1％-約50％的表面羥基基團被直接或通過連接劑間接連接到無機物質上的連接部分覆蓋。
分離分析物的方法進一步優(yōu)選使所述無機物質的約75％-約99％表面羥基基團被表面部分覆蓋，約1％-約25％表面羥基基團被直接或通過連接劑間接連接到無機物質上的連接部分覆蓋。
在分離分析物的方法的優(yōu)選實施方案中，所述無機物質是硅膠或色譜級硅石。更優(yōu)選無機物質是硅膠。
本發(fā)明還包括一種減少雜質(雜質是包含分析物的混合物中的非分析物組分，即除分析物之外的物質)與包含無機物質的固體的非特定連接的方法，其中所述無機物質包含至少一個其上發(fā)生非特定連接或以其它方式引起非特定連接的官能團。無機物質包括前述無機氧化物，且所述方法包括以下步驟1.提供所述固體；2.使所述至少一個官能團與反應物反應，以在無機物質的至少一個表面上產(chǎn)生部分R10，其中R10選自-CH2OH，-CH(OH)2，-CH(OH)CH3，-CH2CH2OH，-C(OH)2CH3，-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
在減少非特定連接的方法中，R10優(yōu)選選自-CH2OH，-CH(OH)CH3，-CH2CH2OH，和-CH(OH)CH2(OH)。更優(yōu)選，R10選自-CH2OH，-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH。最優(yōu)選，R10是-CH2OH。R10在無機物質表面上以足量存在，以使得當無機物質與包含雜質的混合物接觸時，雜質與固體的非特定連接得到降低。
該方法尤其可用于減少與具有位于其表面上的羥基官能度的無機金屬氧化物、硅酸鹽或硅鋁酸鹽的非特定連接。它尤其可用于無機金屬氧化物如硅石(硅膠和色譜級硅石)、礬土、硅石-礬土、氧化鋯、鋯酸鹽、受控孔玻璃、二氧化鈦、它們的共沉淀物和混合物。該方法也可用于磁響應性無機氧化物(如含硅氧化物涂覆的磁性顆粒)。
必須考慮到蛋白質或其它物質與載體表面的三種連接，以使與固體載體的非選擇連接最小。
載體的表面電荷在吸附操作pH下應該理想地是零。這是由于，蛋白質由于蛋白質中的-COOH或-NH2基團過量而攜帶凈電荷。對于在約pH7下的蛋白質復雜混合物，如果混合物中的蛋白質的等電點＜7，它就具有凈負電荷，而相反，如果混合物中的蛋白質的等電點＞7，它就具有凈正電荷。未反應的硅石表面具有等電點約2，因此如果它與復雜混合物在pH＝7左右接觸，它就會具有強負電荷，因此帶正電荷的蛋白質就非選擇性地吸附到硅石表面上。這解釋了蛋白質與硅石表面的強非選擇連接。因此，如上所述，載體的表面電荷在吸附操作pH下應該理想地是零。
應該最小化的第二種連接相互作用是憎水鍵接。盡管在單個位上弱于靜電或偶極相互作用，但憎水相互作用如果在許多相鄰位之間聚集就變得可觀。如果溶劑的鹽濃度較高，憎水相互作用變得占主導。鹽的離子可與帶電表面相互作用，從而自蛋白質″屏蔽電荷″。盡管高鹽的存在減少了與表面的靜電相互作用，但如果表面具有憎水性質，那么憎水相互作用變得占主導。因此，應該在載體上避免憎水表面組合物，以使該相互作用最小化。
蛋白質與表面的第三種連接相互作用是氫鍵，或偶極相互作用。有趣的是，如果溶劑是水，該相互作用由于熵的原因而相對表面來說有利于溶劑。即，如果蛋白質在水體系中能夠″選擇″通過氫鍵結合到表面上或留在溶液中(也是一種氫鍵相互作用)，那么由于其較高熵態(tài)而有利于溶液情形。因此，為了從水溶液中進行蛋白質純化，具有偶極組成的表面對于非選擇連接的最小化有利。這種表面在低靜電電荷密度下通常是親水的。
據(jù)信，本發(fā)明涉及這三種相互作用中的每種，且本發(fā)明的新特點之一是一種為了從水基體系中純化蛋白質而提供具有非常低表面電荷密度的親水表面的表面組合物。該表面組成通過用覆蓋表面的前述R10基團如-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)，優(yōu)選-CH2OH化學改性無機氧化物基載體，如硅石、優(yōu)選硅膠而實現(xiàn)。這些R10基團是親水的，仍是非常弱的酸，這意味著這些R10基團在低于約12左右的pH下基本上不離解，并因此不帶電。如果蛋白質的復雜混合物具有該表面組合物，則電荷相互作用被最小化，但氫鍵相互作用由于溶劑化蛋白質的較高熵態(tài)而有利于水溶劑的氫鍵，勝過鍵接到表面上的蛋白質氫。該表面組合物因此使非所需蛋白質與高容量親和性載體的非選擇性連接最小化，得到在高容量下的高純化因子。
包含R10部分和至少一種位于無機物質的表面上的連接劑的固體也在本發(fā)明的范圍內。這些固體可被認為是一種可″原樣″銷售給所述固體的使用者的中間體。在分離所需分析物之前，使用者可隨后使連接部分與連接劑基團反應。連接劑基團也可任選地被封端或以其它方式成為前體形式，這樣在它與連接部分反應之前需要進一步的化學處理。
