用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑、制備方法及用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑、制備方法及用途，其中，該熒光染色試劑包括染料分子，該染料分子可通過在聚乙二醇分子兩端分別化學(xué)連接膽固醇分子和熒光分子獲得。本發(fā)明對細(xì)菌或動物細(xì)胞的毒性低，幾乎無生物毒性，能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)菌和真菌死活狀態(tài)的長時間檢測；另外，本發(fā)明的試劑具有良好的水溶性。
【專利說明】
用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑、制備方法及用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，尤其是一種檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑以及制備該熒光染色試劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物檢測在環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工以及制藥工業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。其中，微生物的死活鑒定在反映飲用水及食品質(zhì)量、評價抗菌材料的效果以及確定污染源等方面是一項關(guān)鍵的檢測指標(biāo)。傳統(tǒng)的平板計數(shù)法通過利用活細(xì)菌在培養(yǎng)板上具有繁殖能力來對樣本中活細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行評價。
[0003]在該方法中，一個或少量活的細(xì)菌會在適宜的瓊脂糖培養(yǎng)板上生長成為一個肉眼可見的菌斑，因此菌落形成單位(CFU)的數(shù)量就反映了樣品中活細(xì)菌的多少。然而這種方法非常費時費力，并且所得數(shù)據(jù)的可靠性與實驗人員的操作有很大的關(guān)聯(lián)。除此之外，也有利用高分辨顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)或測量細(xì)菌細(xì)胞膜電位等方法來反映細(xì)菌活力，但這些檢測方法價格昂貴且樣品制備過程復(fù)雜，難以進(jìn)行廣泛應(yīng)用。
[0004]基于熒光的微生物活性檢測手段具有靈敏度高、易于操作和檢測速度快等優(yōu)點，在近年來得到了廣泛應(yīng)用。其中最為常見的熒光染料就是碘化丙啶(PI)。這種小分子不能夠穿過活細(xì)菌的細(xì)胞膜，但是可以透過死細(xì)菌破損的細(xì)胞膜與內(nèi)部的DNA結(jié)合并發(fā)出熒光，從而來反映細(xì)菌死亡。然而該分子具有很大的生物毒性，對人體及生態(tài)環(huán)境都存在潛在的危害。
[0005]此外，基于碘化丙啶的檢測手段要求在對細(xì)菌進(jìn)行染色后的短時間內(nèi)就必須進(jìn)行觀察，否則會對檢測結(jié)果造成偏差。由于含有較多苯環(huán)結(jié)構(gòu)，此類染料分子的水溶性很差，必須用二甲基亞砜等有機(jī)溶劑來溶解。因此，非常有必要開發(fā)一種水溶性良好，生物相容性好且靈敏度高的細(xì)菌及真菌活性熒光檢測試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，
【申請人】提供了一種檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑。更進(jìn)一步的目的是提供一種制備上述熒光染色試劑的方法。
[0007]本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體為:一種用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑，該熒光染色試劑包括染料分子，該染料分子可通過在聚乙二醇分子兩端分別化學(xué)連接膽固醇分子和熒光分子獲得?；蛘哒f，染料分子由在聚乙二醇分子的兩端分別化學(xué)連接膽固醇分子和熒光單元形成。
[0008]同時需要說明的是，在本文中，“用于檢測細(xì)菌和真菌……”，“細(xì)菌及真菌……”等表述中，其含義是指該熒光染色試劑可以用于檢測細(xì)菌的死活狀態(tài)，也可以用于檢測真菌的死活狀態(tài)。
[0009]優(yōu)選的，所述焚光分子為原P卜啉或二氫P卜吩e6。
[0010]優(yōu)選的，所述聚乙二醇的分子量為1000-10000。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述聚乙二醇的分子量為1800-2200 O更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述聚乙二醇的分子量為2000。
[0011]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種制備用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑的方法，包括如下步驟:
[0012]步驟1、活化熒光分子的羧基:稱取熒光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，并將其分別溶于二甲基亞砜，制得混合溶液;將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液依次加入熒光分子溶液中，混合并在室溫條件下反應(yīng)2?4小時，得到羧基活化后的熒光分子溶液；
[0013]步驟2、將所述羧基活化后的熒光分子溶液與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子混合，室溫反應(yīng)12小時以上；
[0014]反應(yīng)結(jié)束后，用預(yù)定截留分子量的透析袋在二甲基亞砜中透析純化，再用超純水透析純化，然后冷凍干燥，于-20°C中冷凍保存，備用。
[0015]優(yōu)選的，在所述步驟I中，熒光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為I: (4-40): (4-50)。
[0016]進(jìn)一步優(yōu)選的，在所述步驟I中，熒光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1: (8-12): (8-12)。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述摩爾比為1:10:10。
