專利名稱：一株高效降解石油的桔黃假單胞菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株桔黃假單胞菌菌株。
背景技術(shù)：
石油污染土壤是一個長期存在的環(huán)境問題，針對石油污染土壤的修復技術(shù)的研究是環(huán)境保護領(lǐng)域的研究熱點。目前，石油污染土壤的修復方法包括物理法、化學法及生物法。比較而言，生物法具有物理法和化學法不可比擬的優(yōu)勢，首先是處理費用低，其處理成本大約只有物化方法的三分之一；其次是修復操作簡單，可以原位進行修復；再次生物法修復對環(huán)境的二次污染小。生物修復法本身包括動物修復、植物修復及微生物修復，這三種方法中由于微生物資源豐富、易于培養(yǎng)、對環(huán)境的耐受性較強，故微生物修復被認為具有廣闊的應用前景。菌株產(chǎn)生生物表面活性劑是其代謝原油的機制之一，生物表面活性劑具有乳化原油能力、可生物降解性的優(yōu)點，在原油污染土壤的修復中具有很高的應用價值，高效產(chǎn)表面活性劑的降解菌的篩選已經(jīng)引起了國內(nèi)外學者的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株桔黃假單胞菌(Pseudomonas aurantiaca)菌株，可高效降解石油，該菌株在石油污染土壤的修復中具有較高的應用價值。本發(fā)明高效降解石油的桔黃假單胞菌菌株為桔黃假單胞菌D7 (Pseudomonas aurantiaca D7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年1月15日，保藏號為 CGMCC No. 4710;本發(fā)明桔黃假單胞菌D7為革蘭氏陰性菌，桿狀，細胞大小為(0. 6 μ m 0. 7 μ m) X (2. 2 μ m 2. 4 μ m)，菌體表面凸凹不平，有明顯的凹陷，無鞭毛，運動能力弱；在以石油為唯一碳源的固體無機鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為淡黃色，不透明，表面光滑。本發(fā)明桔黃假單胞菌D7氧化酶反應呈陽性，明膠實驗結(jié)果呈陽性，淀粉水解實驗結(jié)果呈陽性。本發(fā)明桔黃假單胞菌D7能夠以石油烴為碳源進行生長代謝，能夠利用NH4Cl 為氮源。本發(fā)明桔黃假單胞菌D7 (Pseudomonas aurantiaca D7)通過16S rRNA基因序列比對分析，與假單胞菌屬(!Pseudomonas)的16S rRNA基因序列的同源性最高，相似性為97%， 通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定桔黃假單胞菌D7屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，為桔黃假單胞菌(Pseudomonas aurantiaca)菌株。本發(fā)明桔黃假單胞菌D7可在以石油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基上生長，桔黃假單胞菌D7的最適溫度為28 32°C，最適合生長環(huán)境的pH值為5. 5 8. 0。本發(fā)明桔黃假單胞菌D7能夠高效降解石油，將桔黃假單胞菌D7接入含有IOOmg 原油的20mL無機鹽培養(yǎng)基中，在30°C、120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)15d，總石油烴含量從IOOmg 降至60mg左右，石油的去除率接近40% ；本發(fā)明桔黃假單胞菌D7對石油污染的土壤具有修復作用。本發(fā)明桔黃假單胞菌D7 (Pseudomonas aurantiaca D7)屬于假單胞菌屬 (Pseudomonas)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年1月15日，保藏號為CGMCC No.4710。


圖1為本發(fā)明桔黃假單胞菌D7的掃描電鏡照片；圖2為桔黃假單胞菌D7原子力顯微鏡圖片；圖3為通過桔黃假單胞菌D7和相近菌株的16S rRNA基因序列進行同源性比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖4為具體實施方式
二中桔黃假單胞菌D7對原油中總石油烴的降解曲線圖；圖5為具體實施方式
二中桔黃假單胞菌D7產(chǎn)生的肽脂類生物表面活性劑的分析圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式高效降解石油的桔黃假單胞菌菌株為桔黃假單胞菌 D7 (Pseudomonas aurantiaca D7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年1月15日， 保藏號為 CGMCC No. 4710。本實施方式桔黃假單胞菌D7 (Pseudomonas aurantiaca D7)為革蘭氏陰性菌，桿狀，細胞大小為(0. 6 μ m 0. 7 μ m) X (2. 2 μ m 2. 4 μ m)，菌體表面凸凹不平，有明顯的凹陷，無鞭毛(如圖1和圖2所示)，運動能力弱；在以石油為唯一碳源的固體無機鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為淡黃色，不透明，表面光滑。參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對桔黃假單胞菌 D7 (Pseudomonas aurantiaca D7)進行生理生化鑒定桔黃假單胞菌D7氧化酶反應呈陽性，明膠實驗結(jié)果呈陽性，淀粉水解實驗結(jié)果呈陽性。