一種提高γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)量的方法
【專利摘要】一種提高γ?谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)量的方法，主要是將GGT基因3′末端終止子后添加形式為AAA,AAAAAA,TTTAAA,AAATTTAAA,TTTAAATTTAAA,TTTAAAAAAAAA的poly(A/T)尾巴，提高其在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)量，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明在于通過在GGT基因3′末端終止子后添加形式為TTTAAA的poly(A/T)尾巴，發(fā)現(xiàn)與不添加poly(A/T)尾巴的對(duì)照菌相比，GGT在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)量提高了2倍多，這說明添加形式為TTTAAA的poly(A/T)尾巴有利于提高GGT在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)量。
【專利說明】
一種提高γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] -種提高γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)量的方法，主要是通過基因工程技術(shù)提高γ -谷氨 酰轉(zhuǎn)肽酶的表達(dá)量，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] L-茶氨酸，化學(xué)名稱為Ν-乙基-γ-L-谷氨酰胺，是一種幾乎只存在于茶類植物中 的游離氨基酸，決定茶葉的風(fēng)味和品質(zhì)。茶氨酸具有多種重要的生理功能:放松減壓作用； 降血壓作用;抑制咖啡因引起的興奮反應(yīng);提高學(xué)習(xí)能力;抗腫瘤;控制體重等。早在1985年 美國食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)證L-茶氨酸為一般公認(rèn)安全的物質(zhì)(GRAS)，在食品中 使用沒有特定用量限制。鑒于茶氨酸上述諸多生理功效及其絕對(duì)安全性，其作為一種食品 組分及飲品添加劑的需求量日益增加。進(jìn)入21世紀(jì)，酶法轉(zhuǎn)化合成以其優(yōu)越性日益受到青 睞，因此研究人員重心也集中于酶法合成L-茶氨酸，可用于合成茶氨酸的酶包括谷氨酰胺 合成酶，谷氨酰胺酶和γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)。谷氨酰胺合成酶受ATP供應(yīng)限制，谷氨酰胺 酶產(chǎn)物對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率低，γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶脫穎而出。
[0003] γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶分布廣泛，負(fù)責(zé)催化谷胱甘肽及其類似物的γ-谷氨酰鍵的斷 裂，并將生成的γ-谷氨酰基團(tuán)轉(zhuǎn)移給水(此時(shí)即為水解反應(yīng))或者其他氨基酸(轉(zhuǎn)肽反應(yīng)）。 利用GGT的轉(zhuǎn)肽功能，選定L-谷氨酰胺和乙胺作為供體和受體時(shí)，即可實(shí)現(xiàn)酶法生成L-茶氨 酸。
[0004] 酶法催化中生產(chǎn)菌株的選育至關(guān)重要。目前γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的表達(dá)多選用大腸 桿菌體系，江南大學(xué)吳敬教授課題組利用大腸桿菌的分泌型質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)了 GGT蛋白的胞外分 泌，但是該大腸桿菌宿主表達(dá)體系仍存在一定的安全隱患。
【申請(qǐng)人】前期成功在B. subtil is 中實(shí)現(xiàn)了該蛋白的過量表達(dá)，胞外獲得可觀的蛋白酶含量。上述研究為我們實(shí)驗(yàn)提出了要 求和思路:生產(chǎn)菌株的絕對(duì)安全性和目的蛋白能否在宿主菌中實(shí)現(xiàn)胞外分泌。鈍齒棒桿菌 SDNN403(保藏編號(hào)CGMCC0890，專利號(hào)為:ZL 03112896.3)是經(jīng)過多級(jí)誘變篩選獲得、適用 于多種氨基酸高產(chǎn)的安全菌株，具備高效表達(dá)外源蛋白的潛力。
【申請(qǐng)人】前期利用PXMJ19質(zhì) 粒，實(shí)現(xiàn)了B · subt i 1 i s 168來源的GGT基因在C · crenatum SDNN403的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)GGT蛋 白的信號(hào)肽片段可以在鈍齒棒桿菌中被識(shí)別，從而引導(dǎo)該目的蛋白分泌到胞外，胞外GGT活 力為10.31U/mL，并申請(qǐng)了相關(guān)專利（申請(qǐng)?zhí)?01610454875.8)，但是，相比于工業(yè)化生產(chǎn)要 求，該酶的表達(dá)量偏低，會(huì)增加上游生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于基于前期申請(qǐng)的專利（申請(qǐng)?zhí)?01610454875.8)相關(guān)內(nèi)容為基 礎(chǔ)，提供一種進(jìn)一步提高GGT在鈍齒棒桿菌中表達(dá)量的方法，具體內(nèi)容是將GGT基因3'末端 終止子后添加形式為 AAA，AAAAAA，TTTAAA，AAATTTAAA，TTTAAATTTAAA，TTTAAAAAAAAA 的 poly (A/T)尾巴，提高其在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)量，為鈍齒棒桿菌作為宿主表達(dá)外源蛋白及茶氨 酸的生產(chǎn)均提供了有益的指導(dǎo)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0007] 1 ·重組質(zhì)粒 pXMJ19_tacM_ggtM 的構(gòu)建
