專利名稱：一種氯代烴高效好氧降解混合菌劑的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用生物法治理地下水污染領(lǐng)域技術(shù)，更具體地講，涉及一種氯代烴高效好氧降解混合菌劑的制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人類活動的加劇，地下水的污染日益嚴(yán)重。據(jù)我國有關(guān)部門對118個城市連續(xù)2 7年的監(jiān)測統(tǒng)計，約有64%和33%的城市地下水遭受了重度和輕度的污染，其中有機(jī)物污染問題已經(jīng)相當(dāng)突出。尤其是氯代烴，在尖端工業(yè)中被大量用作清潔劑，由于人們越來越關(guān)注由這些物質(zhì)或含這些物質(zhì)的廢水引起的地下水污染，所以有必要立即采取措施對付這種污染。目前地下水污染治理與修復(fù)的方法主要有物理法、化學(xué)法、生物法。物理法主要是指抽出處理法，是地下水修復(fù)的代表性技術(shù)，應(yīng)用最為廣泛?；瘜W(xué)氧化法也常用于石油烴污染及氯代烴污染的地下水修復(fù)，但是成本較高。生物法包括微生物降解和植物修復(fù)，在土壤中接種高效的菌種可以顯著提高降解效果；實踐研究表明生物法處理石油烴污染、多環(huán)芳烴污染和氯代烴污染能達(dá)到較高的去除效率，并與上述物理、化學(xué)方法相比，生物法處理無需大量的能量，成本較低，同時，它們也能夠完全降解污染物和使之脫毒而不會引起二次污染。而且即使污染物處于低濃度也可以進(jìn)行降解，可以完全意義上的實現(xiàn)降低污染，且降低治理費用。采用微生物凈化土壤的方法包括異位修復(fù)和原位修復(fù)，其中異位修復(fù)法主要包括固相處理法及泥漿處理法，固相處理法是將微生物與磷、氮等營養(yǎng)源混入翻挖的土壤中促進(jìn)污染物的降解；泥漿處理法是將微生物與水和營養(yǎng)源混入翻挖的土壤中，以流體形式處理土壤，促進(jìn)污染物的降解；原位處理法，是將空氣、營養(yǎng)源等注入污染土壤中，無需翻挖來促進(jìn)土壤中存在的微生物降解污染物。在上述生物處理法中，異位處理法由于需要翻挖土壤，應(yīng)用范圍受到限制，處理和設(shè)備費用相對較高。原位處理法費用低，操作便捷，但由于土壤中微生物含量較少，尤其是氯代烴降解微生物，土壤中可能并不存在。在這種情況之下，通過實驗篩選培養(yǎng)獲得能夠降解氯代烴的微生物并將它們接種至土壤中，使得凈化速率提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，從受三氯乙烯(TCE)污染場地土壤中，馴化、篩選出可耐受并對TCE具有一定降解能力的微生物菌株， 然后將菌株制成菌劑。本發(fā)明的第二個目的在于，提供一種氯代烴好氧降解混合菌劑。本發(fā)明的第三個目的在于，提供一種氯代烴好氧降解混合菌劑在凈化含氯代烴的水或土壤中的應(yīng)用。為實現(xiàn)第一個目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，包括馴化、分離和鑒定，包括以下步驟
(1)取999.OmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LOmL微量元素，搖勻后作為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基備用；取 50mL所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，在溫度為121°C的高壓鍋內(nèi)滅菌20分鐘，在超凈臺中冷卻，再加入2 g受TCE污染的土壤，30 °C，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下，避光、恒溫振蕩，培養(yǎng)36 h，獲得培養(yǎng)菌液；
(2)取步驟(1)中獲得的培養(yǎng)菌液5mL,轉(zhuǎn)接到裝有10 mg/L TCE和0. 15 g/L葡萄糖的上述新鮮液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)直至溶液渾濁得到馴化培養(yǎng)基；
(3)配置分離培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1000mL，121 °C高壓蒸汽滅菌后，在超凈臺中冷卻至38、0°C，在超凈工作臺中取步驟(2)獲得的馴化培養(yǎng)基1 mL，按10 倍稀釋法將菌液稀釋成KT1-KT7梯度的菌懸液，取0. 1 mL涂布于上述分離培養(yǎng)基上，用無菌涂布器涂布均勻，將培養(yǎng)皿置于30 °C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，4 后便可發(fā)現(xiàn)有明顯菌落出現(xiàn)，挑選菌落，將其接種至上述分離培養(yǎng)基中，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速180 r/min的振蕩器中培養(yǎng)48 h得到菌液；
