一種功能性超順磁熒光標(biāo)記微膠囊及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光磁性微膠囊（Fluorescence&MagnetismMicrocapsule,簡稱F&M微膠囊）的制備及在其基礎(chǔ)上的微囊分離、鑒定方法。熒光磁性微膠囊以自發(fā)熒光殼聚糖為微膠囊主體材料，微囊內(nèi)裝載超順磁四氧化三鐵納米粒，并海藻酸鈣凝膠微球作為微膠囊形成模板。所制備F&M微膠囊，粒徑均一、可調(diào)節(jié)，具有良好生物相容性，在磁場作用下能夠?qū)崿F(xiàn)與常規(guī)微膠囊徹底分離，并且可以通過微囊材料自帶熒光驗(yàn)證分離效果。此熒光磁性微膠囊，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞共培養(yǎng)。
【專利說明】一種功能性超順磁熒光標(biāo)記微膠囊及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及超順磁材料、自發(fā)熒光殼聚糖材料、微膠囊細(xì)胞培養(yǎng)及分離體系。具體地說是一種具備超順磁磁性驅(qū)動(dòng)、自發(fā)熒光標(biāo)記的微膠囊及在其基礎(chǔ)上形成的細(xì)胞三維培養(yǎng)分離體系。
【背景技術(shù)】
[0002]微膠囊技術(shù)是目前三維細(xì)胞培養(yǎng)及藥物裝載的重要發(fā)展方向，與此同時(shí)細(xì)胞微環(huán)境對細(xì)胞增殖分化的影響同樣是細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，兼具高效的細(xì)胞分離能力及有效的驗(yàn)證手段的細(xì)胞三維培養(yǎng)、分離體系是目前急需解決的問題同時(shí)也是研究開發(fā)的重點(diǎn)。磁性驅(qū)動(dòng)微膠囊因其細(xì)胞毒性小、作用力易于控制等優(yōu)點(diǎn)成為目前發(fā)展的熱點(diǎn)之一，其應(yīng)用焦點(diǎn)三維細(xì)胞培養(yǎng)的分離、微囊與培養(yǎng)環(huán)境的分離及體外功能化人工器官的構(gòu)建等?，F(xiàn)在已報(bào)道的微膠囊技術(shù)及其存在的問題包括如下幾個(gè)方面:
[0003](I)微膠囊裝載藥物及功能化細(xì)胞(文獻(xiàn)1，2，3)。以微膠囊裝載藥物及功能化細(xì)胞等可以提高藥物在體內(nèi)的投遞準(zhǔn)確性，延長細(xì)胞存活周期提高貨架期，如裝載抗氧化劑可提聞抗氧化劑的效率，裝載益生菌可提聞益生菌在面包中的活率提聞品質(zhì)，裝載姜黃素可以提高姜黃素對食物的防腐能力等。但主要起到的是保護(hù)及維持微環(huán)境的作用，并不具備分離及標(biāo)記的功能。
[0004](2)磁性微膠囊磁性控釋及靶向識別(文獻(xiàn)4，5)。目前磁性微膠囊主要用于利用磁性開關(guān)控制藥物釋放、通過磁場的牽引實(shí)現(xiàn)靶向識別及通過磁性實(shí)現(xiàn)對特異性物質(zhì)的富集，如通過在聚烯丙胺微膠囊中裝載四氧化三鐵納米粒實(shí)現(xiàn)對內(nèi)含物的控制釋放及靶向控制，通過在海藻酸鈉微膠囊中裝載Y三氧化二鐵納米粒用來富集水中二價(jià)鎳等。但磁性微膠囊的磁性遷移能力沒有得到驗(yàn)證，分離能力也沒有分離結(jié)果的直接證據(jù)證明，熒光標(biāo)記引入小分子熒光物質(zhì)存在細(xì)胞毒性及熒光猝滅的隱患。
[0005]以海藻酸鈉微球?yàn)槟０逯苽涞臍ぞ厶俏⒛z囊本身具備優(yōu)良的生物相容性，粒徑膜厚可控，孔徑適用于細(xì)胞的微囊化三維培養(yǎng)。超順磁四氧化三鐵納米粒具備超順磁及低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)。而所使用的自發(fā)熒光殼聚糖，其具備成膜材料本身具備熒光激發(fā)發(fā)射特性，并且發(fā)射波長隨激發(fā)波長移動(dòng)的特點(diǎn)可以在多種激發(fā)光條件下相互驗(yàn)證。通過使用熒光殼聚糖與磁性納米粒結(jié)合制備微膠囊，并與常規(guī)微膠囊結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)不同裝載物的分離及驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞共培養(yǎng)及可控分離技術(shù)，使其具備細(xì)胞三維共培養(yǎng)因素分析的廣闊應(yīng)用前景。
