專利名稱：耐鹽凈污菌劑的制備方法及其菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于含鹽廢水生物處理技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種耐鹽凈污菌劑的制備方法及其菌劑。

背景技術(shù)：
目前，許多常規(guī)的物理、化學(xué)和生化的方法可以應(yīng)用于含鹽廢水處理，但由于海水成分的復(fù)雜性以及不同性質(zhì)的含鹽廢水中污染物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，而使含鹽廢水處理與陸源污水處理產(chǎn)生較大的差異，尤其是高鹽度的影響，增加了污水處理的難度。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度無機(jī)鹽對(duì)廢水生物處理的毒害作用主要是通過升高的環(huán)境滲透壓而破壞微生物的細(xì)胞膜和菌體內(nèi)的酶，從而破壞微生物的生理活動(dòng)。另外，廢水中的鹽度使廢水的密度增加，造成廢水與微生物的比重差減小，菌膠團(tuán)絮體難以沉降，使得活性污泥容易上浮流失，出水水質(zhì)變壞。
一般微生物不具有耐鹽、嗜鹽特點(diǎn)，不具有凈化含鹽污水能力，具備耐鹽、嗜鹽性的細(xì)菌分離和培養(yǎng)不容易，不易產(chǎn)業(yè)推廣應(yīng)用； 已知技術(shù)，如已公開的中國(guó)專利申請(qǐng)200810100231.4復(fù)合型活菌生物凈水劑及其制備方法，該生物凈水劑包含枯草芽孢桿菌KX-1 CCTCC NO.M 208057、枯草芽孢桿菌KX-2 CCTCC NO.M 208058、枯草芽孢桿菌KX-4 CCTCC NO.M 208060，且總菌數(shù)大于1×108CFU/G。該生物凈水劑能有效去除水中氨氮和亞硝酸鹽，改善水體污染；降解有機(jī)大分子，減輕水中富營(yíng)養(yǎng)程度；并且上述的三株菌能將水體內(nèi)的有機(jī)大分子物質(zhì)分解成動(dòng)植物能吸收的糖類、氨基酸、維生素、生物活性物質(zhì)(激素)等，實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)、協(xié)調(diào)共生，在水中增殖形成一個(gè)復(fù)雜而穩(wěn)定的微生物系統(tǒng)。
又如已公開的中國(guó)專利200410081504.7一種處理煉油廢水的微生物菌劑、其制備方法及其應(yīng)用，針對(duì)目前廢水處理中處理效率不高和處理后仍含難降解污染物等缺點(diǎn)，本菌劑包括0-10∶0-10∶0-10∶0-10∶0-10∶0-10的紅球菌屬、微小桿菌屬、芽孢桿菌、假絲酵母和短狀桿菌等菌種，通過活化培養(yǎng)后處理煉油廢水，具有處理效果好，使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
再如已公開的中國(guó)專利申請(qǐng)200910029185.8一種高鹽工業(yè)廢水BOD的快速測(cè)定方法，取10克高鹽廢水排污口污泥，加入90毫升無菌生理鹽水，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板劃線分離，37℃培養(yǎng)2天，直至獲得純的耐鹽菌菌株；將菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，恒溫振蕩箱中振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，4500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，0.9％的氯化鈉溶液洗滌得耐鹽菌；將5毫克碳納米管分散在水中形成5毫克/毫升的碳納米管懸液；耐鹽菌以磷酸鹽緩沖液配成0.2克/毫升菌懸液；菌懸液以體積比1∶2與碳納米管懸液混合，30毫升的混合液均勻涂布于孔徑為0.2M的纖維素薄膜上，涼置至半干，固定于溶氧電極上形成BOD電極；將溶解氧分析儀設(shè)置為自動(dòng)測(cè)量，以雷磁數(shù)據(jù)采集軟件即時(shí)記錄輸出電流。
已知技術(shù)不能解決含鹽廢水的凈化處理問題，而生物強(qiáng)化處理技術(shù)具有高效、穩(wěn)定、節(jié)省投資的特點(diǎn)，因此高效菌種和菌劑的研制是業(yè)界的期待，市場(chǎng)亟待一種微生物耐鹽凈污菌劑問世，以提供海水凈化的新途徑。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題在于，克服襲用技術(shù)存在的上述缺陷，而提供一種耐鹽凈污菌劑的制備方法及其菌劑。
本案首要目的是提供一種耐鹽凈污菌劑的制備方法。
本案又一目的是提供一種前述方法制得的耐鹽凈污菌劑。
本案提供的耐鹽凈污菌菌株是采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種耐鹽凈污菌菌株，其中它保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏編號(hào)CGMCC No.3314。保藏時(shí)間2009.9.29，存活； 本案提供的耐鹽凈污菌菌株還可以采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn) 前述的耐鹽凈污菌菌株，其中所述耐鹽凈污菌的菌株16S rDNA序列為 1 gggggacttg acatgattac gactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag 61 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgcag 121 gaaaccgtct gaaccctccg gggggacgac ggcggaatga gcggcggacg ggtgagtaac 181 acgtaaagaa cctgcccata ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct aataccggat 241 gtgtcatcgg