(4)以所得菌液作為接種物，添加到含有TCE50 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，菌液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比為1:10，培養(yǎng)溫度為30 °C，培養(yǎng)時間為36、8 h，經(jīng)離心得到菌液，按體積比 500 1加入酵母提取物和麥麩的保護(hù)劑，然后利用真空冷凍干燥機(jī)制備成固體氯代烴好氧降解混合菌劑。作為一個優(yōu)選，在步驟(3)之后、步驟(4)之前還包括步驟(3A)，所述步驟(3A)為 將步驟(2)至步驟(3)作為一個分離純化周期，重復(fù)步驟(2)至步驟(3)，但每次用前一個分離純化周期中步驟(3)獲得的菌液代替步驟(2)中初始用到的培養(yǎng)菌液，分離純化6個周期以上得到菌液。步驟(1)中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=Na2HPO44. 26g. L-1，KH2PO4 :2. 65 g. L-1， NH4Cl :0. 5 g.廠1，F(xiàn)eCl2*4H20 :0.01 g. Γ1，CaCl2 :0. 02 g. L-1, MgSO4·7Η20 :0.2 g. Γ1 ; 所述微量元素的組成為:HB03 :0. 3 g. ΙΛ ZnCl2 :0. 07g. Λ NaMoO4'2Η20 :0. 024g. Λ MnCl2·4Η20 :0. 006g. Λ NiCl2*6H20 :0· 75 g. Λ CoC12*6H20 :0· 19 g. Γ1。步驟(2)的馴化培養(yǎng)，一般以3 d作為一個馴化周期，一個馴化周期后，取5 mL馴化后的菌液轉(zhuǎn)接至設(shè)定TCE濃度的新鮮液體培養(yǎng)液中，馴化過程中的TCE的濃度為10 mg/ L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L。步驟(3)中分離培養(yǎng)基的配制方法為，NaCl 5g，，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，用5 mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至IOOOmL, 121 °C高壓蒸汽滅菌后，在超凈臺中冷卻至38— 40°C獲得。為了實現(xiàn)第二個目的，本發(fā)明公開按照上述制備方法獲得的氯代烴好氧降解混合菌劑。通過鑒定，將混合菌歸類于不動桿菌屬C^i/^to如cter)，考察優(yōu)勢菌的生理生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其革蘭氏染色呈陰性、無芽孢、短桿狀。為了實現(xiàn)第三個目的，本發(fā)明公開氯代烴好氧降解混合菌劑在凈化含氯代烴的水或土壤中的應(yīng)用。作為一個優(yōu)選方案，降解條件為，TCE濃度50 mg/L，葡萄糖濃度150 mg/L。作為一個優(yōu)選方案，降解條件為，溫度30 °C、pH值7、搖床轉(zhuǎn)速180 rpm。本發(fā)明在TCE濃度為50 mg/L，葡萄糖濃度為150 mg/L時，研究了不同的環(huán)境因素對混合菌降解TCE的影響，實驗結(jié)果表明在30 °C、pH=7、搖床轉(zhuǎn)速180 rpm的條件下，混合菌對TCE的降解效果最佳，降解率達(dá)68. 1 %。作為一個優(yōu)選方案，在凈化時，加入菌劑的同時聯(lián)合植物修復(fù)。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明根據(jù)地下水污染具體情況構(gòu)建了原位修復(fù)有機(jī)物污染地下水的修復(fù)系統(tǒng)，采用葡萄糖為共代謝基質(zhì)，從典型受TCE污染場地土壤中篩選、馴化出可耐受并對TCE具有一定降解能力的微生物菌株；以及使用這些微生物與植物聯(lián)合對水和土壤進(jìn)行凈化的方法；(2)本發(fā)明的體系設(shè)計相對簡單，實施起來較為方便，對有機(jī)物污染的地下水具有高效、經(jīng)濟(jì)、無二次污染的特點；(3)本發(fā)明修復(fù)地下水范圍寬，修復(fù)效果好；(4)本發(fā)明并不只局限于對地下水的治理，也可以應(yīng)用于城市污水和生活污水的治理。


圖1混合菌的顯微觀察圖。圖2ASTT-1菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2BSTT-2菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖3混合菌群生長曲線。圖4不同濃度對三氯乙烯(TCE)降解菌的影響。圖5溫度對混合菌生長情況的影響。圖6溫度對三氯乙烯(TCE)降解的影響。圖7不同pH值條件下三氯乙烯(TCE)的降解情況。圖8搖床轉(zhuǎn)速對三氯乙烯(TCE)降解的影響。圖9不同苯酚/TCE濃度比下三氯乙烯(TCE)的降解情況。圖10不同苯酚/TCE濃度比下三氯乙烯(TCE)的降解動力學(xué)方程。圖11不同甲苯/TCE濃度比下三氯乙烯(TCE)的降解情況。圖12不同甲苯/TCE濃度比下三氯乙烯(TCE)的降解動力學(xué)方程。圖13混合菌劑與植物聯(lián)合修復(fù)三氯乙烯(TCE)污染濕地，圖13A為對照組，無填料，圖1 為實驗組，有填料。
具體實施例方式本發(fā)明型采用葡萄糖為共代謝基質(zhì)，以受三氯乙烯(TCE)污染嚴(yán)重的土壤為菌源，馴化分離出高效降解TCE的混合菌群。通過鑒定，將混合菌歸類于不動桿菌屬 (Acinetobacter)。并提供將上述微生物聯(lián)合植物加入含氯代烴的水或土壤來凈化水和土壤的方法。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1氯代烴快速混合降解菌的篩選、馴化、分離和鑒定