以下工作實施例用于說明本發(fā)明的一些方面，且不應理解為對本發(fā)明范圍的限定。本發(fā)明可以以沒有通過實施例說明的實施方式實施，而不背離本文所公開的本發(fā)明的主旨或基本特征。例如，本發(fā)明可由本領域熟練技術人員如權利要求所述進行實踐，且內容上與權利要求書所述相當?shù)娜魏螌嵤┓桨赴ㄔ谒蟮陌l(fā)明范圍內。
實施例1和2在常規(guī)硅石介質上的非特定連接這些實施例表明，現(xiàn)有技術的凈未涂覆帶電硅石表面強烈吸附蛋白質，這主要是基于等電點和硅石的表面積。測試了兩種硅石實施例1和2。實施例1是在150攝氏度下4小時熱處理之后具有表面積＝161m2/g的低表面積硅膠(微孔＝73m2/g；中孔＝88m2/g，孔體積＝0.373cc/g，平均孔直徑＝93埃)。實施例2是在150攝氏度下4小時熱處理之后的較高表面積/孔體積硅膠，表面積＝253m2/g(微孔＝35m2/g；中孔＝218m2/g，孔體積＝2.445cc/g，平均孔直徑＝387埃)。以下實施例描述一個步驟，其中凈硅石樣品與蛋白質在水溶液中的復雜混合物接觸。對所得上層清液隨后通過用于蛋白質吸附的等電聚焦凝膠電泳進行分析。
將一小瓶(325μg蛋白質/小瓶)Pharmacia 3.6-9.3寬pI校正成套工具(目錄#17-0471-01)溶解在eppendorf管中的200μl DI H2O中。加入0.005g實施例1。在另一eppendorf管中，將一小瓶(325μg蛋白質/小瓶)Pharmacia 3.6-9.3寬pI校正成套工具(目錄#17-0471-01)溶解在200μl DI H2O中，并隨后加入0.005g實施例2。將這兩種樣品抄底攪拌1小時。這些樣品在Pharmacia PhastGel裝置上進行3-9等電聚焦凝膠電泳。結果示于圖2。
欄描述2，7 Pharmacia 3.6-9.3寬pI標準3，4實施例15，6實施例2圖2表明，帶(蛋白質)從與實施例1和2接觸的樣品上消失，意味著這些蛋白質被吸附到硅石表面上。高表面積硅石，實施例2，吸附等電點大于5.9的所有蛋白質，而較低表面硅石，實施例1，僅吸附具有較高pI的蛋白質。數(shù)據(jù)清楚地表明，未涂覆硅石主要通過強靜電相互作用連接蛋白質，且表面在該pH(假設為約5.5左右)下帶負電。
實施例3、4和5在經(jīng)憎水處理的載體上的非選擇性連接這些實施例表明，如果硅石覆蓋有憎水基團，甲基或辛基基團，則出現(xiàn)強吸附，尤其在溶劑的中等離子強度(約0.1M鹽)下。實施例3是來自W.R.Grace & Co.的未涂覆凈商業(yè)寬孔硅石，XWP-gel P005，SA＝72m2/g，具有50nm的孔中值，已在150攝氏度下活化2小時。
實施例4是以下描述的已覆蓋有甲基基團的實施例3硅石。實施例5是以下描述的已覆蓋有辛基基團的實施例3硅石。實施例4制備如下。在250ml圓底燒瓶中，加入50ml甲苯和6.16g甲基三乙氧基硅烷。隨后將10.1g實施例3加入甲苯/甲基三乙氧基硅烷溶液中。N2流動5分鐘以去除空氣并在整個反應中連續(xù)流動。樣品在110攝氏度下回流和攪拌4小時。隨后過濾樣品并用50毫升甲苯洗滌3次。樣品被再制漿到50ml甲苯中，隨后過濾并用50毫升甲苯洗滌3次。樣品隨后被再制漿到50ml甲苯中，隨后過濾并用50毫升甲苯洗滌3次。樣品在110攝氏度下干燥并隨后在150攝氏度下煅燒4小時。
實施例5制備如下。將10.1g實施例3用溶解在13.25g作為溶劑的甲苯中的0.53g辛基三乙氧基硅烷浸漬至初始濕度。樣品隨后在通風櫥中空氣干燥2小時，在110攝氏度下干燥1小時并隨后在150攝氏度下煅燒4小時。
在0.1M NaCl中的蛋白質吸附測定如下。因為實施例4和5是憎水的，所以需要潤濕步驟以確保與蛋白質溶液的良好接觸。向eppendorf管中加入0.014g實施例3作為對照物。隨后加入1ml乙醇，攪拌并離心處理以去除上層清液。加入0.5ml乙醇和0.5ml DI H2O，攪拌并離心處理以去除上層清液。加入0.25ml乙醇和0.75ml DI H2O，攪拌并離心處理以去除上層清液。加入1ml DI H2O，攪拌并離心處理以去除上層清液。DI H2O洗滌重復4次以上。加入1ml 0.1M NaCl+0.02M PBS pH＝7.4，攪拌并離心處理以去除上層清液。重復用0.1M NaCl+0.02M PBS pH＝7.4洗滌4次以上。將兩小瓶的Sigma IEF Mix 3.6-9.3等電聚焦標識物(目錄#I-3018)溶解到500μl 0.1M NaCl+0.02M PBS pH＝7.4中。將溶解的IEF Mix加入eppendorf管中。
向另一eppendorf管中加入0.014g實施例4。針對實施例4進行與實施例3相同的潤濕步驟和蛋白質加入。