accgcatggt ccgctgatga aaggcgcttc ggcgtcgccc atggatggct 301 ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa cggcccacca aggcgacgat gcatagccga 361 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 421 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg 481 aaggctttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca ggcaatggcg 541 gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 601 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggcctct 661 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac tgggaggctt 721 gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 781 gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 841 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt 901 tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 961 cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt 1021 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc tgaccggtac 1081 agagatgtac cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1141 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca 1201 gcattaagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1261 cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa 1321 agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaggc cgttctcagt tcggattgca 1381 ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg 1441 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc 1501 gaagtcggtg aggtaaccgt aaggagccag ccgccgaagg tggggcagat gattggggtg 1561 aagtcgtaac aaggtagccg taatcgtcca cttgccgtca tgctcttgca ctgcgtcacg 1621 c 前述的耐鹽凈污菌菌株，其中所述耐鹽凈污菌的最大耐鹽度為10％。
前述的耐鹽凈污菌菌株，其中所述耐鹽凈污菌的主要生物學(xué)特性為革蘭氏陽性，幼齡培養(yǎng)物為桿狀，老培養(yǎng)物為球狀，有鞭毛，菌體大小0.5×3.0微米；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落平坦，橙黃色，邊緣整齊。
前述的耐鹽凈污菌菌株，其中所述耐鹽凈污菌，接觸酶、過氧化氫酶、硝酸鹽的任一種還原反應(yīng)均為陽性。
前述的耐鹽凈污菌菌株，其中所述耐鹽凈污菌氧化酶、脲酶試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)均為陰性。
前述的耐鹽凈污菌菌株，其中所述耐鹽凈污菌利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖類產(chǎn)酸。
前述的耐鹽凈污菌菌株，其中所述耐鹽凈污菌適宜的pH值在5.5-10之間，適宜生長(zhǎng)溫度為35℃。
前述耐鹽凈污菌菌株，其中耐鹽凈污菌DNA的G+C含量為49.0mol％。
本發(fā)明耐鹽凈污菌菌株之用途解決現(xiàn)有技術(shù)問題的是采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 前述任一耐鹽凈污菌菌株的用途，其中用于含鹽廢水處理。
本案耐鹽凈污菌菌株之用途解決現(xiàn)有技術(shù)問題還可以采用以下技術(shù)措施來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn) 前述的耐鹽凈污菌菌株的用途，其中用于海水利用后的廢水處理。
前述任一耐鹽凈污菌菌株的用途，其中將該菌株制備成微生物制劑后用于含鹽廢水處理。
前述任一耐鹽凈污菌菌株的用途，其中將該菌株制備成微生物制劑后用于海水利用后的廢水處理。
本發(fā)明耐鹽凈污菌劑的制備方法解決現(xiàn)有技術(shù)問題的是采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，菌劑通過以下方法生產(chǎn)而成 1)將耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25℃-40℃、振蕩速度為120-180轉(zhuǎn)/分鐘，搖瓶振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期； 2)將上述培養(yǎng)好的菌種，按培養(yǎng)基重量的1％-2％的接種量接入到預(yù)設(shè)容積量的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 3)發(fā)酵罐生產(chǎn)過程中，無菌空氣的通氣量為4.0-6.0升/分鐘，攪拌速度為60-120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為25℃-40℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液分裝，或采用無菌附著物吸附、干燥，制成固體菌劑。