本實施方式桔黃假單胞菌D7可在以石油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基上生長。以石油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基(IL)由l.Og NaCUO. IgKClU. Og NH4Cl, 0. 02gFeCl2 · 4Η20、0· 5g KH2PO4U. Og Κ2ΗΡ04、0· 5g MgCl2、0. 02g CaCl2 · 2H20、lmL 微量元素溶液和余量的去離子水組成，調(diào)pH至7. 0 ；其中微量元素溶液(IL)由3g FeSO4 ·7Η20、0. Olg H3BO3>0. Olg Na2MoO4 ·2Η20,0. 02g MnSO4 ·Η20、0· Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg ZnSO4,0. 5g EDTA, 5g原油和余量的去離子水組成。本實施方式桔黃假單胞菌D7的最適溫度為觀 32°C，最適合生長環(huán)境的pH值為 5. 5 8. O0具體實施方式
二 本實施方式桔黃假單胞菌D7 (Pseudomonas aurantiaca D7)由受石油長期污染的土壤中篩選得到。篩選按以下步驟進行取Ig受石油長期污染的土壤加入到IOOmL LB培養(yǎng)基中，同時加入少量玻璃珠，在IOOrpm搖床上培養(yǎng)3d ；然后取上層液體進行梯度稀釋(IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5),均勻涂布在以石油為唯一碳源的固體無機鹽培養(yǎng)基上，于生化培養(yǎng)箱中30°C恒溫培養(yǎng)7d ；挑取單菌落到以石油為唯一碳源的液體無機鹽培養(yǎng)基中，在IOOrpm搖床上培養(yǎng)10d，以石油的降解率為指標，進行高效菌株篩選；最后利用平板劃線法重復純化、分離，即得到桔黃假單胞菌D7。對篩選得到的桔黃假單胞菌D7進行分子鑒定，按以下步驟進行采用上海華舜細菌基因組小量提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，采用細菌16S rRNA基因通用引物，以菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增。然后利用膠回收試劑盒(購自于大連寶生物工程有限公司)回收純化PCR產(chǎn)物，之后進行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆子菌落，采用ABI3730測序儀進行雙向測序。桔黃假單胞菌D7的16S rRNA基因序列長度為1346bp，其序列在GenBank的登陸號為AY23123，測序結(jié)果與GenBank中的已有序列進行Blast比對，然后采用MEGA3. 1軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖3所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與假單胞菌屬O^seudomonas)的16S rRNA基因序列的同源性最高，相似性為97 %，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定桔黃假單胞菌D7屬于假單胞菌屬 (Pseudomonas)，為桔黃假單胞菌(Pseudomonas aurantiaca)。PCR引物購買自上海生工生物技術(shù)有限公司，其他試劑購自于大連寶生物工程有限公司。與現(xiàn)有的石油降解菌株相比，桔黃假單胞菌D7是從實際石油污染土壤中篩選獲得，屬于土壤中的土著菌，對實際土壤環(huán)境的耐受性較強。利用靜態(tài)試驗考察桔黃假單胞菌D7對石油的降解能力，具體方法為在裝有20mL 無機鹽培養(yǎng)基和IOOmg原油的培養(yǎng)瓶中，接入ImL菌液，在30°C、120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng) 15d，總石油烴含量從IOOmg降至60mg左右，石油的去除率接近40%，如圖4所示。利用氣-質(zhì)聯(lián)機分析桔黃假單胞菌D7降解前后的原油組分變化，如圖5所示，可以看出桔黃假單胞菌D7對C30以下的石油烴類有機物具有明顯的去除效果。桔黃假單胞菌 D7在降解石油過程中產(chǎn)生了肽脂類生物表面活性劑，由于生物表面活性劑在環(huán)境修復中具有環(huán)境安全性及二次污染小等特點及優(yōu)勢，因此桔黃假單胞菌D7在石油污染土壤修復中具有較高的應用價值。
權(quán)利要求
1. 一株高效降解石油的桔黃假單胞菌菌株，其特征在于高效降解石油的桔黃假單胞菌菌株為桔黃假單胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2011 年1月15日，保藏號為CGMCC No. 4710。
全文摘要
一株高效降解石油的桔黃假單胞菌菌株，它涉及一株桔黃假單胞菌菌株。本發(fā)明提供了一株桔黃假單胞菌菌株，可高效降解石油，該菌株在石油污染土壤的修復中具有較高的應用價值。本發(fā)明高效降解石油的桔黃假單胞菌菌株為桔黃假單胞菌D7，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年1月15日，保藏號為CGMCC No.4710。本發(fā)明桔黃假單胞菌D7能夠高效降解石油，對石油污染的土壤具有修復作用。
文檔編號B09C1/10GK102191197SQ20111007347
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者萬春黎, 萬芳, 杜茂安, 楊巧利, 楊雪 申請人:哈爾濱工業(yè)大學