向第三個eppendorf管中加入0.014g實施例5。針對實施例5進行與實施例3相同的潤濕步驟和蛋白質加入。
將一小瓶的Sigma IEF Mix 3.6-9.3等電聚焦標識物(目錄#I-3018)溶解到250μl 0.1M NaCl+0.02M PBS pH＝7.4中。這是標準的未處理蛋白質混合物。
對所有的樣品抄底攪拌1小時。樣品在Pharmacia PhastGel裝置上進行3-9等電聚焦凝膠電泳。結果示于圖3。
欄描述1，8 標準蛋白質混合物2，3 實施例34，5 實施例46，7 實施例5從圖3可以看出，盡管硅石的表面電荷被溶解的鹽即0.1M NaCl所″屏蔽″，且沒有出現(xiàn)蛋白質連接，但甲基、尤其辛基基團的憎水相互作用非常強，且許多帶消失。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，在以上條件下，憎水表面組合物可導致非選擇性連接。
實施例6、7和8本發(fā)明的實施例這些實施例顯示采用根據(jù)本發(fā)明的R10基團用于降低與硅石表面的非選擇性蛋白質連接的優(yōu)點。實施例6與實施例3相同，只是它在200攝氏度下活化2小時。實施例7是中間體表面組合物，其中硅石表面連接有Si-R基團，其中R是乙酰氧甲基。實施例8是本發(fā)明表面組合物的一個例子，其中硅石表面連接有Si-R10基團，其中R10是甲基羥基。另外顯示了具有高和低離子強度溶劑的實施例8的優(yōu)點。
實施例7制備如下。在250ml圓底燒瓶中，加入50ml甲苯和20.42g乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷。將15.05g實施例6加入甲苯/乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷溶液中。N2流動5分鐘以去除空氣并在整個反應中持續(xù)流動。樣品在110攝氏度下回流和攪拌16小時。然后，過濾樣品并用50毫升甲苯洗滌3次。樣品被再制漿到50ml甲苯中，過濾并用50毫升甲苯洗滌5次。樣品隨后被再制漿到50ml甲苯中，過濾并用50毫升甲苯洗滌5次。在110攝氏度下對其進行干燥，隨后在150攝氏度下煅燒4小時。
實施例8的制備描述如下。在250ml圓底燒瓶中加入10g實施例7和100ml 0.01M H2SO4。N2流動5分鐘以去除空氣并在整個反應中持續(xù)流動。樣品在100攝氏度下回流和攪拌18小時。然后，過濾樣品并用100ml80攝氏度DI H2O洗滌2次。樣品被再制漿到100ml 80攝氏度DI H2O中；過濾并用100ml 80攝氏度DI H2O洗滌2次；在110攝氏度下干燥并隨后在150攝氏度下煅燒4小時。
向eppendorf管中加入0.007g實施例7。將一小瓶的Sigma IEF Mix3.6-9.3等電聚焦標識物(目錄#I-3018)溶解到250μl 0.14M NaCl+0.02M PBS pH＝7.2中并隨后加入eppendorf管中。將樣品標為實施例7高鹽。
向第二個eppendorf管中加入0.007g實施例8。將一小瓶Sigma IEFMix 3.6-9.3等電聚焦標識物(目錄#I-3018)溶解到250μl 0.14M NaCl+0.02M PBS pH＝7.2中并隨后加入eppendorf管中。將該樣品標為實施例8高鹽。
向第三個eppendorf管中加入0.007g實施例7。將一小瓶的SigmaIEF Mix 3.6-9.3等電聚焦標識物(目錄#I-3018)溶解到250μl 0.02MPBS pH＝7.4中并隨后加入eppendorf管中。將該樣品標為實施例7低鹽。
向第四個eppendorf管中加入0.007g實施例8。將一小瓶的SigmaIEF Mix 3.6-9.3等電聚焦標識物(目錄#I-3018)溶解到250μl 0.02MPBS pH＝7.4中并隨后加入eppendorf管中。將該樣品標為實施例8低鹽。
向第五個eppendorf管中，將一小瓶的Sigma IEF Mix 3.6-9.3等電聚焦標識物(目錄#I-3018)溶解到250μl DI H2O中并隨后加入eppendorf管中。將該樣品標為蛋白質混合物標準。
所有的樣品被抄底攪拌1小時。所有的樣品隨后在PharmaciaPhastGel裝置上進行3-9等電聚焦凝膠電泳。結果示于圖4。
欄描述1，8 蛋白質混合物標準實施例7 高鹽實施例8 高鹽實施例7 低鹽實施例8 低鹽該實驗的結果清楚地表明，用于拒絕對硅石表面的非特定吸附的實施例8(本發(fā)明的一個實施方案)的優(yōu)點在于，在″高鹽″和″低鹽″兩種條件下存在所有的蛋白質帶，參見欄3和7。
實施例8的表征本發(fā)明的表面組合物通過以下描述的分析進行表征。
