一種進(jìn)行固相pcr反應(yīng)的自動(dòng)化微流工作站的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開(kāi)了一種進(jìn)行固相PCR反應(yīng)的自動(dòng)化微流工作站，該工作站包括：至少一個(gè)微流控芯片，芯片含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)通道，每一反應(yīng)通道包括進(jìn)出口、一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)或并聯(lián)的反應(yīng)腔室和/或流道，反應(yīng)腔室底面錨定有寡核苷酸序列，以進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增和/或固相單堿基延伸反應(yīng)；液路系統(tǒng)，以控制引入不同反應(yīng)試劑溶液流至對(duì)應(yīng)的反應(yīng)腔室；溫控裝置，以控制調(diào)節(jié)所述反應(yīng)腔室內(nèi)的溫度；控制系統(tǒng)，其連接上述液路系統(tǒng)和溫控裝置，用于控制液路系統(tǒng)和溫控裝置，在微流控芯片的反應(yīng)腔室內(nèi)進(jìn)行的固相PCR擴(kuò)增和/或固相單堿基延伸反應(yīng)，并包括變性-洗脫反應(yīng)和洗脫-變性反應(yīng)。該工作站具有一站式自動(dòng)化、較高通量、低成本、操作方便、快速高效、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
-種進(jìn)行固相PCR反應(yīng)的自動(dòng)化微流工作站
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本實(shí)用新型設(shè)及基因工程領(lǐng)域，特別設(shè)及一種基于微流控忍片的固相PCR&單堿基 延伸反應(yīng)，對(duì)接核酸質(zhì)譜檢測(cè)，主要應(yīng)用于單核巧酸多態(tài)性檢測(cè)，尤其是一種適用于一站式 自動(dòng)化、多樣本、高通量、快反應(yīng)、低成本的SNP檢測(cè)樣本前處理，可與核酸質(zhì)譜檢測(cè)儀如 MLDI-TOF-MS直接對(duì)接，進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核巧酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymor地isms,SNPs)是指?jìng)€(gè)體基因組內(nèi) 特定核巧酸位置上的單個(gè)堿基A，T，C，G的改變而引起的DNA序列的改變或突變，運(yùn)種突變包 括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，只有當(dāng)?shù)任换虻念l率大于或等于1%時(shí) 才能稱得上是SNPs，然而部分SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)如HGVBase把等位基因的頻率小于1 %的變異也包 括在SNPs內(nèi)。研究表明，人類每對(duì)等位染色體上每1000 bp就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP，而整個(gè)人類基因 組每3(K)bp就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP，在任意兩個(gè)個(gè)體之間，就有好幾百萬(wàn)的單堿基差異和十萬(wàn)個(gè)氨 基酸的不同，在一定程度上反映了人類個(gè)體或群體的特異性，也造成人類在內(nèi)的物種之間 染色體基因組的多樣性。
[0003] 對(duì)人類基因組的SNP進(jìn)行大規(guī)模的研究具有重要的意義，它不僅可W研究人類的 起源、進(jìn)化和群體遺傳學(xué)特征，而且為多基因病和復(fù)雜性疾病如人類腫瘤、糖尿病、屯、血管 疾病、自身免疫性疾病、精神病、老年性癡呆等相關(guān)基因的研究和藥物遺傳學(xué)的研究提供了 科學(xué)基礎(chǔ)和先進(jìn)手段。SNP檢測(cè)是目前基因診斷的主要研究?jī)?nèi)容。同時(shí)，SNP檢測(cè)所代表的基 因診斷也逐漸成為新生兒或特定人群遺傳病篩查的重要手段之一。
[0004] 由于SNP其重要性，并且隨著SNP研究的普及和深入，SNP的檢測(cè)方法目前已有了長(zhǎng) 遠(yuǎn)的發(fā)展，如全基因組測(cè)序，外顯子組測(cè)序，全基因組SNP忍片，質(zhì)譜法，SNPseq法，SNPlex， SNaPshot等，都可W快速、高效、較大通量檢測(cè)基因組中的SNP，但運(yùn)些設(shè)備價(jià)格昂貴，僅適 用于大型實(shí)驗(yàn)室的研究，難W在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行普及。
[0005] 質(zhì)譜法是SNP位點(diǎn)檢測(cè)的常用方法和最具前景的技術(shù)。質(zhì)譜法是通過(guò)對(duì)物質(zhì)的分 子量(質(zhì)荷比）進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到區(qū)分、鑒別物質(zhì)的目的。SNP位點(diǎn)兩個(gè)等位基因之間存在分子 量差異，通過(guò)分型實(shí)驗(yàn)將差異放大，然后W質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)即可達(dá)到SNP分型的目的。其主 要是在緊挨SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段探針，在反應(yīng)體系中W雙脫氧核糖核巧S憐酸（ddNTP， dideoxy-nucIeoside triphosphate)替代dNTP脫氧核糖核巧S憐酸（dNTP，deoxy-nucleotide thiophos地ate))，使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止。根據(jù)SNP位點(diǎn) 的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質(zhì)譜儀可W檢測(cè)出運(yùn)種微小的 分子量差異，從而實(shí)現(xiàn)SNP分型的目的。