[0006]參考文獻(xiàn):
[0007]I)Rodrigues, E.,et al., Microcapsules containing antioxidant moleculesasscavengers of reactive oxygen and nitrogen species.Food Chemistry,2012.134(2):p.704-711.[0008]2)Altamirano-Fortoulj R., et al., Viability of some probiotic coatings inbread and itseffect on the crust mechanical properties.Food Hydrocolloids, 2012.29(1):p.166-174.[0009]3) Wang, Y.-F., e t al., Food preservation effects of curcuminmicrocapsules.FoodControlj 2012.27 (I):p.113-117.[0010]4) Ngomsikj A.F., et al., Nickel adsorption by magnetic alginatemicrocapsulescontaining an extractant.Water Research, 2006.40(9):p.1848-1856.[0011]5) Hu，S.-H.，et al., Controlled Rupture of Magnetic PolyelectrolyteMicrocapsulesfor Drug Delivery.Langmuir,2008.24(20):p.11811-11818.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]為了解決上述問題，本發(fā)明目的是為制備一種同時(shí)具備磁性驅(qū)動(dòng)迀移分離能力和自發(fā)熒光標(biāo)記能力的微膠囊，并用常規(guī)殼聚糖微膠囊與其聯(lián)用形成一套細(xì)胞三維共培養(yǎng)分離體系。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0014]磁性納米摻雜于海藻酸鈉溶液中，采用靜電液滴的方法形成微球，自發(fā)熒光殼聚糖通過靜電交聯(lián)在海藻酸鈉微球表面形成微囊，檸檬酸液化海藻酸鈉核心，最終完成微膠囊制備；使用磁性熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊在形成微球前裝載細(xì)胞及形成了細(xì)胞三維共培養(yǎng)分離的培養(yǎng)體系。
[0015]具體為:以摻混四氧化三鐵磁性納米粒海藻酸鈉，使用氯化鈣溶液通過靜電液滴法制備海藻酸I丐凝膠微球，利用突光殼聚糖本身表面氨基正電荷與海藻酸鈉表面羧基負(fù)電荷靜電結(jié)合形成表面自發(fā)熒光微囊，再使用檸檬酸鈉液化核心海藻酸鈉凝膠，形成具備磁性牽引熒光標(biāo)示能力微膠囊，其所結(jié)合方式如圖6所示:
[0016]本發(fā)明的另一功能是用于裝載藥物等，實(shí)從而現(xiàn)磁性靶向給藥及熒光示蹤。
[0017]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0018](I)具備超順磁的磁性牽引能力。使用超順磁磁性納米粒本發(fā)明具備了超順磁的磁性牽引能力，從而可以在定向磁場牽引下實(shí)現(xiàn)與非超順磁磁性微膠囊的分離，并具備磁靶向的潛力。
[0019](2)微膠囊膜成膜材料自發(fā)熒光。使用自發(fā)熒光殼聚糖本發(fā)明具備自發(fā)熒光特性，一方面避免了引入其他熒光物質(zhì)帶來的影響，另一方面自發(fā)熒光殼聚糖特殊的熒光性質(zhì)使微囊具備多波段驗(yàn)證的手段，可在復(fù)雜背景環(huán)境中準(zhǔn)確標(biāo)示。
[0020](3)微膠囊材料生物相容性優(yōu)良。微膠囊制備材料使用殼聚糖、海藻酸鈉及四氧化三鐵納米粒，其毒性都由細(xì)胞毒性驗(yàn)證，均能夠充分滿足細(xì)胞三維培養(yǎng)需要。