圖5給出了實施例8從1400-4000cm-1的漫反射紅外光譜，該實施例具有包含-CH2OH基團的表面組合物。紅外數(shù)據(jù)在Nicolet Magna 550上使用Spectra-Tech漫反射附件而獲得。樣品在KBr中稀釋成1∶20，進行512次掃描，在4cm-1分辨率下收集。在2937和2897cm-1處的峰清楚地表明-CH2基團的存在。-OH共振帶被包埋在3483cm-1處的寬峰中。為了對比，圖6給出了實施例7的光譜，其表面組合物包含-CH2OCOCH3基團。新的共振出現(xiàn)在1726、1421、和1374cm-1處，這些是與乙酰氧基基團有關的特征共振。
圖7給出了實施例8的MAS Si29NMR光譜。單脈沖29Si核磁共振實驗在共振頻率為39.76MHz下操作的Chemagnetics CMX 200上進行。樣品被填充在14mm筆式轉子中。對應于22度脈沖的4μs脈沖長度與60s弛豫延遲一起使用。在-62ppm處的清晰共振已被確認為O3Si-CHX-，參見Vicic，D.，和Maciel，J.Am.Chem.Soc.105(1983)，第3767-3776頁。
圖8給出了實施例8的X-射線光電子光譜。樣品用雙面膠帶安裝在樣品樁上并進行2小時的碳、氧、和硅掃描。光譜被擬合成兩個峰，被確認為污染物C，284.7eV，和醇C原子，286.7eV，參見″Handbook ofX-ray Photoelectron Spertroscopy″，Moulder，J.F.，Sticke，W.F.，Sobol，P.E.，和Bomben，K.D.，Perkin-Elmer Corp，Eden Prairie，MN，1992。為了對比，實施例7的XPS光譜在圖9中給出。在這種情況下，還觀察到與羧基碳有關的在289eV處的峰。這些研究表明，實施例8(本發(fā)明的一個實施方案)的表面組合物包含甲基羥基基團-CH2OH，如，本文定義的R10。
R10基團(-CH2OH)在實施例8產(chǎn)物上的濃度是2.01個基團/nm2，并由硅石載體(72m2/g)的表面積和最終產(chǎn)物的碳含量(1.907％)計算得到。表面積使用常規(guī)BET表面積方法測定，碳含量(％重量)使用C-144 LECO型碳分析器測定。
實施例9(連接部分的連接和對使用本發(fā)明時非特定連接減少的說明)將842g甲苯和3.11g 3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入2000ml圓底燒瓶中。然后，將200g在200攝氏度下煅燒2小時的Grace Davison XWP 500埃硅石加入該圓底燒瓶，隨后加入15個沸騰碎片。將圓底燒瓶放在加熱套中并連接冷凝器。將加熱套連接到在速度115rpm下操作的軌道振蕩器的頂部。在整個反應過程中將N2通入圓底燒瓶和冷凝器以去除空氣。將樣品加熱至沸騰(約110攝氏度)4小時。將樣品過濾并用2×200ml甲苯洗滌，在115攝氏度下干燥并隨后在150攝氏度下煅燒2小時。該樣品被標為中間體A。所得-CH3H6NH2基團的濃度計算為0.54并基于載體的表面積(BET)(88m2/g)、中間體的碳含量(LECO)(0.321％)和氮含量(0.11％)計。氮含量(％重量)在Carlo Erba NA 1500分析器上并使用基于改性的Dumas方法的方法，使用含氧氣氛和熱傳導檢測而測定。參見ASTM D5373(用于煤)和ASTM 5291。
將800ml 1M NaCl與中間體A在燒杯中混合并用磁性攪拌器攪拌。起始pH是4.79。滴加1M HCl，直至pH變成2。pH在2.0下保持15分鐘。將樣品過濾并用5×200ml DI H2O洗滌，在115攝氏度下干燥并隨后在200攝氏度下煅燒2小時。該樣品被標為中間體B。
將680g甲苯和177.25g乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷與中間體B在圓底燒瓶中混合。將15個沸騰碎片放入圓底燒瓶中，所述燒瓶被放在加熱套中并連接有冷凝器。將加熱套連接到在速度115rpm下操作的軌道振蕩器上。在整個反應過程中將N2通入圓底燒瓶和冷凝器以去除空氣。將樣品加熱至沸騰(約110攝氏度)24小時，過濾，用3×200ml甲苯洗滌，在115攝氏度下干燥并隨后在150攝氏度下煅燒2小時。該樣品被標為中間體C。
