海微小桿菌及微生物菌劑和它們的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種海微小桿菌(Exiguobacterium?marinum)，其保藏編號(hào)為CGMCC?NO.8841。本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，所述菌體包括保藏編號(hào)為CGMCC?NO.8841的海微小桿菌。本發(fā)明還提供了如上所述的海微小桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明可以更加有效地提高治理海洋石油污染的效率。
【專利說(shuō)明】海微小桿菌及微生物菌劑和它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明 涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種海微小桿菌、一種微生物菌劑和它們的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋溢油的頻繁發(fā)生不僅給海洋養(yǎng)殖業(yè)、旅游業(yè)等造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境及人類健康造成長(zhǎng)遠(yuǎn)的負(fù)面影響。因此，如何消除海洋溢油污染、修復(fù)受損海洋生態(tài)環(huán)境成為海洋環(huán)境保護(hù)的重要內(nèi)容之一。隨著石油的海上開采和運(yùn)輸?shù)陌l(fā)展，海洋石油污染的問(wèn)題日趨嚴(yán)重。例如鉆井平臺(tái)傾覆、輸油管道爆裂或油輪失事，都會(huì)導(dǎo)致大量石油泄漏到海洋環(huán)境中，如不采取科學(xué)有效的應(yīng)對(duì)措施予以清除，都會(huì)造成難以估量的海洋生態(tài)災(zāi)難。
[0003]實(shí)踐證明，海洋石油污染一旦發(fā)生，如能采取有效措施，損失就會(huì)小得多。迄今為止，海面油污的處理大致分為物理處理法、化學(xué)處理法和生物處理法三種。物理處理法主要采用的設(shè)備包括:攔油柵、浮油回收船、撇油器、吸油欄、消油劑噴灑裝置、浮動(dòng)油囊、輕便儲(chǔ)油器、油拖網(wǎng)等；化學(xué)處理法是噴灑各種化學(xué)藥劑，如分散劑、去垢劑、洗滌劑和其他表面活性劑等，采用這種方法能夠把海面的浮油分散成極小的顆粒，使其在海水中乳化、分散、溶解或沉降到海底；生物處理法是根據(jù)某些微生物具有氧化和分解石油的能力，來(lái)清除海中的石油。
[0004]其中，生物處理法由于具有成本低、較徹底、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為處理溢油的一種有效途徑。但是生物處理法的效率受到微生物的石油烴降解速率的限制，而目前能夠降解石油烴的微生物的降解速率仍然較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有的微生物菌株降解石油烴的速率較低的缺陷，本發(fā)明提供了一種海微小桿菌，該海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)的保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841。
[0006]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，所述菌體包括保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841的海微小桿菌。
[0007]本發(fā)明還提供了如上所述的海微小桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了如上所述的海微小桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解原油中的應(yīng)用。
[0008]通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明的微生物菌株能夠以較高的速率降解石油烴，從而提高了治理海洋石油污染的效率。
[0009]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
[0010]生物材料保藏
[0011]本發(fā)明的海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)是本發(fā)明的發(fā)明人從山東煙臺(tái)渤海采集的海岸帶凍結(jié)沉積樣品中分離的純培養(yǎng)物，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841，保藏日期為2014年2月21日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，分類命名為海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明提供了一種海微小桿菌，該海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)的保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8841。
[0014]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，所述菌體包括保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841的海微小桿菌。
[0015]其中，所述微生物菌劑中含有的菌體的量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每克所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)可以為(2-300) X 108CFU。
[0016]根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基的種類可以在很大范圍內(nèi)改變，可以為各種能夠用于培養(yǎng)海微小桿菌的培養(yǎng)基，例如，可以為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，用于菌種的保存；而發(fā)酵的培養(yǎng)基一般用于生產(chǎn)，這些培養(yǎng)基的種類也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。上述培養(yǎng)基能夠商購(gòu)得到或者根據(jù)“微生物培養(yǎng)基手冊(cè)”(Microbiology Culture Media Manual)的記載制備得到。例如，種子培養(yǎng)基可以為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其含有l(wèi)_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化鈉和15-20g/L的瓊脂。例如發(fā)酵培養(yǎng)基可以含有:40-150g/L的豆餅粉、0.5_8g/L的氯化鈉、