[0021](4)微膠囊粒徑均一且粒徑大小適宜細(xì)胞培養(yǎng)可調(diào)節(jié)。納米粒粒徑范圍微米級連續(xù)可調(diào)，所得微膠囊粒徑均一性能穩(wěn)定。
[0022](5)為細(xì)胞培養(yǎng)提供近似在體的三維培養(yǎng)環(huán)境。微膠囊內(nèi)部的空腔及海藻酸鈉液化后構(gòu)成的凝膠網(wǎng)絡(luò)為為細(xì)胞生長提供了近似在體的三維培養(yǎng)環(huán)境。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是熒光顯微鏡下裝載細(xì)胞的磁性熒光微膠囊和常規(guī)微膠囊成像對比結(jié)果(熒光顯微鏡兩種微囊采用相同的曝光條件)。[0024]圖2是熒光磁性微膠囊與常規(guī)微膠囊外形對比
[0025]圖3是熒光顯微鏡下磁性熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊共培養(yǎng)細(xì)胞成像結(jié)果。
[0026]圖4是熒光顯微鏡下磁性熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊共培養(yǎng)細(xì)胞后分離成像結(jié)果。
[0027]圖5是磁性鑷子牽引磁性微膠囊運(yùn)動(dòng)成像結(jié)果。
[0028]圖6為具備磁性牽引熒光標(biāo)示能力微膠囊的結(jié)合方式。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0030]實(shí)施例1
[0031 ] 超順磁熒光微膠囊制備方法:
[0032](I):超順磁四氧化三鐵納米粒制備及處理:
[0033]采用高壓反應(yīng)釜油酸分離方式制備四氧化三鐵納米粒，并由實(shí)驗(yàn)室專利技術(shù)包裹親水二氧化硅外殼增強(qiáng)親水性。
[0034](2)制備海藻酸鈣凝膠微球:
[0035]使用濾過0.22 μ m水系濾膜生理鹽水配制15mg/ml海藻酸鈉溶液，溶解后溶液依次濾過0.8 μ m、0.45 μ m、0.22 μ m水系濾膜,最終高壓滅菌。將制備的超順磁四氧化三鐵納米粒高壓滅菌，超凈臺(tái)操作以lmg/ml比例加入海藻酸鈉溶液，再將培養(yǎng)的對數(shù)期CHO細(xì)胞以IO6個(gè)/ml加入海藻酸鈉溶液中。采用靜電液滴法將海藻酸鈉滴入12mg/ml過膜(0.22)滅菌氯化鈣溶液中，通過控制電壓及泵速針頭尺寸調(diào)節(jié)膠珠粒徑，制備裝載有磁性納米粒及所需培養(yǎng)細(xì)胞的凝膠膠珠。
[0036](3)殼聚糖成膜形成微膠囊:
[0037]所制備膠珠按1:5體積比與5mg/ml自發(fā)熒光殼聚糖(生理鹽水配制、過0.22膜、滅菌)充分混合適當(dāng)時(shí)間形成足夠厚度后，使用生理鹽水清洗終止反應(yīng)。
[0038](4)檸檬酸鈉液化海藻酸鈣核心:
[0039]使用生理鹽水配制12mg/ml檸檬酸鈉溶液，過0.22膜，滅菌，與膠珠按5:1體積比混合，充分接觸IOmin是海藻酸鈣凝膠核心液化。常規(guī)微囊采用相似方法，為方便直觀區(qū)別制備磁性熒光微囊與常規(guī)微囊控制粒徑不同，如圖1，2其熒光性質(zhì)在熒光顯微鏡下可明顯分辨兩種微囊。
[0040]實(shí)施例2
[0041]超順磁熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊組成細(xì)胞三位培養(yǎng)磁性分離熒光驗(yàn)證體系。
[0042](I)制備微膠囊
[0043]依照實(shí)施例1的方法制備裝載細(xì)胞CHO超順磁熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊。
[0044](2)兩種微膠囊混合共培養(yǎng)
[0045]將兩種微膠囊按照體積比1:1混合，在DMEM培養(yǎng)基中共培養(yǎng)4天。觀察細(xì)胞生長情況良好，如圖3所示根據(jù)熒光可明顯區(qū)分兩種微囊。
[0046](3)共培養(yǎng)細(xì)胞分離