將900ml二噁烷和100ml 0.1M H2SO4與中間體C在圓底燒瓶中混合。將15個沸騰碎片放在圓底燒瓶中，所述燒瓶被放在加熱套中并連接有冷凝器。將加熱套連接到在速度115rpm下操作的軌道振蕩器頂部。在整個反應過程中將N2通入圓底燒瓶和冷凝器以去除空氣。將樣品加熱至沸騰(約100攝氏度)4小時，過濾，用2×200ml甲苯洗滌，在115攝氏度下干燥并隨后在150攝氏度下煅燒2小時。該樣品被標為中間體D。該產(chǎn)物的R10基團(-CH2OH)的濃度是5.65，且是通過計算中間體D的碳含量并隨后減去可歸屬于C3H6NH2基團的碳的量，并隨后進行實施例8中的計算而測定的。這樣，C3H6NH2基團的濃度計算為0.39并低于由中間體A在進行化學處理以連接R10基團之前的數(shù)據(jù)的計算值。不局限于特殊理論，氮含量的些許變化(0.11對0.08)據(jù)信是由于標準偏差或可能是由于如果產(chǎn)生R10基團時C3H6NH2基團的些許浸析。
將20.75g中間體D和400ml偶聯(lián)緩沖劑(0.1M Na2PO4+0.15M NaCl；pH＝7.0)在1000ml燒杯中混合并攪拌5分鐘。將樣品過濾以形成濕濾餅，放在1000ml燒杯中并隨后將587.66g 50wt.％戊醛和5.91g NaCNBH3加入燒杯。將樣品攪拌4小時，過濾，用400ml偶聯(lián)緩沖劑洗滌并在400ml偶聯(lián)緩沖劑中再制漿，以得到新樣品，然后過濾，用400ml偶聯(lián)緩沖劑洗滌和在400ml偶聯(lián)緩沖劑中再制漿2次。將重新洗滌和再制漿的樣品過濾并隨后用400ml偶聯(lián)緩沖劑洗滌。該樣品被標為中間體E。
將75.44g偶聯(lián)緩沖劑和24.56g來自Repligen的蛋白質A(濃度為50g蛋白質A/升)加入250ml圓底燒瓶中。將2.52g NaCNBH3和中間體E加入該燒瓶并在振蕩器上混合4小時。將樣品過濾并4次用100ml偶聯(lián)緩沖劑洗滌。隨后將75.44g偶聯(lián)緩沖劑、2.52g NaCNBH3和0.44g乙醇胺加入250ml圓底燒瓶，并隨后在振蕩器上混合4小時。將樣品過濾并4次用100ml偶聯(lián)緩沖劑洗滌。將樣品放在20％乙醇中并在4攝氏度下儲存。該樣品被標為實施例9。由LECO碳，確定實施例9是34.67mg蛋白質A/克硅石。
將填充了直接連接有-Si-CH2OH的硅石的0.66×2cm I.D.親和性柱首先用20mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.4)平衡。將5ml的0.5mg/ml兔多克隆IgG在Teredinobacter turnirae培養(yǎng)液的上層清液中的加料樣品加載到柱上。隨后用磷酸鹽緩沖劑洗滌親和性柱，直至在280nm處的UV吸光率回歸至基線。將IgG用0.1M乙酸，pH3.0在流速1ml/min下從親和性柱中洗脫(參見圖9中的窄峰)。圖10給出了通過監(jiān)控在280nm處的吸光率而得到的加載、洗滌和從親和性柱洗脫時的色譜圖。
將100μl來自圖10所示親和性純化的洗脫劑的純化IgG注入到尺寸排阻色譜柱上，用0.1M Na2SO4和0.05M NaH2PO4的洗脫緩沖劑(pH5)在流速1毫升/min下洗脫。來自尺寸排阻色譜柱的洗脫劑的A280分布描繪于圖11，其中給出了具有非常少的來自細胞培養(yǎng)液的雜質的IgG的單個峰。通過對比，圖12給出了被加入細胞培養(yǎng)液的起始兔多克隆IgG的使用相同的條件的尺寸排阻色譜圖。根據(jù)對圖11和12的比較可明顯看出，由使用實施例9的細胞培養(yǎng)液純化的IgG(圖11)比起始IgG(圖12)更純。因此，圖11和12表明，與硅石介質的非選擇性連接通過本發(fā)明固體被最小化。
文獻目錄Abercrombie，D.M.等人Affinity Chromatography(編輯Rickwood，D.&Hames，B.D.)(IRL Press，Washington，DC，1983).Argos，P.等人Methods in Enzymology(編輯Deutscher，M.P.)(AcademicPress，San Deigo，CA，1990).Gagnon，P.Purification Tools for Monoclonal Antibodies(ValidatedBiosystems，Tuscon，1996).Hermanson，G.T.，Mallia，A.K. & Smith，P.K.Immobilized AffinityLigand Techniques(Academic Press，Inc.，San Diego，1992).Mohan，S.B.等人Affinity Separations A Practical Approach(編輯Rickwood，D.& Hames，B.D.)(IRL Press，Oxford，1997).Scopes，R.K.Protein Purification-Principles and Practice(編輯Cantor，C.R.)(Springer，New York，1994).Wheelwright，S.M.Protein Purification Design and Scale up ofDownstream Processing(John Wiley & Sons，Inc.