1、菌種的篩選，取上海市浦東某地氯代烴污染土壤樣品2 g，置于裝有50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的100 mL的三角燒瓶中，在30 °C恒溫振蕩器，180 rpm條件下，避光、恒溫振蕩 36 h 后，取 5 mL 菌液接種于裝有 TCE 10 mg/L 和葡萄糖，0. 15 g. L"1, Na2HPO4 4. 26g. Γ1,KH2P042. 65 g. IANH4ClO. 5 g. Λ FeCl,4H20 0. 01 g. L-1，CaCl2 0. 02g. L-1, MgSO4·7Η2 00. 2g. ΙΛ HBO3O. 3g. ΙΛ ZnCl2 0. 07g. Λ NaMoO4*2H200. 024g. Λ MnCl2·4Η200. 006g. Λ NiCl2-6H200. 75 g. L—1，CoC12*6H200. 19 g. L—1混合構(gòu)成的種子培養(yǎng)液中，再培養(yǎng)3 d，即為 TCE的好氧降解菌群。2、取上述菌液5 ml,6000 rpm離心5 min，用滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌2次，在接種至新鮮含有TCE的種子培養(yǎng)液中，在30 180 rpm搖床里培養(yǎng)3 d，重新傳代。馴化過程中的 TCE 的濃度按 10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、75 mg/LUOO mg/L依次增加，共馴化6次。3、待馴化結(jié)束后，將所得的馴化菌群應(yīng)用下述方法分離純化，得到兩株混合菌群， 4°C冰箱保存。使用馴化最后階段的培養(yǎng)液用于菌種的劃線分離。取最后一個周期的馴化培養(yǎng)基1 mL，按10倍稀釋法將菌液稀釋成KT1-KT7梯度的菌懸液，取0.1 mL涂布于牛肉膏培養(yǎng)基上，用無菌涂布器涂布均勻，置于30 V的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長成獨立菌落后， 觀察各菌落形態(tài)，用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的菌落，在平板中劃線分離。重復(fù)該步驟分離微生物。將挑出的菌落分別接種至裝有100 mg/L TCE和NaCl 5 g.L—1，，牛肉膏5 g.L—1，胰蛋白胨10 g.L—1，pH 7. O構(gòu)成的分離培養(yǎng)基中，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速180 rpm的振蕩器中培養(yǎng) 48 h得到菌液。取菌液1 mL，按10倍稀釋法將菌液稀釋成KT1-KT7梯度的菌懸液，取0.1 mL涂布于牛肉膏培養(yǎng)基上，用無菌涂布器涂布均勻，置于30 ！的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長成獨立菌落后，重復(fù)該步驟6次以上，分離出混合菌。基于其在平板上的形態(tài)單一，無法進(jìn)一步分離。下面的研究均選用該混合菌。在分離培養(yǎng)基上，混合菌落呈圓形，直徑2 mm，乳白色，邊緣整齊，表面干燥，不易挑起。革蘭氏染色呈陰性，桿狀，無芽孢。其在平板上的形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果如圖1示。4、對混合菌群進(jìn)行鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在上述培養(yǎng)基中挑取細(xì)菌于10 μ 1 滅菌水中變性后離心取上清作為模板。進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及條件如表1及表2所示。表1. PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，包括馴化、分離和鑒定，其特征在于，包括以下步驟(1)取999.OmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LOmL微量元素，搖勻后作為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基備用；取 50mL所述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，在溫度為121°C的高壓鍋內(nèi)滅菌20分鐘，在超凈臺中冷卻，再加入2 g受TCE污染的土壤，30 °C，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下，避光、恒溫振蕩，培養(yǎng)36 h，獲得培養(yǎng)菌液；(2)取步驟(1)中獲得的培養(yǎng)菌液5mL,轉(zhuǎn)接到裝有10 mg/L TCE和0. 15 g/L葡萄糖的上述新鮮液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)直至溶液渾濁得到馴化培養(yǎng)基；(3)配置分離培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1000mL，121 °C高壓蒸汽滅菌后，在超凈臺中冷卻至38、0°C，在超凈工作臺中取步驟(2)獲得的馴化培養(yǎng)基1 mL，按10 倍稀釋法將菌液稀釋成KT1-KT7梯度的菌懸液，取0. 