[0006] 其中，MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物忍片系統(tǒng)由專業(yè)生產(chǎn)生物忍片系統(tǒng)用于遺傳 突變及SNP領(lǐng)域研究的美國(guó)Sequenom公司開(kāi)發(fā)，是目前采用質(zhì)譜法直接檢測(cè)SNP的成熟設(shè) 備。該系統(tǒng)的突出特點(diǎn)是能W極高的精確度進(jìn)行基因型識(shí)別，直接測(cè)出帶有SNP或其他突變 的目標(biāo)DNA。由于質(zhì)譜法直接檢測(cè)分子的本質(zhì)特征-分子量，不需要通過(guò)巧光標(biāo)記來(lái)進(jìn)行間 接檢測(cè)，準(zhǔn)確可靠；靈敏度高，可檢測(cè)低至long的核酸片段。然而，國(guó)外公司利用質(zhì)譜儀對(duì) SNPs位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的方法，在樣本前處理過(guò)程中存在不少缺陷。如Sequenom的標(biāo)準(zhǔn)流程采 用的是兩步PCR:普通PCR預(yù)擴(kuò)增和單堿基延伸PCR擴(kuò)增，即放大含待檢測(cè)SNP位點(diǎn)的ssDNA模 板和放大含SNP位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物;PCR預(yù)擴(kuò)增需要45個(gè)循環(huán)，單堿基延伸循環(huán)需要40個(gè)外循 環(huán)且每個(gè)外循環(huán)又內(nèi)嵌5個(gè)內(nèi)循環(huán)反應(yīng);且在兩次PCR擴(kuò)增之間，還需要使用郵堿性憐酸酶 (化rimp A化aline陸OS曲atase，SAP)消化除去第一次PCR反應(yīng)體系中剩余的dNTP和引物； 運(yùn)樣就造成樣本處理時(shí)間的延長(zhǎng)、試劑消耗及檢測(cè)成本的增加，尤其整個(gè)流程操作需要長(zhǎng) 達(dá)10個(gè)小時(shí)左右，不利于樣本的即時(shí)檢測(cè)。
[0007]微流控忍片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基 本操作單元集成到一塊微米尺度的忍片上，自動(dòng)完成分析全過(guò)程;其是生命科學(xué)、化學(xué)科學(xué) 與信息科學(xué)信號(hào)檢測(cè)和處理方法研究的重要技術(shù)平臺(tái)。近十年來(lái)，微流控忍片技術(shù)在生物、 醫(yī)學(xué)、臨床等領(lǐng)域得到了快速發(fā)展，尤其是核酸的擴(kuò)增及分析等（Zhang Y ,Ozdemir P.Analytica chimica acta,2009,638(2):115-125;Horsman K !,Bienvenue J M, Blasier K R.Journal of forensic sciences,2007,52(4):784-799.)〇 [000引在PCT號(hào)為PCT/US2012/056888中林巧、朱靜等人公開(kāi)了一種核酸在微忍片上的分 離和富集的方法:基于微流控忍片，W反應(yīng)微室中的磁珠為載體實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增及單堿基 延伸反應(yīng)，W檢測(cè)SNPs及分離和富集所需DNA分子。但其微忍片集成微加熱器和溫度傳感 器，W磁珠為反應(yīng)載體，若設(shè)及不同樣本和不同SNP位點(diǎn)檢測(cè)，則需更換磁珠或其表面錯(cuò)定 的引物，運(yùn)樣就造成反應(yīng)過(guò)程中的操作繁瑣，且難W實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的自動(dòng)化處理。
[0009] 綜上所述，現(xiàn)有的實(shí)現(xiàn)SNP位點(diǎn)檢測(cè)方法，存在W下問(wèn)題:樣本處理操作步驟繁瑣， 所需配備儀器設(shè)備較多且昂貴，人工操作帶來(lái)的干擾性大，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，難于實(shí)現(xiàn) 臨床中的即時(shí)檢測(cè)。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0010] 本實(shí)用新型的目的是為了提供一種基于微流控忍片作為反應(yīng)通道和固相載體，并 利用固相PCR擴(kuò)增方法和固相單堿基延伸方法，在功能集成的微流工作站中，進(jìn)行SNP檢測(cè) 樣本前處理，能夠和核酸質(zhì)譜檢測(cè)分析儀直接對(duì)接，檢測(cè)出SNP位點(diǎn)。該工作站基于微流控 忍片通道底面作為固相襯底錯(cuò)定連接反向引物，并進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增反應(yīng)、變性-洗脫反應(yīng)、 一步單堿基延伸反應(yīng)和洗脫-變性反應(yīng):克服現(xiàn)有質(zhì)譜法檢測(cè)SNP樣本處理過(guò)程中需對(duì)樣本 進(jìn)行兩次多循環(huán)PCR擴(kuò)增反應(yīng)、SAP消化處理而導(dǎo)致的成本高、耗時(shí)、費(fèi)力等缺陷;借助集液 路系統(tǒng)、溫控裝置和控制系統(tǒng)等于一體的微流工作站實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的一站式自動(dòng)化操作；同時(shí) 一次性用的忍片避免樣本間的交叉污染，并可根據(jù)不同SNP位點(diǎn)和檢測(cè)需求量，使用不同類 型忍片和不同寡核巧酸序列;在工作站對(duì)樣本進(jìn)行處理后，可直接對(duì)接核酸質(zhì)譜分析儀;該 工作站具有一站式自動(dòng)化、較高通量、低成本、操作方便、快速高效、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
[0011] 在本文的各個(gè)方面，本實(shí)用新型包括可用于對(duì)一個(gè)或多個(gè)樣本，包括全血或DNA樣 本，進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增&單堿基延伸反應(yīng)的微流工作站，其包括微流控忍片、液路系統(tǒng)、溫控 裝置和控制系統(tǒng)等。其中，微流控忍片，提供反應(yīng)通道和固相襯底:所有反應(yīng)在一個(gè)或多個(gè) 串聯(lián)的反應(yīng)腔室或流道完成，通道底面的固相襯底平鋪錯(cuò)定有反向引物，在固相襯底上可 進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸反應(yīng);液路系統(tǒng)，連接微流控忍片，在反應(yīng)過(guò)程中，則用 于在特定時(shí)間和環(huán)境下控制引入特定的反應(yīng)試劑溶液至反應(yīng)腔室，與反向引物或目標(biāo)DNA 片段接觸反應(yīng);溫控裝置，緊貼忍片通道底面，主要為帕爾貼加熱片或其他加熱/冷卻裝置， 在反應(yīng)過(guò)程中為通道底面和反應(yīng)溶液試劑提供特定的溫度環(huán)境;控制系統(tǒng)，禪連液路系統(tǒng) 和溫控裝置，為用戶可操作系統(tǒng):可設(shè)置輸入相關(guān)信息參數(shù)，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑 流速等，并W此對(duì)控制系統(tǒng)和溫控裝置進(jìn)行監(jiān)測(cè)并反饋輸出指令集，使系統(tǒng)反應(yīng)能按照設(shè) 定參數(shù)自動(dòng)完成。
[0012] 在實(shí)施例中，微流控忍片材質(zhì)為金屬、玻璃、娃片和聚合物的一種或組合;微流控 忍片包括進(jìn)出口和通道，其中忍片可為一個(gè)或多個(gè)并行的通道，每個(gè)通道可為一個(gè)或多個(gè) 串行的反應(yīng)腔室或流道，通道底面為平面狀或有陣列凹池，錯(cuò)定連接一種或多種反向引物； 通道底面-反向引物的連接方式為簇基/醒基/環(huán)氧基-氨基、鏈霉親和素-生物素中的至少 一種。