，New York，1991).Wilson，R.C.等人Protein Purification from Molecular Mechanisms toLarge-Scale Processes(編輯Comstock，M.J.)(The American Chemical Society，Washington，D.C.，1990).Weetall，″Covalent Coupling Methods for Inorganic Support Materials″，Methods in Enzymology，vol.XLIV，K.Mosbach編輯，第134-148，1976.
權利要求
1.一種包含無機物質和位于所述無機物質的至少一個表面上的部分R10的固體，其中所述無機物質是無機氧化物，所述R10基團選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
2.權利要求1的固體，其中R10通過二價部分或原子連接到所述無機物質的至少一個表面。
3.權利要求1的固體，其中R10選自-CH2OH、-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH。
4.權利要求1的固體，其中R10是-CH2OH。
5.權利要求1的固體，其中所述無機物質是無機金屬氧化物、硅酸鹽或硅鋁酸鹽。
6.權利要求1的固體，其中無機物質是磁響應的。
7.權利要求5的固體，其中無機金屬氧化物是硅石、礬土、硅石-礬土、氧化鋯、鋯酸鹽、二氧化鈦、受控孔玻璃或其混合物。
8.權利要求5的固體，其中無機金屬氧化物是色譜級硅石。
9.權利要求5的固體，其中無機金屬氧化物是硅膠。
10.一種固體，包含(i)無機物質，(ii)位于所述無機物質的至少一個表面上的部分R10，和(iii)至少一個能夠連接分析物的連接部分，其中所述R10選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
11.權利要求10的固體，其中所述至少一個連接部分選自配體、蛋白質、肽、抗原和核酸。
12.權利要求10的固體，其中所述至少一個連接部分通過至少一個連接劑連接到有機物質上。
13.權利要求10的固體，其中所述至少一個連接部分通過至少一個連接劑連接到所述無機物質上，其中所述至少一個連接部分是受體、抗體、抗原、DNA或RNA。
14.權利要求10的固體，其中所述至少一個連接劑是任選地被取代的二價化學基團。
15.權利要求10的固體，包含約1-約10個R10部分/nm2固體。
16.權利要求15的固體，包含0.04-約4個連接部分/nm2固體。
17.權利要求16的固體，其中所述無機物質是硅石，R10是-CH2OH。
18.權利要求17的固體，其中所述無機物質是硅膠。
19.權利要求17的固體，其中所述無機物質是色譜級硅石。
20.權利要求14的固體，其中任選地被取代的化學基團是包含n個-R-基團的烴基，其中n是-R-基團的數(shù)目，且n是至少為2的整數(shù)，其中n-1個-R-基團任選地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝NO-、-ON＝C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亞芳基、取代的亞芳基、亞環(huán)烷基、取代的亞環(huán)烷基、亞環(huán)鏈烯基、取代的亞環(huán)鏈烯基、二價雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基所替代，其中R4和R5獨立地是H、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。
21.權利要求12的固體，其中所述至少一個連接劑是具有從連接部分度量至無機物質的長度為約1-約30原子的二價任選地被取代的化學基團，其中該化學基團包含至少一個-R-基團，其中所述-R-基團選自-CH2-、-C(R1)H-、-C(R2)＝C(R3)-和-C≡C-，其中R1、R2和R3獨立地是H、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基，所述-R-基團任選地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝NO-、-ON＝C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亞芳基、取代的亞芳基、亞環(huán)烷基、取代的亞環(huán)烷基、亞環(huán)鏈烯基、取代的亞環(huán)鏈烯基、二價雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基所替代，其中R4和R5獨立地是H、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。