本案耐鹽凈污菌劑的制備方法解決現(xiàn)有技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn) 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟1)所述耐鹽凈污菌保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏編號(hào)CGMCC No.3314； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟1)中耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的培養(yǎng)溫度為25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或37℃-40℃的任一范圍值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟1)所述的耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的搖瓶振蕩的速度為120-150轉(zhuǎn)/分鐘或150-160轉(zhuǎn)/分鐘或116-170轉(zhuǎn)/分鐘或170-180轉(zhuǎn)/分鐘的任一范圍值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟2)中所述耐鹽凈污菌的接種量為培養(yǎng)基重量百分比的1％-1.5％或1.5％-2％的任一范圍值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟3)中所述的無菌空氣通氣量為4.0升/分鐘或5.0升/分鐘或6.0升/分鐘的任一范圍值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟3)中所述攪拌速度為60-90轉(zhuǎn)/分鐘或90-120轉(zhuǎn)/分鐘的任一范圍值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟3)中所述培養(yǎng)溫度為25℃-30℃或30℃-35℃或35℃-40℃的任一范圍值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，步驟3)中所述全流程培養(yǎng)時(shí)間為24-30小時(shí)或30-36小時(shí)或36-42小時(shí)或42-48小時(shí)的任一范圍值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基包括蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.5％，pH7.2； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述發(fā)酵罐用的培養(yǎng)基包括蛋白胨0.5％、酵母提取物0.1-0.5％或0.5％-1％、高磷酸鐵0.001％、原海水pH7.0-7.5； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述耐鹽凈污菌為微小桿菌屬(Exiguobacterium sp.NY0931)，主要生物學(xué)特性為革蘭氏陽性，幼齡培養(yǎng)物為桿狀，老培養(yǎng)物為球狀，有鞭毛，菌體大小0.5×3.0微米；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落平坦，橙黃色，邊緣整齊。
前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述耐鹽凈污菌，接觸酶、過氧化氫酶、硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，氧化酶、脲酶試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)為陰性；利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖類產(chǎn)酸。
前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述耐鹽凈污菌適合pH值在5.5-10之間，適于生長(zhǎng)溫度為35℃或36℃或37℃任一種。
前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述耐鹽凈污菌，適合pH值在5.5-6.5或6.6-7.5或7.6-8.5或8.6-9.5或9.6-10任一范圍值。
前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述耐鹽凈污菌，最適pH值在6或7或8或9的任一值； 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述耐鹽凈污菌DNA的G+C含量為49.0mol％。