[0013] 在實(shí)施例中，液路系統(tǒng)包括，蠕動(dòng)累、毛細(xì)微管、試劑倉(cāng)和多通道閥口等。蠕動(dòng)累為 試劑溶液提供動(dòng)力;毛細(xì)微管為試劑溶液提供流道，連接試劑倉(cāng)和微流控忍片；多通道閥口 為多種試劑提供選擇性開(kāi)關(guān)。
[0014] 在實(shí)施例中，溫控系統(tǒng)包括，帕爾貼加熱片或其他加熱/冷卻器件、金屬導(dǎo)熱片、散 熱裝置、溫度傳感器和比例-積分-微分(PID，P;ropo;rtiona；L-Integral-De;rivative)控制器 等;為固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸反應(yīng)提供合適的溫度環(huán)境，優(yōu)選的溫控系統(tǒng)具有溫度 精確性高、均一性好、升降溫速度快等特性。
[0015] 在實(shí)施例中，控制系統(tǒng)包括，可視化操作界面、單片機(jī)、控制面板等，可根據(jù)用戶需 求進(jìn)行參數(shù)信息輸入，通過(guò)單片機(jī)對(duì)溫控系統(tǒng)及液路系統(tǒng)進(jìn)行指令輸出，并在操作過(guò)程中 對(duì)各參數(shù)信息進(jìn)行實(shí)施監(jiān)測(cè)并作出反饋。
[0016] 在實(shí)施例中，整個(gè)反應(yīng)包括，固相PCR預(yù)擴(kuò)增，變性-洗脫反應(yīng)，固相單堿基延伸反 應(yīng)，洗脫-變性反應(yīng):在液路系統(tǒng)控制下，引入正向引物、Taq酶/全血直擴(kuò)酶、DNA/血液、dNTP 和PCR擴(kuò)增體系在內(nèi)混合液到反應(yīng)腔室，溫控裝置按照設(shè)定參數(shù)進(jìn)行升降溫，則在忍片通道 底面，即固相襯底發(fā)生固相PCR擴(kuò)增反應(yīng)，包括多次的變性-退火-延伸反應(yīng)，通道底面長(zhǎng)滿 含有SNP位點(diǎn)的雙鏈DNA(dsDNA);溫控裝置升溫或通入堿性溶液，固相襯底錯(cuò)定的dsDNA發(fā) 生變性解鏈，互補(bǔ)單鏈DNA(ssDNA)發(fā)生游離至溶液中，目標(biāo)ssDNA連接錯(cuò)定在忍片通道底 面，后再通入清洗緩沖液對(duì)反應(yīng)腔室進(jìn)行反復(fù)的洗脫，即洗去未反應(yīng)的引物、dNTP、游離的 互補(bǔ)ssDNA等，W達(dá)到對(duì)錯(cuò)定在固相襯底的目標(biāo)ssDNA提純目的；其次液路系統(tǒng)控制引入單 堿基延伸引物、Taq酶、ddNTP和反應(yīng)體系等混合液到反應(yīng)腔室，溫控裝置按照設(shè)定參數(shù)進(jìn)行 升降溫，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，包括多次的退火-延伸反應(yīng)，即單堿基延伸引物和錯(cuò)定在固 相襯底的ssDNA發(fā)生退火互補(bǔ)，在引物下游延伸一個(gè)堿基即終止，產(chǎn)出且錯(cuò)定在固相襯底、 可與目標(biāo)ssDNA互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物;液路系統(tǒng)引入清洗緩沖液，對(duì)反應(yīng)腔室進(jìn)行反復(fù)的清洗， 即洗去未反應(yīng)的延伸引物、ddNTP等，W達(dá)到對(duì)錯(cuò)定在固相襯底的目標(biāo)ssDNA和延伸產(chǎn)物提 純目的，其中清洗緩沖液繼續(xù)被引入流向廢液倉(cāng)，待清洗完畢后，通入去離子水再次進(jìn)行清 洗，后續(xù)啟動(dòng)溫控裝置進(jìn)行加熱處理，目標(biāo)ssDNA和延伸產(chǎn)物發(fā)生變性，延伸產(chǎn)物解鏈游離 至去離子水中，回收去離子水，直接可進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜上機(jī)檢測(cè)。
[0017] 該工作站主要適用于，SNP質(zhì)譜檢測(cè)的樣本前處理。該微流工作站對(duì)接核酸質(zhì)譜分 析儀進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)，能夠大大降低了樣本分析處理時(shí)間、檢測(cè)成本，具有較高通量、低成 本、操作方便、快速高效、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
[0018] 綜上所述，本實(shí)用新型具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 首先，該工作站利用微流控忍片通道底面作為固相襯底錯(cuò)定連接反向引物，并進(jìn) 行固相PCR擴(kuò)增反應(yīng)、變性-洗脫反應(yīng)、一步單堿基延伸反應(yīng)和洗脫-變性反應(yīng):克服現(xiàn)有質(zhì) 譜法檢測(cè)SNP樣本處理過(guò)程中需對(duì)樣本進(jìn)行兩次多循環(huán)PCR擴(kuò)增反應(yīng)、SAP消化處理而導(dǎo)致 的成本高、耗時(shí)、費(fèi)力等缺陷;尤其是SNP檢測(cè)樣本前處理時(shí)間大大降低，在1-2個(gè)小時(shí)內(nèi)即 可完成處理，甚至更短，再進(jìn)行質(zhì)譜上機(jī)獲取SNP檢測(cè)結(jié)果。
[0020] 接著，在微流控忍片中同一個(gè)反應(yīng)通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸，并 對(duì)延伸產(chǎn)物/含有SNP位點(diǎn)的核巧酸進(jìn)行富集、分離、提純，W進(jìn)行基因檢測(cè)和其他用途，并 且可W直接和SNP檢測(cè)相對(duì)接，可W實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化。
[0021] 最后，借助集液路系統(tǒng)、溫控裝置和控制系統(tǒng)等于一體的微流工作站實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的 一站式、自動(dòng)化操作；同時(shí)一次性用的忍片減少樣本間的交叉污染，并可根據(jù)不同SNP位點(diǎn) 和檢測(cè)需求量，使用不同類型忍片;在工作站對(duì)樣本進(jìn)行處理后，可直接對(duì)接核酸質(zhì)譜分析 儀;該工作站具有一站式自動(dòng)化、較高通量、低成本、操作方便、快速高效、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
[0022] 結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和權(quán)利要求書(shū)閱讀W下詳細(xì)描述，本實(shí)用新型的運(yùn)些及其它特征 將變得更為清楚。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是本實(shí)用新型的實(shí)驗(yàn)原理示意圖；
[0024] 圖2是本實(shí)用新型的微流控忍片示意圖；
[0025] 圖3A是本實(shí)用新型的兩層結(jié)構(gòu)的微流控忍片示意圖；
[0026] 圖3B是本實(shí)用新型的S層結(jié)構(gòu)的微流控忍片示意圖；
[0027] 圖3C是本實(shí)用新型的組裝后微流控忍片模型圖；