22.權利要求12的固體、其中所述至少一個連接劑獨立地通過醚、硫醚、酯、硫代酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、膦酸酯、磷酯、氨基磷酸酯、胺、酰胺、酰亞胺、脲、硫脲、磺酰胺、亞砜、砜、二硫化物、肟、O-?；?、O-氨基甲?；?、O-酰基氧基烷基肟、O-?；趸榛趸?、O-肟基磷酸酯、O-肟基膦酸酯、O-肟基氨基磷酸酯或C＝C鍵連接到所述至少一個連接部分和無機物質上。
23.權利要求12的固體，其中所述至少一個連接劑由溴化氰，N-羥基琥珀酰亞胺酯，羰基二咪唑，還原胺化，2-氟-1-甲基-吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽活化，1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺媒介的酰胺鍵形成，甲苯磺酰氯，tresyl氯化物，二乙烯基砜，二氫噁唑酮，氰尿酰氯，碘乙?；蜾逡阴；罨?，馬來酰亞胺，吡啶基二硫化物，環(huán)氧化合物，2-亞氨基硫代戊環(huán)5，5-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)，酰肼，重氮鹽或Mannich縮合而形成。
24.一種分離在混合物中與至少一種其它組分混合的分析物的方法，所述方法包括(1)將權利要求10的固體與所述混合物接觸，其中所述至少一個連接部分具有對所述分析物的特定親和性；(2)使所述分析物結合到所述至少一個連接部分上；(3)從具有鍵接到其上的所述分析物的固體中去除所述至少一種其它組分；(4)回收所述固體；和(5)從固體中分離分析物。
25.權利要求24的方法，其中所述至少一種其它組分在步驟(3)中通過用流體洗滌固體，得到洗滌液并丟棄該洗滌液而去除；其中所述分析物在步驟(5)中通過將洗脫劑放在固體上和收集洗脫劑而分離。
26.權利要求2 4的方法，其中所述固體包含約1-約10個R10部分/nm2。
27.權利要求26的方法，其中所述固體包含約0.04-約4個連接部分/nm2固體。
28.權利要求24的方法，其中所述無機物質是無機金屬氧化物、金屬硅酸鹽或硅鋁酸鹽。
29.權利要求28的方法，其中無機物質是磁響應的。
30.權利要求28的方法，其中無機金屬氧化物是硅石、礬土、硅石-礬土、氧化鋯、鋯酸鹽、二氧化鈦、受控孔玻璃或其混合物。
31.權利要求28的方法，其中無機金屬氧化物是色譜級硅石。
32.權利要求28的方法，其中無機金屬氧化物是硅膠。
33.權利要求24的方法，其中所述無機金屬物質是硅石，R10是-CH2OH。
34.權利要求33的方法，其中所述硅石是硅膠。
35.權利要求33的方法，其中所述硅石是色譜級硅石。
36.權利要求24的方法，其中所述連接部分是生物素，所述分析物是抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、連接到抗生物素蛋白上的物質或連接到抗生蛋白鏈菌素上的物質。
37.權利要求24的方法，其中所述連接部分是抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，所述分析物是生物素或被生物素化。
38.一種減少雜質與包含無機物質的固體的非特定連接的方法，其中無機物質包含至少一個其上發(fā)生非特定連接或造成非特定連接發(fā)生的官能團，另外其中所述無機物質是無機氧化物，所述方法包括(1)提供所述固體；(2)使無機物質的所述至少一個官能團與反應物反應，以在無機物質的至少一個表面上產(chǎn)生部分R10，其中R10選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)，且R10以足夠的量存在于所述無機物質的表面上，使得當無機物質與包含雜質的混合物接觸時，所述雜質與所述固體的非特定連接得到減少。
39.權利要求38的方法，其中R10在步驟(2)之前通過不存在于無機物質的組成中的部分或原子連接到所述無機物質上。
40.權利要求38的方法，其中R10選自-CH2OH、-CH(OH)CH3和-CH2CH2OH。
41.權利要求40的方法，其中R10是-CH2OH。
42.權利要求38的方法，其中所述無機物質是無機金屬氧化物。
43.權利要求42的方法，其中無機金屬氧化物是磁響應的。
44.權利要求42的方法，其中無機金屬氧化物是硅石、礬土、硅石-礬土、氧化鋯、鋯酸鹽、二氧化鈦、受控孔玻璃，且其上的官能團包括羥基。