前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，所述耐鹽凈污菌16S rDNA序列即對(duì)分離得到的菌株16S rDNA序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，堿基序列如下 1 gggggacttg acatgattac gactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag 61 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgcag 121 gaaaccgtct gaaccctccg gggggacgac ggcggaatga gcggcggacg ggtgagtaac 181 acgtaaagaa cctgcccata ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct aataccggat 241 gtgtcatcgg accgcatggt ccgctgatga aaggcgcttc ggcgtcgccc atggatggct 301 ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa cggcccacca aggcgacgat gcatagccga 361 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 421 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg 481 aaggctttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca ggcaatggcg 541 gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 601 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggcctct 661 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac tgggaggctt 721 gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 781 gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 841 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt 901 tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 961 cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt 1021 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc tgaccggtac 1081 agagatgtac cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1141 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca 1201 gcattaagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1261 cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa 1321 agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaggc cgttctcagt tcggattgca 1381 ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg 1441 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc 1501 gaagtcggtg aggtaaccgt aaggagccag ccgccgaagg tggggcagat gattggggtg 1561 aagtcgtaac aaggtagccg taatcgtcca cttgccgtca tgctcttgca ctgcgtcacg 1621 c 前述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，發(fā)酵罐生產(chǎn)過程中，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液直接用塑料包裝桶分裝，或采用活性炭吸附制成固體菌劑。
本發(fā)明耐鹽凈污菌劑的制備方法制得菌劑之用途解決現(xiàn)有技術(shù)問題的是采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 前述任一項(xiàng)耐鹽凈污菌劑的制備方法制得菌劑的用途，其中用于含鹽廢水處理。
本案耐鹽凈污菌劑的制備方法制得菌劑之用途解決現(xiàn)有技術(shù)問題還可以采用以下技術(shù)措施來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn) 前述的耐鹽凈污菌劑的制備方法制得菌劑的用途，其中用于海水利用后的廢水處理。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明的技術(shù)措施至少有如下的優(yōu)點(diǎn) 本案耐鹽凈污菌的成功分離恰恰可以解決含鹽污水處理中長(zhǎng)期困擾的難題，本案耐鹽凈污菌分離方法簡(jiǎn)單，又耐鹽、嗜鹽細(xì)菌來源廣泛，分離和培養(yǎng)也較容易，隨著培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，它們可以利用許多有機(jī)物(包括難降解和有毒物質(zhì))作為其碳源，因此，本案耐鹽凈污菌作為耐鹽、嗜鹽高效凈污微生物菌劑的生物材料，具有優(yōu)異的產(chǎn)業(yè)推廣和應(yīng)用價(jià)值。
本案菌劑的制備措施進(jìn)一步配置，可使菌劑的制造成本更低廉，更有益于產(chǎn)業(yè)推廣應(yīng)用；由本案的耐鹽凈污菌劑制備方法得到的菌劑特別能滿足海水利用后廢水(主要是沖廁海水)的凈化處理的實(shí)際問題和需求，使用本菌劑能夠快速啟動(dòng)新建含鹽污水處理設(shè)施的生物凈化能力和恢復(fù)惡化的生物系統(tǒng)的強(qiáng)化處理能力。
本案耐鹽凈污菌NY0931具有良好的有機(jī)物去除效果，實(shí)驗(yàn)室搖瓶試驗(yàn)結(jié)果表明，污水化學(xué)需氧量(COD)去除率達(dá)到70％以上。小型污水處理裝置試驗(yàn)結(jié)果表明，用本發(fā)明生產(chǎn)的菌劑直接投加至污水處理裝置中，可以使化學(xué)需氧量(COD)的去除率由原來的75％左右提高到90％以上。