0.5-5g/L的碳酸鈣、2-10g/L的磷酸二氫鉀和l-10g/L的硫酸亞鐵。
[0017]其中，上述各種培養(yǎng)基可以按照常規(guī)的滅菌方法進(jìn)行滅菌后備用，例如在115-125°C和1.5-2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的條件下滅菌10_30分鐘。
[0018]其中，為了進(jìn)一步提高所述微生物菌劑降解石油烴的效果，優(yōu)選地，所述微生物菌劑還含有營(yíng)養(yǎng)鹽；所述營(yíng)養(yǎng)鹽包括NaBr、H3B03、SrCl2, NaF、酒石酸鉀鈉和檸檬酸三鈉。更優(yōu)選地，每千克微生物菌劑中含有50-100mg的NaBr、10-40mg的H3B03、10_40mg的SrCl2、l-5mg的NaF、0.5_5g的酒石酸鉀鈉和IO-1OOmg的檸檬酸三鈉。
[0019]其中，所述微生物菌劑的制備方法可以包括:將海微小桿菌接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使得到的每克微生物菌劑的總活菌數(shù)為(2-300) X 108CFU。培養(yǎng)的溫度可以為28°C。
[0020]其中，為了進(jìn)一步提高所述微生物菌劑降解石油烴的效果，優(yōu)選地，所述微生物菌劑的制備方法還可以包括:將在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后得到的物料與營(yíng)養(yǎng)鹽混合；所述營(yíng)養(yǎng)鹽包括NaBr、H3B03、SrCl2, NaF、酒石酸鉀鈉和檸檬酸三鈉。更優(yōu)選地，營(yíng)養(yǎng)鹽的用量使得每千克所述微生物菌劑中含有50-100mg的NaBr、10-40mg的H3B03、10_40mg的SrCl2、l-5mg的NaF、0.5_5g的酒石酸鉀鈉和IO-1OOmg的檸檬酸三鈉。
[0021]本發(fā)明還提供了如上所述的海微小桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。
[0022]其中，所述石油烴可以包括烷烴和/或芳烴；所述烷烴的碳原子數(shù)可以為11-35，所述芳烴的碳原子數(shù)可以為10-20。
[0023]本發(fā)明還提供了如上所述的海微小桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解原油中的應(yīng)用。
[0024]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明:
[0025]實(shí)施例1
[0026]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的海微小桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0027]將保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841的海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0028]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有80g/L的豆餅粉、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的海微小桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,所得到的培養(yǎng)液即為本實(shí)施例的微生物菌劑。[0029]實(shí)施例2
[0030]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的海微小桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0031]將保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841的海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0032]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有80g/L的豆餅粉、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的海微小桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,在每kg上述得到的培養(yǎng)液中，加入80mg的NaBr、30mg的Η3Β03、20mg的SrCl2、3mg的NaF、2g的酒石酸鉀鈉和50mg的檸檬酸三鈉，混合后得到的物料即為本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0033]實(shí)施例3
[0034]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的海微小桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0035]將保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841的海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0036]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有40g/L的豆餅粉、6g/L的氯化鈉、lg/L的碳酸鈣、8g/L的磷酸二氫鉀和8g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的海微小桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,在每kg上述得到的培養(yǎng)液中，加入50mg的NaBrUOmg的Η3Β03、40mg的SrCl2、5mg的NaF、5g的酒石酸鉀鈉和IOOmg的檸檬酸三鈉，混合后得到的物料即為本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0037]實(shí)施例4