[0015]以
【申請(qǐng)人】前期申請(qǐng)的專利（申請(qǐng)?zhí)?01610454875 · 8)所公開的pXMJ19-tacM-ggt載 體為模板，選用PrimerSTAR HS高保真酶，利用引物ggt-F和引物ggt-Rl-6中一條為引物分 別對(duì)應(yīng)擴(kuò)增出6條目標(biāo)基因片段ggtM(l-6)，分別將膠回收獲得的上述6條DNA片段ggtMl-6 與
【申請(qǐng)人】前期申請(qǐng)的專利（申請(qǐng)?zhí)?01610454875.8)所公開的?乂1〇19-丨&(^載體連接，獲得6 個(gè)重組質(zhì)粒？乂]\1119吋3〇]\1飛8七]\1(1-6)〇
[0016] 2突變GGT在鈍齒棒桿菌SDNN403中的表達(dá)
[0017] 將構(gòu)建好的6個(gè)重組質(zhì)粒pXMJ19-tacM-ggtM(l_6)分別單個(gè)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至 C.glutamicum SDNN403感受態(tài)中，在氯霉素抗性平板上篩選陽性重組子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶 切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確即為構(gòu)建成功的重組菌C. glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM_ggtM( 1-6)。上述菌株分別接種至含有10yg/mL氯霉素的LBG液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)過夜，次日以 10 %的接種量轉(zhuǎn)接至25mL的鈍齒發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加 IPTG終濃度為0.8mM進(jìn)行誘導(dǎo)表 達(dá)，完整培養(yǎng)周期為96h。培養(yǎng)結(jié)束后8000rpm離心20min，收集上清液即為胞外酶液，4°C保 存。細(xì)胞沉淀用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌3次，重懸浮于該緩沖液中，超聲波破碎儀破 碎細(xì)胞。lOOOOrpm離心30min去除沉淀細(xì)胞碎片，上清即為胞內(nèi)蛋白液，置于4°C保存。均用 于后續(xù)GGT的酶活測(cè)定。
[0018] 4 GGI1酶活力的測(cè)定
[0019] GGT轉(zhuǎn)肽酶活的測(cè)定原理是利用酶的轉(zhuǎn)肽功能，催化底物γ -L-谷氨酰對(duì)硝基苯胺 (γ-GpNA)的γ -谷氨?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到受體雙甘二肽，隨之生成的對(duì)硝基苯胺在410nm處有特 殊吸收，通過測(cè)定該反應(yīng)生成的對(duì)硝基苯胺的濃度來衡量GGI1酶活力。
[0020] lmL反應(yīng)體系中包含：50mmol/L硼酸-NaOH緩沖液(pH 10·0)，2·5mmol/L γ -GpNA， 60mmol/L雙甘二肽，20yL適當(dāng)稀釋的酶液。37°C反應(yīng)10min后，添加125μΙ^度為3.5mol/L的 醋酸終止反應(yīng)。以不添加雙甘二肽受體的反應(yīng)液作為對(duì)照，其他處理均和實(shí)驗(yàn)組相同， 410nm處測(cè)定吸光度差值。酶活單位定義為：lmin內(nèi)經(jīng)由轉(zhuǎn)肽反應(yīng)催化生成Ιμπιο?對(duì)硝基苯 胺(p-Nitrophenylamine)所需酶量即為一個(gè)酶活單位(U)。
[0021] 本發(fā)明的有益成果：本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了 B. subtilis 168來源的GGT基因在 C.glutamicum SDNN403的高效表達(dá)。C.glutamicum SDNN403是一株適合于氨基酸生產(chǎn)的安 全菌株，其細(xì)胞培養(yǎng)可以達(dá)到的高密度水平也使其具備作為宿主菌表達(dá)外源蛋白的潛能， 因此該表達(dá)系統(tǒng)不但可以滿足工業(yè)生產(chǎn)的安全性，而且可以滿足工業(yè)生產(chǎn)的強(qiáng)度。
【附圖說明】
[0022] 無
[0023] 具體實(shí)施方法
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0025] 實(shí)施例1:重組質(zhì)粒pXMJ19-tacM_ggtM的構(gòu)建
[0033]以