可見，本發(fā)明所述的用于含鹽廢水治理的微生物制劑，針對(duì)目前常規(guī)污水處理技術(shù)不能有效地處理含鹽廢水的情況，采用本案的優(yōu)秀生物強(qiáng)化技術(shù)，通過向污水處理設(shè)施中投加本案的菌劑，可大大縮短污泥馴化時(shí)間、顯著提高處理效果，可有效節(jié)省投資和運(yùn)行成本，從而解決當(dāng)前含鹽廢水生物處理中存在的出水水質(zhì)差和污泥馴化時(shí)期過長(zhǎng)等迫切需要解決的問題。
本發(fā)明對(duì)比現(xiàn)有技術(shù)有顯著的貢獻(xiàn)和進(jìn)步，確實(shí)是具有新穎性、創(chuàng)造性、實(shí)用性的好技術(shù)。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。



圖1是本發(fā)明菌體原子力顯微鏡照片； 圖2是本發(fā)明耐鹽凈污菌最適pH值示意圖； 圖3是本發(fā)明耐鹽凈污菌最適溫度示意圖； 圖4是本發(fā)明耐鹽凈污菌最適搖床轉(zhuǎn)速示意圖； 圖5是本發(fā)明耐鹽凈污菌最佳接種量示意圖； 圖6是本發(fā)明耐鹽凈污菌最佳通氣量示意圖； 圖7是本發(fā)明耐鹽凈污菌最佳培養(yǎng)時(shí)間示意圖； 圖8是本案制備方法中發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母提取物的最佳濃度示意圖； 圖9是本發(fā)明耐鹽凈污菌耐鹽性示意圖； 圖10是本發(fā)明對(duì)人工污水化學(xué)需氧量(COD)的去除示意圖； 圖11是本發(fā)明CAST裝置出水化學(xué)需氧量(COD)和去除率隨運(yùn)行周期的變化示意圖。

具體實(shí)施例方式 以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。
參見圖1-11所示，本案涉及組分引用重量百分比，下不贅述。
一種耐鹽凈污菌，該生物材料保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.3314，保藏時(shí)間2009.9.29，存活，見保藏證明；圖1是菌體原子力顯微鏡照片； 該耐鹽凈污菌的具體描述如下 該耐鹽凈污菌經(jīng)鑒定為微小桿菌屬(Exiguobacterium sp.NY0931)，主要生物學(xué)特性為革蘭氏陽性，幼齡培養(yǎng)物為桿狀，老培養(yǎng)物為球狀，有鞭毛，菌體大小0.5×3.0微米；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落平坦，橙黃色，邊緣整齊； 所述耐鹽凈污菌，接觸酶、過氧化氫酶、硝酸鹽的任一種還原反應(yīng)均為陽性；其氧化酶、脲酶試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)均為陰性；利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖類產(chǎn)酸。參見耐鹽凈污菌NY0391生理生化特征表。所述耐鹽凈污菌適宜的pH值在5.5-10之間，優(yōu)選適宜生長(zhǎng)溫度為35℃。所述耐鹽凈污菌DNA的G+C含量為49.0mol％；其中，“G+C含量”是通常指的“DNA分子中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的摩爾百分比值” 耐鹽凈污菌NY0391生理生化特征

該菌株16SrDNA的Genbank登陸號(hào)為GQ451843。
對(duì)分離得到的菌株16SrDNA序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，堿基序列如下 1 gggggacttg acatgattac gactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag 61 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgcag 121 gaaaccgtct gaaccctccg gggggacgac ggcggaatga gcggcggacg ggtgagtaac 181 acgtaaagaa cctgcccata ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct aataccggat 241 gtgtcatcgg accgcatggt ccgctgatga aaggcgcttc ggcgtcgccc atggatggct 301 ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa cggcccacca aggcgacgat gcatagccga 361 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 421 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg 481 aaggctttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca ggcaatggcg 541 gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 601 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggcctct 661 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac tgggaggctt 721 gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 781 gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 841 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt 901 tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 