[0038]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的海微小桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0039]將保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841的海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0040]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有120g/L的豆餅粉、lg/L的氯化鈉、4g/L的碳酸鈣、3g/L的磷酸二氫鉀和2g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的海微小桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,在每kg上述得到的培養(yǎng)液中，加入90mg的NaBr、35mg的Η3Β03、15mg的SrCl2、2mg的NaF、lg的酒石酸鉀鈉和15mg的檸檬酸三鈉,混合后得到的物料即為本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0041]對(duì)比例I
[0042]將購(gòu)自ATCC 的商品號(hào)為 ATCC? BAA-1283? 的微小桿菌(Exiguobacteriumsp.)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培養(yǎng)至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0043]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有80g/L的豆餅粉、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的微小桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,所得到的培養(yǎng)液即為本對(duì)比例的微生物菌劑。
[0044]對(duì)比例2
[0045]將購(gòu)自購(gòu)自ATCC的商品號(hào)為ATCC? BAA-1283?的微小桿菌(Exiguobacteriumsp.)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培養(yǎng)至菌密度 0D_值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0046]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有80g/L的豆餅粉、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的微小桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,在每kg上述得到的培養(yǎng)液中，加入80mg的NaBr、30mg的Η3Β03、20mg的SrCl2、3mg的NaF、2g的酒石酸鉀鈉和50mg的檸檬酸三鈉，混合后得到的物料即為本對(duì)比例的微生物菌劑。
[0047]測(cè)試實(shí)施例1
[0048]本測(cè)試實(shí)施例中，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境測(cè)試實(shí)施例1-4和對(duì)比例1-2的微生物菌劑的降解石油烴的效果。
[0049]將海邊泥沙(取自山東煙臺(tái)萊州灣，已干燥并滅菌)、水、十六烷和菲按重量比(1000:500:20:20)混合均勻，得到模擬石油烴污染的待處理樣品。
[0050]取實(shí)施例1-4和對(duì)比例1-2的微生物菌劑各20mL，分別與Ikg上述待處理樣品混合，在25°C避光下培養(yǎng)10或20天后，得到處理后的樣品。用二氯甲烷萃取處理后的樣品，并用氣相色譜法測(cè)定處理后的樣品中的十六烷和菲的殘留量，并計(jì)算十六烷和菲的降解率，結(jié)果如表1所示。
[0051]表1
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種海微小桿菌，其特征在于:該海微小桿菌(Exiguobacterium marinum)的保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8841。
2.一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，其特征在于:所述菌體包括保藏編號(hào)為CGMCC N0.8841的海微小桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于:每克所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為(2-300) X 108CFU。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述培養(yǎng)基含有40-150g/L的豆餅粉、0.5-8g/L的氯化 鈉、0.5-5g/L的碳酸鈣、2_10g/L的磷酸二氫鉀和l_10g/L的硫酸亞鐵。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑,其特征在于:所述微生物菌劑還含有營(yíng)養(yǎng)鹽；所述營(yíng)養(yǎng)鹽包括NaBr、H3B03、SrCl2, NaF、酒石酸鉀鈉和檸檬酸三鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物菌劑，其特征在于，每千克微生物菌劑中含有50-100mg 的 NaBr、10-40mg 的 H3B03、10_40mg 的 SrCl2、l_5mg 的 NaF、0.5_5g 的酒石酸鉀鈉和IO-1OOmg的檸檬酸三鈉。
8.權(quán)利要求1所述的海微小桿菌和權(quán)利要求2-7中任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述石油烴包括烷烴和/或芳烴；所述烷烴的碳原子數(shù)為11-35，所述芳烴的碳原子數(shù)為10-20。
10.權(quán)利要求1所述的海微小桿菌和權(quán)利要求2-7中任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在降解原油中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C02F101/32GK103937723SQ201410167737
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】趙文勇, 阮志勇, 趙秉強(qiáng), 王慧敏, 趙君才, 呂昭輝, 劉慧 , 宋昭, 王彥偉, 劉小飛 申請(qǐng)人:煙臺(tái)海上傳奇生物科技有限公司