[0028] 圖4是本實(shí)用新型的微流工作站示意圖；
[0029] 圖5A是本實(shí)用新型的固相襯底(忍片通道底面)平鋪錯(cuò)定反向引物的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0030] 圖5B是本實(shí)用新型的固相PCR擴(kuò)增后，固相襯底錯(cuò)定目標(biāo)dsDNA的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031] 圖5C是本實(shí)用新型的經(jīng)過(guò)變性切青洗后，固相襯底錯(cuò)定目標(biāo)SSDNA的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032] 圖加是本實(shí)用新型的固相單堿基延伸反應(yīng)后，單堿基延伸產(chǎn)物與目標(biāo)ssDNA互補(bǔ) 結(jié)合，并錯(cuò)定在固相襯底的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033] 圖祀是本實(shí)用新型的經(jīng)過(guò)清洗&變性后，單堿基延伸產(chǎn)物脫離固相襯底，在忍片通 道溶液中游離的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034] 圖6是本實(shí)用新型的生成產(chǎn)物進(jìn)行的MALDI-T0F-MS質(zhì)譜檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 名詞釋義
[0036] 在詳細(xì)闡述本實(shí)用新型微流工作站前，為大家能夠更好理解本實(shí)用新型的機(jī)理和 要點(diǎn)，特對(duì)本文中采用的術(shù)語(yǔ)進(jìn)行闡述，其釋義僅限于實(shí)施例中。
[0037] 反向引物/正向引物/單堿基延伸引物
[0038] 在各個(gè)實(shí)施例中，反向引物、正向引物和單堿基延伸引物都是根據(jù)所需檢測(cè)的SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)寡核巧酸序列，并交由相關(guān)引物公司進(jìn)行合成（比如，生工生物工程股份有限公 司，上海）。其中，反向引物的5'端是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的，如氨基、生物素等化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，便于 反向引物錯(cuò)定在固相襯底。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，反向引物擴(kuò)增延伸的ssDNA為目標(biāo)ssDNA，正 向引物連接的ssDNA則為互補(bǔ)ssDNA，正向引物與目標(biāo)SSDNA的游離端能夠發(fā)生雜交結(jié)合;單 堿基延伸引物則適用于單堿基延伸反應(yīng)，能夠與目標(biāo)ssDNA發(fā)生互補(bǔ)雜交，延伸引物的下游 緊靠著SNP位點(diǎn)，在反應(yīng)過(guò)程中，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，延伸引物僅能在 SNP位點(diǎn)處發(fā)生一個(gè)堿基延伸即終止。
[0039] 錯(cuò)定/連接/固定
[0040] 在各個(gè)實(shí)施例中，在微流控忍片反應(yīng)腔室內(nèi)發(fā)生的固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延 伸，所謂"固相"都是通過(guò)反向引物在忍片通道底面進(jìn)行固定實(shí)現(xiàn)。在實(shí)施案例中，提及的 "錯(cuò)定"、"連接"、"固定"，即通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合法，將反向引物通過(guò)生物素-鏈霉親和素或者氨 基-簇基/醒基/環(huán)氧基等之間的共價(jià)鍵結(jié)合，固定連接到通道底面。在反應(yīng)前，反向引物通 過(guò)解育修飾，被錯(cuò)定在固相襯底;反應(yīng)開(kāi)始，在固相襯底上發(fā)生固相PCR擴(kuò)增反應(yīng);在經(jīng)過(guò)變 性處理及洗脫后，目標(biāo)ssDNA固定在固相襯底，后續(xù)進(jìn)行固相單堿基延伸反應(yīng)。
[0041 ]微流控忍片/反應(yīng)腔室/固相襯底
[0042] 在各個(gè)實(shí)施例中，固相PCR擴(kuò)增反應(yīng)和固相單堿基延伸反應(yīng)，都在微流控忍片內(nèi)完 成，具體來(lái)講是在忍片流道的反應(yīng)腔室內(nèi)完成，再進(jìn)一步講是忍片通道的底面，即固相襯底 表面進(jìn)行的反應(yīng);微流控忍片是整個(gè)反應(yīng)的載體，反應(yīng)通道則提供封閉的空間，固相襯底則 是真正反應(yīng)發(fā)生地:反向引物固定在固相襯底，PCR擴(kuò)增生成的目標(biāo)ssDNA固定在固相襯底， 單堿基延伸反應(yīng)亦是在固相襯底的表面發(fā)生。
[0043] 微流控忍片包括忍片通道，忍片通道是由一個(gè)或多個(gè)并行的反應(yīng)通道組成，一個(gè) 反應(yīng)通道可W包含一個(gè)或多個(gè)串行的反應(yīng)腔室或流道。
[0044] 微流控忍片，通常來(lái)講，指的是至少在一個(gè)維度上通道尺寸在毫米、微米級(jí)別，甚 至于更小;忍片通道的體積在微升、納升級(jí)別，甚至于更小。因其"微"特征，微流控忍片具有 樣品消耗少，易于控制特性;另其比表面積較大，分子擴(kuò)散距離短，流體熱容小，具有分析檢 測(cè)速度快、反應(yīng)均一性好等特性。在本實(shí)施案例中，忍片通道寬為50um~4mm，通道高為50皿 ~500皿。忍片通道底面預(yù)先經(jīng)過(guò)簇基/醒基/環(huán)氧基/鏈霉親合素化學(xué)基團(tuán)表面修飾。
[0045] 液路系統(tǒng)
[0046] 在各個(gè)實(shí)施例中，液路系統(tǒng)包括試劑倉(cāng)(包括產(chǎn)物倉(cāng)、廢液倉(cāng)）、注射器、多通道閥 n、微累和微管、壓力/流量傳感器等。其中試劑倉(cāng)為反應(yīng)試劑的存儲(chǔ)設(shè)備，并可根據(jù)不同試 劑設(shè)定不同的存儲(chǔ)環(huán)境溫度;微累則是試劑溶液在忍片通道中流動(dòng)的動(dòng)力引擎，其可通過(guò) 注射器進(jìn)行正壓推動(dòng)或負(fù)壓抽取的方法，來(lái)控制流體的流動(dòng)或靜止;微管則是試劑倉(cāng)、廢液 倉(cāng)連接微流控忍片通道的流路通道，可稱為系統(tǒng)的血管系統(tǒng)；多通道閥口則是控制不同試 劑流入忍片通道，廢液、產(chǎn)物在不同倉(cāng)室的收集，通過(guò)預(yù)設(shè)的參數(shù)和系統(tǒng)的控制，多通道閥 口進(jìn)行自動(dòng)的切換實(shí)現(xiàn)不同試劑在特定時(shí)間的引入或流出。另外，工作站也可裝配壓力傳 感器，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)通道內(nèi)試劑溶液的性質(zhì)，包括試劑泄漏、溶液流量及體積等，在反應(yīng)過(guò) 程中用戶可根據(jù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行維護(hù)，包括原件的更換;尤其在出現(xiàn)報(bào)錯(cuò)故障時(shí)，基于 監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)可對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行故障排除和調(diào)試。