[0017]優(yōu)選的，所述熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為(1:1)?(100:1)。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述摩爾比為10:1。
[0018]更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種熒光染色試劑在檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)中的應(yīng)用，所述熒光染色試劑包括染料分子，該染料分子可通過在聚乙二醇分子兩端分別化學(xué)連接膽固醇分子和熒光分子獲得。該染料分子的制備方法如上文所述，此處不再重新描述。
[0019]優(yōu)選的，所述焚光分子為原B卜啉或二氫B卜吩e6，所述聚乙二醇的分子量為1000-10000。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述聚乙二醇的分子量為1800-2200，更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述聚乙二醇的分子量為2000。
[0020]實施本發(fā)明，可獲得的有益效果是:組成成分安全，對細(xì)菌或動物細(xì)胞的毒性低，幾乎無生物毒性，能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)菌和真菌死活狀態(tài)的長時間檢測;本發(fā)明的試劑具有良好的水溶性;在進(jìn)一步的實施例中，可通過替換不同的熒光分子實現(xiàn)不同發(fā)射波段的熒光檢測。
【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖2a和圖2b分別是對活大腸桿菌和死大腸桿菌的染色結(jié)果。
[0023]圖3a和圖3b分別是對活金黃色葡萄球菌和死金黃色葡萄球菌的染色結(jié)果。
[0024]圖4a和圖4b分別是對活酵母菌和死酵母菌的染色結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025]結(jié)合一下實施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明的狀態(tài)。
[0026]實施例1:
[0027](I)首先以原卟啉(PpIX)、l-(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為原料對原卟啉分子的羧基進(jìn)行活化。稱取1mg PpIX、20.4mg EDC.HCl和 12.3mg NHS并分別溶于ImL二甲基亞砜(DMSO)，PpIX先與EDC.HCl混合隨后再加入NHS于室溫下反應(yīng)2小時使羧基活化完全。
[0028](2)稱取 4.2mg 膽固醇-聚乙二醇 2000-氨基(cholesterol-PEG2000-NH2)和 43yL 三乙胺共溶于DMSO中，并與上述反應(yīng)體系混合。室溫下反應(yīng)過夜后，用截留分子量為2k的透析袋在DMSO中透析2天，隨后在超純水中透析I天進(jìn)行純化。最后在凍干機(jī)中冷凍干燥制成cholesterol-PEG2000-PpIX，于-20°C 中冷凍保存。
[0029]上述方法所得的試劑記為:膽固醇-聚乙二醇2000-原卟啉，其分子結(jié)構(gòu)見圖1。
[0030]實施例201至 206:
[0031]實施例201中，聚乙二醇的分子量為1000，熒光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:4:48;室溫反應(yīng)時間為3小時；熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為2:1。透析袋的截留分子量為1000。
[0032]實施例202中，聚乙二醇的分子量為5000，熒光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:10:20;室溫反應(yīng)時間為2小時；熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為10:1。透析袋的截留分子量為1000。
[0033]實施例203中，聚乙二醇的分子量為10000，熒光分子原卟啉(PpIX)、1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:4:10;室溫反應(yīng)時間為4小時；熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為20:1。透析袋的截留分子量為10000。
[0034]實施例204中，聚乙二醇的分子量為8000，熒光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:40:40;室溫反應(yīng)時間為2.5小時;熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為5:1。透析袋的截留分子量為8000。
[0035]實施例205中，聚乙二醇的分子量為7000，熒光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:20:30;室溫反應(yīng)時間為3.5小時；熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為80:1。透析袋的截留分子量為7000。
[0036]實施例206中，聚乙二醇的分子量為4000，熒光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:40:10;室溫反應(yīng)時間為2.5小時；熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為100:1。透析袋的截留分子量為4000。
[0037]實施例301?實施例306
[0038]在實施例301至306中，熒光分子為二氫卟吩e6分子，其他反應(yīng)參數(shù)分別對應(yīng)實施例201至實施例206。
[0039]實施例4:
[0040]測試實施例1的染料分子對于大腸桿菌死活狀態(tài)的鑒別能力，方法如下:在生長有大腸桿菌的LB固體培養(yǎng)板上挑取單菌落，然后轉(zhuǎn)移至3mL的液體培養(yǎng)基中于37°C條件下培養(yǎng)至細(xì)菌在600nm的濁度為0.5左右。將細(xì)菌懸濁液等分為兩份，8000^11?離心5分鐘收集細(xì)菌。其中一份用500yL70%異丙醇重懸并在室溫下靜置I?2小時處死細(xì)菌，另一份用500yL生理鹽水重懸并靜置同等時間。處死完成的細(xì)菌用生理鹽水清洗2遍。隨后，在兩個離心管中分別加入ImL 50yg/mL的膽固醇-聚乙二醇2000-原卩卜啉并重懸細(xì)菌，放置于37°C搖床中孵育30分鐘。