1 mL涂布于上述分離培養(yǎng)基上，用無菌涂布器涂布均勻，將培養(yǎng)皿置于30 °C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，4 后便可發(fā)現(xiàn)有明顯菌落出現(xiàn)，挑選菌落，將其接種至上述分離培養(yǎng)基中，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速180 r/min的振蕩器中培養(yǎng)48 h得到菌液；(4)以所得菌液作為接種物，添加到含有TCE50 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，菌液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比為1:10，培養(yǎng)溫度為30 °C，培養(yǎng)時間為36、8 h，經(jīng)離心得到菌液，按體積比 500 1加入酵母提取物和麥麩的保護(hù)劑，然后利用真空冷凍干燥機(jī)制備成固體氯代烴好氧降解混合菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于，在步驟(3 )之后、步驟(4)之前還包括步驟(3A)，所述步驟(3A)為將步驟(2 )至步驟(3 )作為一個分離純化周期，重復(fù)步驟(2)至步驟(3)，但每次用前一個分離純化周期中步驟(3) 獲得的菌液代替步驟(2)中初始用到的培養(yǎng)菌液，分離純化6個周期以上得到菌液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于， 步驟(1)中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=Na2HPO4 4. 26g. L-1，KH2PO4 :2. 65 g. L-1，NH4Cl :0. 5 g. ΙΛ FeCl2'4H20 :0. 01 g. Λ CaCl2 :0. 02 g. Λ MgSO4'7Η20 :0· 2 g. Γ1 ；所述微量元素的組成為:HB03 :0. 3 g. ΙΛ ZnCl2 :0. 07g. Λ NaMoO4*2Η20 :0· 024g. Λ MnCl2·4Η20 :0· 006g. ΙΛ NiCl2.6H20 :0. 75 g. λ CoC12.6H20 :0· 19 g. Γ1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)的馴化培養(yǎng)，一般以3 d作為一個馴化周期，一個馴化周期后，取5 mL馴化后的菌液轉(zhuǎn)接至設(shè)定TCE濃度的新鮮液體培養(yǎng)液中，馴化過程中的TCE的濃度為10 mg/L,20 mg/L、 30 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于，步驟(3)中分離培養(yǎng)基的配制方法為，NaCl 5g，，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，用5 mol/LNaOH 調(diào)pH至7. 0，用去離子水定容至IOOOmL, 121 °C高壓蒸汽滅菌后，在超凈臺中冷卻至38— 40°C獲得。
6.利用權(quán)利要求1一5任一所述的氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法獲得的氯代烴好氧降解混合菌劑。
7.權(quán)利要求6所述的氯代烴好氧降解混合菌劑在凈化含氯代烴的水或土壤中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的氯代烴好氧降解混合菌劑在凈化含氯代烴的水或土壤中的應(yīng)用，其特征在于，降解條件為，TCE濃度50 mg/L，葡萄糖濃度150 mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的氯代烴好氧降解混合菌劑在凈化含氯代烴的水或土壤中的應(yīng)用，其特征在于，降解條件為，溫度30 °C、pH值7、搖床轉(zhuǎn)速180 rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的氯代烴好氧降解混合菌劑在凈化含氯代烴的水或土壤中的應(yīng)用，其特征在于，在凈化時，加入菌劑的同時聯(lián)合植物修復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種氯代烴好氧降解混合菌劑及其制備方法與應(yīng)用，包括混合降解菌劑的篩選和馴化、混合降解菌劑的制備方法和混合降解菌劑的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)定在葡萄糖共代謝條件下，30℃、pH7、搖床轉(zhuǎn)速180rpm時，混合菌劑對氯代烴的降解效果最佳，降解率達(dá)68.1%。同時研究了混合降解菌劑與植物聯(lián)合對TCE的修復(fù)技術(shù)。本發(fā)明篩選出三氯乙烯的好氧混合降解菌劑，提供了一種混合菌劑的富集培養(yǎng)方法，并利用這些微生物與植物聯(lián)合降解水或土壤中的氯代烴污染物，對有機(jī)物污染的修復(fù)具有高效、經(jīng)濟(jì)、無二次污染的特點；修復(fù)地下水范圍寬，可去除的污染物種類多，應(yīng)用廣泛。
文檔編號C02F101/36GK102533619SQ20121004903
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者劉勇弟, 呂樹光, 李輝, 林匡飛, 沈婷婷, 陸強(qiáng) 申請人:華東理工大學(xué)