[0047]通過自制裝置利用磁性微膠囊超順磁原理，實(shí)現(xiàn)對超順磁熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊，得到100%純度的常規(guī)載細(xì)胞微膠囊(圖4)。
[0048]實(shí)施例3[0049]磁性鑷顯微操作分離超順磁熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊
[0050](I)制備微膠囊
[0051]依照實(shí)施例1的方法制備裝載細(xì)胞CHO超順磁熒光微膠囊與常規(guī)微膠囊。
[0052](2)顯微鏡下磁性鑷分離
[0053]將兩種微囊各取200ml混合，在顯微鏡下適當(dāng)倍數(shù)下，如圖5所示，依靠磁性鑷磁力可以牽引載細(xì)胞的磁性微囊移動(dòng)實(shí)現(xiàn)分離。
【權(quán)利要求】
1.一種功能性超順磁熒光標(biāo)記微膠囊，其特征在于: 微膠囊以海綿狀海藻酸鈣為骨架，其外包裹有以殼聚糖為材料的微膠囊膜，微囊內(nèi)還裝載順磁性納米粒子四氧化三鐵納米粒子；微囊內(nèi)裝載四氧化三鐵納米粒子裝載濃度為l-10mg/ml微膠囊,微囊內(nèi)海藻酸I丐裝載濃度為2-10mg/ml微膠囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超順磁熒光標(biāo)記微膠囊，其特征在于: 微囊內(nèi)粒徑為100-1000 μ m,壁厚5-30 μ m ;所述殼聚糖為分子量3_10KDa的殼聚糖，殼聚糖脫乙酰度70-95%。
3.—種權(quán)利要求1所述超順磁熒光標(biāo)記微膠囊的制備方法，其特征在于: 以摻混l-10mg/ml四氧化三鐵磁性納米粒4_20mg/ml海藻酸鈉水溶液，將海藻酸鈉水溶液滴入質(zhì)量濃度0.5-2%氯化鈣水溶液中，通過靜電液滴法制備海藻酸鈣凝膠微球；將海藻酸鈣凝膠微球加入l-10mg/ml殼聚糖水溶液中，利用殼聚糖本身表面氨基正電荷與海藻酸鈉表面羧基負(fù)電荷靜電結(jié)合形成表面自發(fā)突光微囊，再使用5-20mg/ml朽1檬酸鈉水溶液液化微囊核心海藻酸鈉凝膠，形成具備磁性牽引熒光標(biāo)示能力微膠囊。
4.一種權(quán)利要求1或2所述超順磁熒光標(biāo)記微膠囊的應(yīng)用，其特征在于: 采用權(quán)利要求1或2所述的超順磁熒光標(biāo)記微膠囊建立起可磁性分離熒光驗(yàn)證的細(xì)胞三維培養(yǎng)體系； 或，將權(quán)利要求1或2所述的超順磁熒光標(biāo)記微膠囊與無順磁熒光性質(zhì)微膠囊相結(jié)合裝載細(xì)胞后共培養(yǎng)形成可磁性分離熒光驗(yàn)證的細(xì)胞三維培養(yǎng)體系，可以依靠磁場驅(qū)動(dòng)實(shí)現(xiàn)微囊細(xì)胞的分離，并可通過熒光信號驗(yàn)證分離效果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:對于裝載細(xì)胞及藥品選擇范圍寬泛只需水溶性或水分散適宜即可。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的細(xì)胞三維培養(yǎng)體分離系，實(shí)現(xiàn)體系內(nèi)不同種細(xì)胞依靠磁場實(shí)現(xiàn)分離，熒光實(shí)時(shí)驗(yàn)證分離效果。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:分離過程可于顯微操作下操作，依靠具備磁性的顯微操作工具實(shí)現(xiàn)對摻混微膠囊的分離。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:殼聚糖兼是一種具熒光識別性能與穩(wěn)定成膜性能材料，微膠囊同時(shí)具備順磁性磁場驅(qū)動(dòng)位移的性能，以及熒光顯色的性能，可以無順磁熒光性質(zhì)微膠囊摻混后依靠其順磁性遷移能重新分離，并通過熒光顯色性能進(jìn)行確認(rèn)。
【文檔編號】C09K11/06GK103861534SQ201210551859
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月17日
【發(fā)明者】馬小軍, 譚明乾, 吳昊 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所