961 cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt 1021 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc tgaccggtac 1081 agagatgtac cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1141 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca 1201 gcattaagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1261 cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa 1321 agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaggc cgttctcagt tcggattgca 1381 ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg 1441 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc 1501 gaagtcggtg aggtaaccgt aaggagccag ccgccgaagg tggggcagat gattggggtg 1561 aagtcgtaac aaggtagccg taatcgtcca cttgccgtca tgctcttgca ctgcgtcacg 1621 c NCBI分析結(jié)果表明，NY0931菌株的16SrDNA序列與Exiguobacterium sp.多個(gè)菌株的序列同源性在99％以上。
該耐鹽凈污菌的最大耐鹽度為10％，說明它具有耐鹽、嗜鹽的高效性能，參見圖9，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的不斷增加，菌株NY0931的生長(zhǎng)速度變慢，當(dāng)NaCl濃度大于10％時(shí)，培養(yǎng)48h，菌株NY0931的生長(zhǎng)明顯受到抑制，說明其有較強(qiáng)的耐鹽能力，最大耐鹽度為10％。
一種耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，菌劑通過以下方法生產(chǎn)而成 步驟1)將耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)溫度為25℃-40℃、振蕩速度為120-180轉(zhuǎn)/分鐘，搖瓶振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基可以是一般市售品； 步驟1進(jìn)一步的實(shí)施例是 優(yōu)選的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基具有蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.5％，pH7.2，余量為慣常的添加劑不予贅述； 所述耐鹽凈污菌為前述的保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的菌種，保藏編號(hào)為CGMCC No.3314； 所述耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或38-40℃的任一范圍值； 參見圖3，試驗(yàn)表明，在溫度為20℃～40℃時(shí)，菌株都能生長(zhǎng)良好，且在溫度為35℃時(shí)，生物量達(dá)到最大。
所述的耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的搖瓶振蕩的速度優(yōu)選為120-150轉(zhuǎn)/分鐘或150-160轉(zhuǎn)/分鐘或160-170轉(zhuǎn)/分鐘或170-180轉(zhuǎn)/分鐘的任一范圍值； 參見圖4，試驗(yàn)表明搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，搖瓶振蕩的速度過低不利于菌株NY0931的生長(zhǎng)，隨著轉(zhuǎn)速加快，細(xì)胞生物量增多，但過高的轉(zhuǎn)速容易使培養(yǎng)液溢出，因此，適宜的菌株培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120-180轉(zhuǎn)/分鐘，最佳的轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘。
步驟2)將上述培養(yǎng)好的菌種，按培養(yǎng)基重量的0.5％-2％的接種量接入到預(yù)設(shè)容積的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中有預(yù)設(shè)量的培養(yǎng)基，如將上述培養(yǎng)好的菌種，按1％的接種量接入到預(yù)設(shè)容積量的發(fā)酵罐中，如10升發(fā)酵罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 步驟2進(jìn)一步的實(shí)施例是 優(yōu)選的發(fā)酵罐所用的培養(yǎng)基具有蛋白胨0.5％、酵母提取物為0.1-0.5％或0.5％-1％、高磷酸鐵0.001％、原海水、pH7.0-7.5，余量為慣常的添加劑不予贅述； 所述耐鹽凈污菌的接種量與培養(yǎng)基的重量百分比優(yōu)選為1％-1.5％或1.5％-2％的任一范圍值； 參見圖5，此試驗(yàn)表明了耐鹽凈污菌的接種量對(duì)制備菌劑的影響。當(dāng)培養(yǎng)24h后，隨著接種量增加，菌劑生長(zhǎng)量變化不大，因此，菌劑發(fā)酵的適宜接種量在1-2％均可，但結(jié)合成本因素，選擇1％接種量可有效降低成本； 步驟3)發(fā)酵罐生產(chǎn)過程中，無菌空氣的通氣量為4.0-6.0升/分鐘，攪拌速度為60轉(zhuǎn)/分鐘120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為25℃-40℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液分裝，或采用無菌附著物吸附、干燥，制成固體菌劑。