[0047] 溫控裝置
[004引在各個(gè)實(shí)施例中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)及單堿基延伸反應(yīng)，包括dsDNA變性解鏈為ssDNA和 延伸產(chǎn)物的變性游離，需集成在微流控忍片中完成;反應(yīng)過(guò)程設(shè)及:PCR溫度循環(huán)如95 °C (變 性）-55 °C (退火)-72 °C (延伸），且變性反應(yīng)在采用熱變性處理過(guò)程中，溫度亦需在95 °C左 右;運(yùn)就需要微流工作站設(shè)有溫控裝置，且緊貼忍片底面。溫控裝置要具有實(shí)現(xiàn)溫度的精確 控制、良好的溫度均一性及較快的升降溫速度的特性。在實(shí)施例中，溫控裝置可采用帕爾貼 加熱片(Peltier heating plates)或其他加熱/冷卻裝置，設(shè)有：高導(dǎo)熱的金屬/陶瓷平板 和忍片能夠緊密貼合，風(fēng)扇或冷卻裝置能夠?qū)崿F(xiàn)迅速的降溫且防止過(guò)熱現(xiàn)象，溫度傳感器 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)忍片的溫度，PID控制器實(shí)時(shí)控制溫度按照用戶預(yù)設(shè)溫度曲線進(jìn)行加熱/降溫等。
[0049] 控制系統(tǒng)
[0050] 在各個(gè)實(shí)施例中，控制系統(tǒng)為微流工作站的大腦，其禪連液路系統(tǒng)和溫控裝置，在 整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，能夠控制系統(tǒng)各器件按照用戶預(yù)設(shè)參數(shù)自動(dòng)運(yùn)行。其包括電源控制模塊、 信息采集處理模塊、單片機(jī)、輸入/輸入信號(hào)模塊、可視化操作界面等;其中電源控制模塊， 為各部件供電；信息采集處理模塊連接壓力、溫度、流量傳感器，并傳輸至單片機(jī);單片機(jī)為 微型處理器;輸入/輸出信號(hào)模塊可向單片機(jī)輸入信號(hào)或接受單片機(jī)輸出信號(hào)，并輸出至各 部件;可視化操作界面則可顯示實(shí)時(shí)系統(tǒng)參數(shù)，并用戶可通過(guò)其預(yù)設(shè)參數(shù)，包括PCR反應(yīng)溫 度，反應(yīng)時(shí)間，試劑流速等。
[0051] 本實(shí)用新型公開(kāi)了一種基于微流控忍片作為反應(yīng)腔室和固相載體，通過(guò)功能集成 的微流工作站，在微流控忍片中同一個(gè)反應(yīng)通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸，并 對(duì)延伸產(chǎn)物/含有SNP位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)行富集、分離、提純，W進(jìn)行基因檢測(cè)和其他用途。
[0052] 本實(shí)用新型公開(kāi)了一種基于微流控忍片，在一個(gè)反應(yīng)腔室內(nèi)實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增和 固相單堿基延伸反應(yīng)，包括在微流控忍片通道底面提供的固相襯底錯(cuò)定連接的反向引物。 參考圖1，原理方法包括W下步驟:將含有PCR反應(yīng)液、dNTP、DNA模板/全血、正向引物的混合 液引入固相襯底錯(cuò)定連接有反向引物的忍片通道，在經(jīng)過(guò)反復(fù)的變性、退火、延伸后生成含 有反向引物的目標(biāo)ssDNA和含有正向引物的互補(bǔ)ssDNA，兩條ssDNA互補(bǔ)生成dsDNA，并通過(guò) 反向引物固定在通道底面(見(jiàn)110);通過(guò)變性處理，包括化學(xué)方式（如通入堿溶液)或熱處 理，dsDNA發(fā)生變性解鏈，互補(bǔ)ssDNA發(fā)生游離，引入清洗緩沖液對(duì)反應(yīng)通道進(jìn)行反復(fù)的清 洗，洗脫掉游離的互補(bǔ)ssDNA、未反應(yīng)引物和dNTP等，即對(duì)錯(cuò)定在固相襯底的目標(biāo)ssDNA進(jìn)行 提純，其中清洗緩沖液經(jīng)連接忍片出口的毛細(xì)微管和多通道閥口的選擇性開(kāi)啟，被引入至 廢液倉(cāng)(見(jiàn)120);接著，將含有PCR反應(yīng)液、ddNTP、單堿基延伸引物的混合液引入到忍片通 道，在經(jīng)過(guò)反復(fù)的退火-延伸后，單堿基延伸引物雜交到目標(biāo)ssDNA，延伸一個(gè)堿基即終止， 且錯(cuò)定在固相襯底(見(jiàn)130);再次引入清洗緩沖液對(duì)通道進(jìn)行反復(fù)清洗，洗脫掉未反應(yīng)延伸 引物、ddNTP等，即對(duì)錯(cuò)定在固相襯底的ssDNA和延伸產(chǎn)物進(jìn)行提純，再經(jīng)過(guò)去離子水的洗脫 去鹽，最后進(jìn)行加熱變性處理，延伸產(chǎn)物發(fā)生解鏈游離，回收含有游離延伸產(chǎn)物的去離子 水，此時(shí)切換多通道閥口，開(kāi)啟產(chǎn)物倉(cāng)閥口，含有游離延伸產(chǎn)物的去離子水引入至產(chǎn)物倉(cāng) (見(jiàn)140)。反應(yīng)的終溶液即可直接MALDI-T0F-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀） 上機(jī)，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，生成SNP位點(diǎn)報(bào)告。
[0053] 上述的實(shí)驗(yàn)步驟都在微流控忍片中進(jìn)行，又稱為微流控忍片實(shí)驗(yàn)室或忍片實(shí)驗(yàn) 室，其特征主要是其容納流體的有效結(jié)構(gòu)至少在一個(gè)維度上為微米級(jí)尺度。微流控忍片可 由金屬、娃片、玻璃和聚合物中的至少一個(gè)或組合組成。微流控忍片可采用微細(xì)加工技術(shù)進(jìn) 行制造，如模塑法、光刻化學(xué)腐燭方法等，其包括進(jìn)出口、流道和反應(yīng)腔室。根據(jù)不同需求和 實(shí)現(xiàn)功能，可加工成不同形狀和尺寸的忍片:忍片流道可為圓形通過(guò)或方形通道，反應(yīng)腔室 可為單個(gè)腔室或多個(gè)腔室串聯(lián)/并聯(lián)，通道尺寸可為10皿~2mm，甚至更小。