[0041]最后，將細(xì)菌懸液滴片并與激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察(激發(fā)光波長:552nm，接收波段:610-650nm)。實驗結(jié)果見附圖2a和圖2b。實驗結(jié)果表明，該染料分子能夠明顯區(qū)分大腸桿菌的死活狀態(tài)，其中死的大腸桿菌發(fā)出明亮的紅色熒光，如圖2b所示。而活的大腸桿菌則幾乎不發(fā)出熒光，如圖2a所示。
[0042]實施例5:
[0043]測試實施例1的染料分子對于金黃色葡萄球菌死活狀態(tài)的鑒別能力，方法如實施例5所述。實驗結(jié)果見附圖3a和圖3b。實驗結(jié)果表明，該染料分子能夠明顯區(qū)分金黃色葡萄球菌的死活狀態(tài)，其中死的金黃色葡萄球菌發(fā)出明亮的紅色熒光，如圖3b所示。而活的金黃色葡萄球菌發(fā)出的熒光非常微弱，如圖3a所示。
[0044]實施例6:
[0045]測試實施例1的染料分子對于酵母菌死活狀態(tài)的鑒別能力，方法如下:取生長狀態(tài)良好，濁度為0.5的酵母菌液2mL，等分為兩份。SOOOrpm離心并棄除上清液后，其中一份用500yL70%異丙醇重懸并在室溫下靜置I?2小時處死真菌，另一份用500yL生理鹽水重懸并靜置同等時間。處死完成的酵母菌用生理鹽水清洗2遍。隨后，在兩個離心管中分別加入ImL50yg/mL的膽固醇-聚乙二醇2000-原卟啉并重懸酵母菌，放置于37°C搖床中孵育30分鐘。
[0046]最后，將酵母菌懸液滴片并與激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察(激發(fā)光波長:552nm，接收波段:610-650nm)。實驗結(jié)果見附圖4a和圖4b。實驗結(jié)果表明，該染料分子能夠明顯區(qū)分酵母菌的死活狀態(tài)，其中死的酵母發(fā)出明亮的紅色熒光，如圖4b所示。而活的酵母菌則不發(fā)出焚光，如圖4a所不。
[0047]需要說明的是，可以根據(jù)實際情況選擇或替換熒光分子，以改變發(fā)射波長，實現(xiàn)不同發(fā)射波段的熒光檢測。總之，本發(fā)明至少有以下優(yōu)點:本發(fā)明試劑的組成成分均非常安全。聚乙二醇具有良好的生物相容性，是經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的、可用作臨床藥物輔料的高分子材料。疏水單元如膽固醇和磷脂分子都是細(xì)胞膜的固有成分，而原卟啉分子更是人體血紅素的組成成分。因此該試劑無論對于細(xì)菌本身或動物細(xì)胞的毒性都非常低。相對于傳統(tǒng)的PI分子或目前市售的細(xì)菌死活檢測試劑，本發(fā)明試劑具有良好的水溶性。本發(fā)明試劑能夠?qū)崿F(xiàn)對于死亡的細(xì)菌和真菌細(xì)胞的免清洗成像，并且具有良好的檢測靈敏度。由于本發(fā)明試劑幾乎無生物毒性，該染料能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)菌和真菌死活狀態(tài)的長時間動態(tài)檢測。
【主權(quán)項】
1.一種用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑，其特征在于，該熒光染色試劑包括染料分子，該染料分子可通過在聚乙二醇分子兩端分別化學(xué)連接膽固醇分子和熒光分子獲得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑，其特征在于，所述焚光分子為原P卜啉或二氫P卜吩e6。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為1000-10000。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為1800-2200。5.制備用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1、活化熒光分子的羧基:稱取熒光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，并將其分別溶于二甲基亞砜，制得混合溶液;將卜(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液依次加入熒光分子溶液中，混合并在室溫條件下反應(yīng)2?4小時，得到羧基活化后的熒光分子溶液； 步驟2、將所述羧基活化后的熒光分子溶液與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子混合，室溫反應(yīng)12小時以上； 反應(yīng)結(jié)束后，用預(yù)定截留分子量的透析袋在二甲基亞砜中透析純化，再用超純水透析純化，然后冷凍干燥，于-20 0C中冷凍保存，備用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑的方法，其特征在于，在所述步驟I中，熒光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為I: (4-40): (4-50)。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑的方法，其特征在于，在所述步驟I中，熒光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為I: (8-12): (8-12)。8.根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的制備用于檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)的熒光染色試劑的方法，其特征在于，所述熒光分子與膽固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩爾比為(1:1)?(100:l)o9.一種熒光染色試劑在檢測細(xì)菌及真菌死活狀態(tài)中的應(yīng)用，其特征在于，所述熒光染色試劑包括染料分子，該染料分子可通過在聚乙二醇分子兩端分別化學(xué)連接膽固醇分子和焚光分子獲得。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述熒光分子為原卟啉或二氫卟吩e6，所述聚乙二醇的分子量為1000-10000。
【文檔編號】C09K11/06GK105969334SQ201610296680
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】吳富根, 賈浩然, 祝雅璇
【申請人】東南大學(xué)