步驟3進(jìn)一步的實(shí)施例是 所述的無菌空氣通氣量?jī)?yōu)選為4.0升/分鐘或5.0升/分鐘或6.0升/分鐘的任一范圍值； 參見圖6，試驗(yàn)表明通氣量對(duì)菌種發(fā)酵的影響較大，其中，通氣量為4.0-6.0升/分鐘時(shí)，菌劑生長(zhǎng)良好。
攪拌速度優(yōu)選為120-150轉(zhuǎn)/分鐘或150-180轉(zhuǎn)/分鐘的任一范圍值； 培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-40℃的任一范圍值； 所述全流程培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為24-30小時(shí)或30-36小時(shí)或36-42或42-48小時(shí)任一范圍值； 參見圖7，試驗(yàn)表明，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌體不斷生長(zhǎng)，其中，發(fā)酵時(shí)間為24-48小時(shí)時(shí)，菌劑處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)。
所述發(fā)酵罐用的培養(yǎng)基包括蛋白胨0.5％、酵母提取物0.1-1％、高磷酸鐵0.001％、原海水，pH7.0-7.5； 參見圖8，試驗(yàn)表明酵母提取物濃度對(duì)菌劑發(fā)酵有較大的影響，其中，酵母提取物濃度在酵母提取物為0.1-0.5％或0.5％-1％范圍時(shí)，菌劑生長(zhǎng)良好。
所述耐鹽凈污菌適合pH值在5.5-10之間，適于生長(zhǎng)溫度還可以進(jìn)一步優(yōu)選為35℃或36℃或37℃任一種。
所述耐鹽凈污菌，適合pH值優(yōu)選在5.5-6.5或6.6-7.5或7.6-8.5或8.6-9.5或9.6-10任一范圍值。
所述耐鹽凈污菌，最適pH值優(yōu)選在6或7或8或9的任一值； 參見圖2，試驗(yàn)表明菌株NY0931適應(yīng)pH值范圍較廣，在初始pH值5.5～10.0范圍均能內(nèi)能良好生長(zhǎng)。
發(fā)酵完成后還可以培養(yǎng)液直接用塑料包裝桶分裝，或采用活性炭吸附制成固體菌劑。
由前述方法制得菌劑用于含鹽廢水處理，污水凈化效果顯著。
由前述方法制得菌劑用于海水利用后的廢水處理，污水凈化效果顯著。
由前述各實(shí)施例制得的耐鹽凈污菌劑應(yīng)用于含鹽污水或海水利用后的廢水處理，而且不斷進(jìn)一步的菌劑制備措施配置，可使菌劑的制造成本更低廉，更有益于產(chǎn)業(yè)推廣應(yīng)用，有下述試驗(yàn)可說明本案耐鹽凈污菌劑凈化含鹽污水的優(yōu)異效果。
1.實(shí)驗(yàn)室搖瓶試驗(yàn) 從污染海灘泥樣中分離出菌株NY0931， 將活化后的NY0931菌液按1％接種量轉(zhuǎn)接到100mL沒有滅菌的人工污水中(250mL三角瓶)，37℃、160轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)24小時(shí)后離心取上清液，測(cè)定化學(xué)需氧量(COD)值。參見圖10可知，與空白相比較，人工污水化學(xué)需氧量(COD)值顯著降低，化學(xué)需氧量(COD)去除率達(dá)到72％，說明菌株NY0931對(duì)人工污水具有較好的凈化效果。
2.NY0931菌劑對(duì)污水處理裝置的生物強(qiáng)化作用 利用含鹽污水處理裝置進(jìn)行生物強(qiáng)化處理試驗(yàn)，該中試裝置采用先進(jìn)的循環(huán)式活性污泥法(CAST)污水處理工藝，PLC編程自動(dòng)控制。經(jīng)過半年多運(yùn)行試驗(yàn)表明(參見圖11)，進(jìn)水化學(xué)需氧量(COD)在300mg/L左右的條件下，生物強(qiáng)化前，化學(xué)需氧量(COD)去除率在70％左右，將NY0931發(fā)酵菌液離心后按1％的比例投加至主反應(yīng)池中，經(jīng)過三次強(qiáng)化投加，化學(xué)需氧量(COD)去除率達(dá)到了90％以上，且穩(wěn)定運(yùn)行，說明投加耐鹽凈污菌NY0931可以強(qiáng)化污水處理裝置的生物凈化能力，生物強(qiáng)化效果顯著。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，菌劑通過以下方法生產(chǎn)而成
1)將耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25℃-40℃、振蕩速度為120-180轉(zhuǎn)/分鐘，搖瓶振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
2)將上述培養(yǎng)好的菌種，按培養(yǎng)基重量的1％-2％的接種量接入到預(yù)設(shè)容積量的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
3)發(fā)酵罐生產(chǎn)過程中，無菌空氣的通氣量為4.0-6.0升/分鐘，攪拌速度為60-120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為25℃-40℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液分裝，或采用無菌附著物吸附、干燥，制成固體菌劑。
2.如權(quán)利要求1所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟1)所述耐鹽凈污菌保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏編號(hào)CGMCC No.3314。