45.權利要求42的方法，其中所述無機金屬氧化物是色譜級硅石。
46.權利要求42的方法，其中所述無機金屬氧化物是硅膠。
47.一種固體，包含(i)無機物質，(ii)位于所述無機物質的至少一個表面上的部分R10，和(iii)至少一個連接劑，其中所述無機物質是無機氧化物，所述R10選自-CH2OH、CH(OH2)、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH2)CH3、-CH2CH(OH2)和CH(OH)CH2(OH)。
48.權利要求47的方法，其中所述至少一個連接劑是任選地被取代的二價化學基團。
49.權利要求48的方法，其中任選地被取代的化學基團是包含n個-R-基團的烴基，其中n是-R-基團的數(shù)目且n是至少為2的整數(shù)，其中n-1個-R-基團任選地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝NO-、-ON＝C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亞芳基、取代的亞芳基、亞環(huán)烷基、取代的亞環(huán)烷基、亞環(huán)鏈烯基、取代的亞環(huán)鏈烯基、二價雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基所替代，其中R4和R5獨立地是H、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。
50.權利要求47的方法，其中所述至少一個連接劑是具有從所述基團端部度量至無機物質的長度為約1-約30原子的二價任選地被取代的化學基團，其中所述化學基團包含至少一個-R-基團，其中所述-R-基團選自-CH2-、-C(R1)H-、-C(R2)＝C(R3)-和-C≡C-，其中R1、R2和R3獨立地是H、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基，所述-R-基團任選地被-O-、-S-、羰基、硫代羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝NO-、-ON＝C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亞芳基、取代的亞芳基、亞環(huán)烷基、取代的亞環(huán)烷基、亞環(huán)鏈烯基、取代的亞環(huán)鏈烯基、二價雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基所替代，其中R4和R5獨立地是H、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。
51.權利要求47的方法，其中所述至少一個連接劑通過醚、硫醚、酯、硫代酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、膦酸酯、磷酯、氨基磷酸酯、胺、酰胺、酰亞胺、脲、硫脲、磺酰胺、亞砜、砜、二硫化物、肟、O-酰基肟、O-氨基甲?；?、O-?；趸榛?、O-?；趸檠趸?、O-肟基磷酸酯、O-肟基膦酸酯、O-肟基氨基磷酸酯或C＝C鍵連接到無機物質上。
52.權利要求47的方法，其中所述至少一個連接劑由溴化氰，N-羥基琥珀酰亞胺酯，羰基二咪唑，還原胺化，2-氟-1-甲基-吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽活化，1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺媒介的酰胺鍵形成，甲苯磺酰氯，tresyl氯化物，二乙烯基砜，二氫噁唑酮，氰尿酰氯，碘乙酰基或溴乙?；罨?，馬來酰亞胺，吡啶基二硫化物，環(huán)氧化合物，2-亞氨基硫代戊環(huán)5，5-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)，酰肼，重氮鹽或Mannich縮合而形成。
53.權利要求47的方法，包含約1-約10個R10部分/nm2固體。
54.權利要求53的固體，其中所述無機物質是硅石，R10是-CH2OH。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種當復雜混合物的至少一種化學組分能夠被選擇性吸附時可用于分離該混合物中的化學組分的固體和方法。本發(fā)明固體包含無機物質和位于所述無機物質的至少一個表面上的部分(R
文檔編號B01J20/281GK1568222SQ02820326
公開日2005年1月19日 申請日期2002年8月12日 優(yōu)先權日2001年8月14日
發(fā)明者R·F·沃姆斯貝歇爾 申請人:格雷斯公司