【申請(qǐng)人】前期申請(qǐng)的專利（申請(qǐng)?zhí)?01610454875 · 8)所公開的pXMJ19-tacM-ggt載 體為模板，選用PrimerSTAR HS高保真酶，利用引物ggt-F和引物ggt-Rl-6中一條為引物分 別對(duì)應(yīng)擴(kuò)增出6條目標(biāo)基因片段ggtM(l-6)，分別將膠回收獲得的上述6條DNA片段ggtMl-6 與
【申請(qǐng)人】前期申請(qǐng)的專利（申請(qǐng)?zhí)?01610454875.8)所公開的?乂1〇19-丨 &(^載體連接，獲得6 個(gè)重組質(zhì)粒？乂]\1119吋3〇]\1飛8七]\1(1-6)〇
[0034] 實(shí)施例2:C.glutamicum SDNN403重組菌的構(gòu)建及GGT蛋白表達(dá)情況分析
[0035] 將構(gòu)建好的6個(gè)重組質(zhì)粒pXMJ19-tacM-ggtM(l_6)分別單個(gè)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至 C.glutamicum SDNN403感受態(tài)中，在氯霉素抗性平板上篩選陽性重組子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶 切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確即為構(gòu)建成功的重組菌C. glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM_ggtM( 1-6)。上述菌株分別接種至含有10yg/mL氯霉素的LBG液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)過夜，次日以 10 %的接種量轉(zhuǎn)接至25mL的鈍齒發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加 IPTG終濃度為0.8mM進(jìn)行誘導(dǎo)表 達(dá)，完整培養(yǎng)周期為96h。培養(yǎng)結(jié)束后8000rpm離心20min，收集上清液即為胞外酶液，4°C保 存。細(xì)胞沉淀用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌3次，重懸浮于該緩沖液中，超聲波破碎儀破 碎細(xì)胞。lOOOOrpm離心30min去除沉淀細(xì)胞碎片，上清即為胞內(nèi)蛋白液，置于4°C保存。均用 于后續(xù)GGT的酶活測(cè)定。
[0036]實(shí)施例3:重組菌株GGI1酶活力測(cè)定
[0037]重組菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_tacM-ggtM( 1-6)和對(duì)照菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt分別單獨(dú)在精氨酸高產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)束后，分別測(cè)定胞內(nèi)破 碎上清液及發(fā)酵上清中GGT的酶活力，結(jié)果如表1所示，重組菌株R1，R4，R6的GGI 1酶活力和對(duì) 照菌相對(duì)，菌株R2未能檢測(cè)到GGT酶活力，R5酶活力僅為對(duì)照菌的1/10。而菌株R3的GGT活力 最高，為對(duì)照菌的2倍，說明在GGT基因3'末端終止子后添加形式為TTTAAA的poly(A/T)尾巴 有利于提高GGT在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)量和產(chǎn)量。
[0038] 表1重組菌GGI1酶活測(cè)定
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)量的方法，其特征是，在GGT基因3'末端終止子后添 加 poly(A/T)尾巴，并將帶有poly(A/T)尾巴的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因?qū)胛⑸矬w內(nèi)進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。2. 權(quán)利要求1所述的poly(A/T)尾巴堿基序列，優(yōu)選但不限于ΤΤΤΑΑΑ。3. -種提高γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在重組鈍齒棒桿菌表達(dá)量的方法，其特征是:利用權(quán)利要 求1所述方法，將γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因3'末端終止子后添加形式為ΤΤΤΑΑΑ的poly(A/T)尾 巴，隨后將帶有形式為TTTAAA的poly(A/T)尾巴的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因克隆至鈍齒棒桿菌 中，通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。4. 利用權(quán)利要求1或權(quán)利要求3所述方法獲得γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶用于茶氨酸的生產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK105969748SQ201610576989
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】饒志明, 楊套偉, 徐美娟, 張顯, 和斐
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)