[0054] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，采用固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸反應(yīng)原理，所有 反應(yīng)都集成在同一個(gè)反應(yīng)腔室中實(shí)現(xiàn)，在實(shí)施過(guò)程中能夠?qū)Ψ磻?yīng)試劑實(shí)現(xiàn)精確控制和集成 操作，但并不局限，亦可在兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)腔室。圖2適宜性地描述了本實(shí)用新型采用的微 流控忍片，包括忍片的進(jìn)口 210、出口 220、上蓋230、反應(yīng)通道240和基底250。在忍片的加工 實(shí)施案例中，忍片加工方案可由兩種實(shí)現(xiàn)方案，但并不局限，兩層結(jié)構(gòu)和=層結(jié)構(gòu)。如圖3A 示意的兩層結(jié)構(gòu):上蓋310和基底320,上蓋打孔作為通道的進(jìn)出口，基底進(jìn)行刻蝕挖槽作為 反應(yīng)流道;如圖3B示意的=層結(jié)構(gòu):上蓋330、通道柵欄340和基底350,上蓋打孔作為通道的 進(jìn)出口，柵欄則為反應(yīng)流道間隔；如圖3C示意，通過(guò)對(duì)分層結(jié)構(gòu)進(jìn)行鍵合封裝，形成可進(jìn)出 流通的封閉反應(yīng)腔室，包括進(jìn)出口 360、370和通道380。在實(shí)施例中，微流控忍片具有8個(gè)并 行的反應(yīng)通道，每個(gè)通道僅含有單一的反應(yīng)腔室;但并不局限，亦可為1，2,4，10,16個(gè)并行 的通道，每個(gè)通道又可含有兩個(gè)或兩個(gè)W上的反應(yīng)腔室，如兩個(gè)串行的反應(yīng)腔室，分別進(jìn)行 樣本的PCR預(yù)擴(kuò)增和單堿基延伸反應(yīng)。但單個(gè)通道有嚴(yán)格的封閉性，不會(huì)與其他并行通道有 溶液試劑的流通，避免不同樣本的交叉污染。
[0055] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，微流控忍片采用兩層結(jié)構(gòu)加工方案如圖3A所示：上 蓋為無(wú)堿玻璃材質(zhì)，基底為娃晶圓材質(zhì)，尺寸為L(zhǎng)*W地=7.5cm*2.5cm*0.1mm，與普通玻片大 小相近。首先，對(duì)無(wú)堿玻璃、娃晶圓切割成上述尺寸;然后按照忍片設(shè)計(jì)圖形上分別對(duì)玻璃、 娃片進(jìn)行打孔、刻蝕挖槽，即玻璃上蓋設(shè)置有進(jìn)出口，娃片基底設(shè)有微流通道，通道長(zhǎng)度為 6cm，深度為50um-200um，寬度為0.5mm~3mm，單個(gè)反應(yīng)通道的反應(yīng)體系總體積為5ul~ 20ul;其次，對(duì)忍片上蓋、基底進(jìn)行超聲清洗，除去殘留雜質(zhì)并烘干處理;接著對(duì)固相襯底進(jìn) 行簇基/醒基/環(huán)氧基/鏈霉親合素表面修飾處理;最后利用光刻膠粘合鍵合技術(shù)，在娃片非 通道區(qū)域均勻涂膠，對(duì)準(zhǔn)娃片和玻璃上蓋輕壓后，進(jìn)行紫外光照鍵合，完成微流控忍片的制 作后對(duì)其進(jìn)行真空密封4°C留存。
[0056] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，上述固相襯底表面修飾處理的方法流程，給出娃片 醒基化修飾的具體步驟，包括：
[0057] A、采用過(guò)氧化氨和濃硫酸按照v/v= 1:3的比例進(jìn)行處理，使娃片表面高度徑基 化；
[005引B、采用無(wú)水乙醇對(duì)娃片進(jìn)行反復(fù)清洗后，利用硅烷化試劑APTMS，使娃片表面的徑 基氨基化；
[0059] C、采用無(wú)水乙醇、去離子水對(duì)娃片反復(fù)清洗后，利用戊二醒試劑，使娃片表面的氨 基醒基化。
[0060] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，如示意圖4,微流工作站包括微流控忍片、液路系統(tǒng)、 溫控裝置和控制系統(tǒng)。
[0061] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，微流控忍片410,提供反應(yīng)腔室和固相襯底:所有反 應(yīng)在一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)的反應(yīng)池或流道完成，通道底面的固相襯底平鋪錯(cuò)定反向引物，在固 相襯底上可進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸反應(yīng)。
[0062] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，液路系統(tǒng)，在反應(yīng)過(guò)程中，則用于在特定時(shí)間和環(huán)境 下控制引入特定的反應(yīng)試劑溶液至忍片通道，與PCR擴(kuò)增引物或引物延伸的核巧酸接觸反 應(yīng)，其包括試劑倉(cāng)421、注射器422、多通道閥口423和微管424等。其中，通過(guò)多通道閥口連接 忍片進(jìn)口的試劑倉(cāng)用于存儲(chǔ)反應(yīng)試劑包括血液/DNA模板、PCR擴(kuò)增試劑、單堿基延伸試劑、 緩沖清洗緩沖液和去離子水，連接出口的試劑倉(cāng)用于收集廢液和生成產(chǎn)物；多通道閥口則 通過(guò)切換閥口引入不同試劑通入忍片通道，引出不同溶液流出產(chǎn)物倉(cāng)/廢液倉(cāng);注射器和微 累，微累不在圖中顯示，其在反應(yīng)過(guò)程中為試劑溶液的流動(dòng)提供動(dòng)力;微管，連通忍片進(jìn)出 口和試劑倉(cāng)，提供流通管路。微累和多通道閥口均禪合連接控制系統(tǒng)。
[0063] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，溫控裝置，緊貼忍片通道底面，主要為帕爾貼加熱片 或其他加熱/冷卻裝置，在反應(yīng)過(guò)程中為通道底面和反應(yīng)溶液試劑提供特定的溫度環(huán)境，其 包括帕爾貼加熱片431(I^ltier heating plates)、散熱片432和風(fēng)扇433等。溫控裝置，能 夠?qū)崿F(xiàn)溫度的精確控制和較快的升降溫速度，保證PCR反應(yīng)和單堿基延伸反應(yīng)高效準(zhǔn)確完 成。加熱片、風(fēng)扇和溫度傳感器等都禪連控制系統(tǒng)，溫度傳感器在圖中未顯示；另為保證溫 控裝置按照預(yù)設(shè)參數(shù)精確運(yùn)行，采用PID控制器對(duì)溫控裝置進(jìn)行控制實(shí)現(xiàn)。
[0064] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，控制系統(tǒng)，禪連液路系統(tǒng)和溫控裝置，為用戶可操作 系統(tǒng):可預(yù)設(shè)參數(shù)，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑流速等，反應(yīng)開(kāi)始自動(dòng)控制各元件按照設(shè) 定參數(shù)運(yùn)行，且在反應(yīng)過(guò)程中，禪連的溫度傳感器、流量傳感器等實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)， 并自行作出反饋調(diào)整各元件參數(shù)，W保證系統(tǒng)反應(yīng)的準(zhǔn)確完成?？刂葡到y(tǒng)包括電源控制模 塊、信息采集處理模塊、單片機(jī)、輸入/輸入信號(hào)模塊、可視化操作界面等，在圖中并無(wú)顯示。