3.如權(quán)利要求2所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟1)中耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的培養(yǎng)溫度為25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或37℃-40℃的任一范圍值。
4.如權(quán)利要求2或3所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的搖瓶振蕩的速度為120-150轉(zhuǎn)/分鐘或150-160轉(zhuǎn)/分鐘或116-170轉(zhuǎn)/分鐘或170-180轉(zhuǎn)/分鐘的任一范圍值。
5.如權(quán)利要求4所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述耐鹽凈污菌的接種量為培養(yǎng)基重量百分比的1％-1.5％或1.5％-2％的任一范圍值。
6.如權(quán)利要求5所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述的無菌空氣通氣量為4.0升/分鐘或5.0升/分鐘或6.0升/分鐘的任一范圍值。
7.如權(quán)利要求6所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述攪拌速度為60-90轉(zhuǎn)/分鐘或90-120轉(zhuǎn)/分鐘的任一范圍值。
8.如權(quán)利要求7所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述培養(yǎng)溫度為25℃-30℃或30℃-35℃或35℃-40℃的任一范圍值。
9.如權(quán)利要求8所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述全流程培養(yǎng)時(shí)間為24-30小時(shí)或30-36小時(shí)或36-42小時(shí)或42-48小時(shí)的任一范圍值。
10.如權(quán)利要求9所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵罐用的培養(yǎng)基包括蛋白胨0.5％、酵母提取物0.1-0.5％或0.5％-1％、高磷酸鐵0.001％、原海水pH7.0-7.5。
11.如權(quán)利要求10所述耐鹽凈污菌劑的制備方法，其特征在于，發(fā)酵罐生產(chǎn)過程中，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液直接用塑料包裝桶分裝，或采用活性炭吸附制成固體菌劑。
12.如權(quán)利要求1-11之一所述制備方法制得的耐鹽凈污菌劑，其特征在于，耐鹽凈污菌為微小桿菌屬(Exiguobacterium sp.NY0931)，主要生物學(xué)特性為革蘭氏陽性，幼齡培養(yǎng)物為桿狀，老培養(yǎng)物為球狀，有鞭毛，菌體大小0.5×3.0微米；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落平坦，橙黃色，邊緣整齊。
13.如權(quán)利要求12所述耐鹽凈污菌劑，其特征在于，所述耐鹽凈污菌，接觸酶、過氧化氫酶、硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，氧化酶、脲酶試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)為陰性；利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖類產(chǎn)酸。
14.如權(quán)利要求13所述耐鹽凈污菌劑，其特征在于，所述耐鹽凈污菌適合pH值在5.5-10之間，適于生長(zhǎng)溫度為35℃或36℃或37℃任一種。
15.如權(quán)利要求14所述耐鹽凈污菌劑，其特征在于，所述耐鹽凈污菌DNA的G+C含量為49.0mol％。
16.如權(quán)利要求15所述耐鹽凈污菌劑，其特征在于，所述耐鹽凈污菌，適合pH值在5.5-6.5或6.6-7.5或7.6-8.5或8.6-9.5或9.6-10任一范圍值。
17.如權(quán)利要求16所述耐鹽凈污菌劑，其特征在于，所述耐鹽凈污菌，最適pH值在6或7或8或9的任一值。
18.如權(quán)利要求17所述耐鹽凈污菌劑，其特征在于，
所述耐鹽凈污菌16S rDNA序列
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全文摘要
一種耐鹽凈污菌劑的制備方法及其菌劑，屬于含鹽廢水生物處理技術(shù)領(lǐng)域。耐鹽凈污菌劑的制備方法，其中，1)將耐鹽凈污菌試管種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2)將上述培養(yǎng)好的菌種，按培養(yǎng)基重量的1％-2％的接種量接入到預(yù)設(shè)容積量的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；3)發(fā)酵罐生產(chǎn)過程中，無菌空氣的通氣量為4.0-6.0升/分鐘，攪拌速度為60-120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為25℃-40℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液分裝，或采用無菌附著物吸附、干燥，制成固體菌劑。菌劑的菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏編號(hào)CGMCC No.3314。本發(fā)明采用生物強(qiáng)化技術(shù)，大大提高含鹽廢水處理能力，成本低，效果顯著。
文檔編號(hào)C02F3/34GK101811779SQ20091022916
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者張雨山, 王靜, 任華峰, 張曉青, 苗英霞, 成玉, 張愛君 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所