[0065] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，微流工作站的目標(biāo)功能是對(duì)樣本，包括全血或DNA模 板，進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)的樣本前處理，即處理原始樣本，生成可直接用于質(zhì)譜檢測(cè)的單堿基 延伸產(chǎn)物。在實(shí)施例中，給出DNA樣本實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增及單堿基延伸反應(yīng)的具體操作流程， 包括試劑選取和反應(yīng)條件。
[0066] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，將微流控忍片加載至微流控工作站適配固定位置， 并進(jìn)行預(yù)處理操作，包括微管和忍片的連接，試劑準(zhǔn)備，反應(yīng)程序參數(shù)預(yù)設(shè)等。至此，可啟動(dòng) 控制系統(tǒng)開(kāi)始按鈕，開(kāi)始反應(yīng)。整個(gè)反應(yīng)包括，引物固相錯(cuò)定修飾，固相PCR預(yù)擴(kuò)增，變性-洗 脫操作，固相單堿基延伸反應(yīng)，洗脫-變性操作;反應(yīng)過(guò)程中，根據(jù)用戶設(shè)置參數(shù)，系統(tǒng)自動(dòng) 控制完成。
[0067] 在本實(shí)用新型的實(shí)施案例中，反應(yīng)前首先需根據(jù)SNP檢測(cè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)反向、正向引 物和單堿基延伸引物，其中反向、正向引物為PCR擴(kuò)增引物，單堿基延伸引物能與含有反向 引物的目標(biāo)ssDNA雜交結(jié)合，如DNA模板選用含有一個(gè)單堿基延伸突變的序列：
[006引 rslll033318,突變位點(diǎn)為T(mén)〉A(chǔ)，序列為
[0069] (GCAATACTGGACAACCCACATCATTTTACTATTGCCAAAGCTCCAAATGTATAATTCAGAAAACCAGAACCTTACC ACCCGC [A/T] GTGATCTCACTCCAACAACGTCCAGGAA);貝!]設(shè)計(jì)的反向引 物為： (ACGTTGGATGT TTCCTGGACGTTGTTGGAG )，設(shè)計(jì)的正向引物為： (ACGTTGGATGTGCAATACTGGACAACCCAC) ,ACGTTGGATGT為設(shè)計(jì)時(shí)加上的接頭，單堿基延伸引物 為：
[0070] (46440：7^0：4〔0：6(：，]\1.胖=5084.290曰），且反向引物合成時(shí)對(duì)其5'端進(jìn)行〔6氨基 修飾；引物的合成及修飾均由上海生工生物工程股份有限公司合成。其中，ddNTP采購(gòu)為美 國(guó) Sequenom公司，其分子量分別是：ddATP = 271.2Da，ddTTP = 327 . IDa，ddCTP = 247.2Da， ddGTP = 287.2Da;若發(fā)生突變，延伸產(chǎn)物為(AGAACCTTACCACCCGCA，M. W=5356.5Da);不發(fā)生 突變，則為(AGAACCTTACCACCCGCT，M.W=5412.3Da)。
[007U 首先，通入清洗緩沖液^(5111]\1化13-肥1，0.5111]\1抓14，1麗3(：1，311(10.01%￥八 Tween-20，PH=7.5)對(duì)忍片通道進(jìn)行潤(rùn)洗，后引入含有5'端氨基修飾的反向引物，氨基與醒 基發(fā)生縮合反應(yīng)，即反向引物修飾錯(cuò)定在忍片通道的固相襯底，再次通入清洗緩沖液，洗脫 掉游離的反向引物，如圖5A所示固相襯底501錯(cuò)定連接有反向引物502;后續(xù)控制系統(tǒng)按照 預(yù)輸指令，液路系統(tǒng)響應(yīng)啟動(dòng)，將正向引物503、DNA模板504在內(nèi)的混合試劑引入至反應(yīng)腔 室中，混合液包括hq酶0 . Iul (5U/ul)、10 X化9緩沖液(Mg2+)化1、dNTP混合液（各2.5mM) 0.8ul、DNA模板Iul、正向引物0.6ul和去離子水5.加1; PCR擴(kuò)增循環(huán)溫度見(jiàn)下表：
[0072] 表1.固巧PCR循環(huán)擴(kuò)蠟參數(shù)
[0073]
[0074] 其次，啟動(dòng)溫控裝置，按照設(shè)定參數(shù)進(jìn)行升溫至95 °C，DNA模板發(fā)生變性解鏈;溫控 裝置進(jìn)行降溫至55°C，則含有正向引物的互補(bǔ)ssDNA與錯(cuò)定在固相襯底的反向引物發(fā)生退 火雜交，同時(shí)來(lái)自于樣本的目標(biāo)ssDNA與游離的正向引物發(fā)生退火雜交;溫控裝置升溫至72 °C，引物在聚合酶作用下發(fā)生延伸反應(yīng)生成dsDNA505，并錯(cuò)定在固相襯底;溫控裝置再次升 溫至95°C，dsDNA發(fā)生變性解鏈成游離的互補(bǔ)ssDNA和固定的目標(biāo)ssDNA;降溫至55°C，則互 補(bǔ)ssDNA又與固定的反向引物發(fā)生退火雜交。重復(fù)30個(gè)循環(huán)(變性、退火和延伸)可實(shí)現(xiàn)目標(biāo) dsDNA的擴(kuò)增，并錯(cuò)定連接在忍片通道底面，如圖5B所示dsDNA通過(guò)反向引物錯(cuò)定在忍片通 道底面。
[0075] 然后，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通入堿性溶液處理(堿性溶液用清洗緩沖液配制， 0.1 mM化OH)或通入清洗緩沖液后加熱至95°C、Imin，固相襯底錯(cuò)定的dsDNA發(fā)生變性解鏈， 含有正向引物的互補(bǔ)ssDNA發(fā)生游離，含有反向引物的目標(biāo)ssDNA 506連接錯(cuò)定在忍片通道 底面，如圖5C所示;接著，通入清洗緩沖液對(duì)反應(yīng)腔室進(jìn)行沖洗，即可沖去未反應(yīng)的引物、 dNTP和游離的互補(bǔ)ssDNA等，W達(dá)到對(duì)錯(cuò)定在固相襯底的目標(biāo)ssDNA提純目的，其中連接忍 片出口的毛細(xì)微管在多通道閥口的廢液閥口開(kāi)啟下，清洗緩沖液被引入至廢液倉(cāng)。
[0076] 接著，液路系統(tǒng)控制引入單堿基延伸引物507和ddNTP 508等混合試劑到忍片通 道，混合液包括hq酶0.1 ul (抓All)、10 X hq緩沖液(Mg2+)2ul、ddNTP混合液0.4ul、單堿基 延伸引物工作液Iul和去離子水6.5ul;溫控裝置按照設(shè)定參數(shù)進(jìn)行升降溫，進(jìn)行單堿基延 伸反應(yīng)，包括多次的退火-延伸反應(yīng)，即單堿基延伸引物和錯(cuò)定在固相襯底的目標(biāo)ssDNA發(fā) 生退火互補(bǔ)，并延伸一個(gè)堿基，得到和錯(cuò)定在固相襯底目標(biāo)ssDNA互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物，如圖加 所示;單堿基延伸反應(yīng)循環(huán)溫度見(jiàn)下表：
[0077]表2.單堿基延伸反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增參數(shù) [007引
[0079] 最后，液路系統(tǒng)引入清洗緩沖液，對(duì)反應(yīng)通道進(jìn)行反復(fù)的清洗，即洗去未反應(yīng)的延 伸引物、ddNTP等，W達(dá)到對(duì)錯(cuò)定在固相襯底的目標(biāo)SSDNA和延伸產(chǎn)物提純目的，其中廢液依 然流向廢液倉(cāng);通入去離子水進(jìn)行二次清洗;啟動(dòng)溫控裝置升溫至95 °C、Imin，對(duì)SSDNA和延 伸產(chǎn)物進(jìn)行變性操作處理，如圖5E所示，延伸產(chǎn)物509發(fā)生解鏈游離，切換多通道閥口的產(chǎn) 物倉(cāng)，將含有游離延伸產(chǎn)物的溶液流至產(chǎn)物倉(cāng)，即可轉(zhuǎn)移產(chǎn)物至MALDI-T0F-MS進(jìn)行上機(jī)質(zhì) 譜，獲取SNP位點(diǎn)檢測(cè)圖。如圖6所示，對(duì)突變純合子的樣本，進(jìn)行上述反應(yīng)后并質(zhì)樸檢測(cè)，根 據(jù)分子量定量分析，圖中的S個(gè)虛線分別標(biāo)記為原始延伸引物(M.W=508姐a)、突變延伸產(chǎn) 物(M.W=5356化）、野生延伸產(chǎn)物的分子量(M.W=5412化），而在圖中在延伸引物、突變延伸 產(chǎn)物處存在有質(zhì)譜峰，即可判定延伸的堿基為ddATP，檢測(cè)出SNP位點(diǎn)發(fā)生突變，由堿基T突 變?yōu)锳。
[0080] W上所述僅為本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉，在不脫離本實(shí)用 新型的精神和范圍的情況下，可W對(duì)運(yùn)些特征和實(shí)施例進(jìn)行各種改變或等同替換。另外，在 本實(shí)用新型的教導(dǎo)下，可W對(duì)運(yùn)些特征和實(shí)施例進(jìn)行修改W適應(yīng)具體的情況及材料而不會(huì) 脫離本實(shí)用新型的精神和范圍。因此，本實(shí)用新型不受此處所公開(kāi)的具體實(shí)施例的限制，所 有落入本申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍內(nèi)的實(shí)施例都屬于本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種進(jìn)行固相PCR反應(yīng)的自動(dòng)化微流工作站，所述工作站包括： 至少一個(gè)微流控芯片，芯片含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)通道，每一反應(yīng)通道包括進(jìn)出 口、一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)或并聯(lián)的反應(yīng)腔室和/或流道，反應(yīng)腔室底面錨定有寡核苷酸序列，以 進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增和/或固相單堿基延伸反應(yīng)； 液路系統(tǒng)，以控制引入不同反應(yīng)試劑溶液流至對(duì)應(yīng)的反應(yīng)腔室； 溫控裝置，以控制調(diào)節(jié)所述反應(yīng)腔室內(nèi)的溫度； 控制系統(tǒng)，其連接上述液路系統(tǒng)和溫控裝置，用于控制液路系統(tǒng)和溫控裝置，在微流控 芯片的反應(yīng)腔室內(nèi)進(jìn)行的固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸反應(yīng)，并包括變性-洗脫反應(yīng)和洗 脫-變性反應(yīng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上蓋、反應(yīng)通 道和基底，上蓋設(shè)有反應(yīng)通道的進(jìn)出口，基底進(jìn)行刻蝕挖槽成反應(yīng)通道，通道長(zhǎng)度為2-8cm， 深度為50um-200um，寬度為0 · 5mm~3mm，單個(gè)反應(yīng)通道的反應(yīng)體系總體積為5ul~20ul 〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上蓋、通道柵 欄和基底，上蓋設(shè)有反應(yīng)通道的進(jìn)出口，上蓋-通道柵欄-基底的"三明治結(jié)構(gòu)"形成多個(gè)獨(dú) 立的反應(yīng)通道。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微流工作站，其特征在于，通過(guò)對(duì)分層結(jié)構(gòu)的鍵合封裝，形 成可進(jìn)出流通的封閉反應(yīng)腔室。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片材質(zhì)為包括金屬、 玻璃、硅片和聚合物的至少一種或組合組成，其容納流體的有效結(jié)構(gòu)至少在一個(gè)維度上為 微米級(jí)尺度，微流控芯片處于多個(gè)的狀態(tài)下，各個(gè)微流控芯片分別獨(dú)立與控制系統(tǒng)連接。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片的固相襯底為平面 結(jié)構(gòu)，可錨定高密度的一種或多種寡核苷酸序列，所述固相襯底平鋪錨定寡核苷酸序列是 通過(guò)羧基/醛基/環(huán)氧基-氨基、鏈霉親和素-生物素在內(nèi)的多種化學(xué)修飾中的至少一種完 成。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的微流工作站，其特征在于，所述錨定在芯片通道底面的寡核苷 酸序列是PCR擴(kuò)增所需的反向引物。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述的固相單堿基延伸反應(yīng)包括發(fā) 生一個(gè)或多個(gè)退火-延伸反應(yīng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述溫控裝置設(shè)置在芯片反應(yīng)腔室 的底面。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述液路系統(tǒng)包括設(shè)置各種所述 試劑的容器、與反應(yīng)通道相連的通路及控制閥，所述試劑包括用于PCR擴(kuò)增的正向引物/單 堿基延伸引物、脫氧核糖核苷三磷酸/雙脫氧核糖核苷三磷酸、反應(yīng)酶、反應(yīng)緩沖液和清洗 緩沖液在內(nèi)，控制系統(tǒng)與此控制閥相連接，以控制閥門(mén)的開(kāi)關(guān)或通路流量的大小。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述控制系統(tǒng)包括電力提供裝置、 控制器、采集器、顯示裝置和/或輸出裝置，電力提供裝置給微流工作站提供電力，控制器連 接采集器，顯示裝置和/或輸出裝置，并連接液路系統(tǒng)和溫控裝置。
【文檔編號(hào)】C12M1/38GK205443311SQ201620088285
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年1月28日
【發(fā)明人】李鵬鑫, 張桐, 張一桐, 張祥林, 胡秋萍, 于丹, 陳勇
【申請(qǐng)人】上海美吉逾華生物醫(yī)藥科技有限公司