一種蛋白質(zhì)固定化的新方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)固定化的新方法，采用的是氰基硼氫化納還原法，包括步驟11：制備環(huán)氧化瓊脂糖；步驟12：對(duì)步驟1中得到的環(huán)氧化瓊脂糖進(jìn)行氨化處理；步驟13：制備甲酰載體；步驟14：將蛋白質(zhì)與甲酰載體進(jìn)行偶聯(lián)。本發(fā)明中對(duì)蛋白質(zhì)的固定化方法不需要在堿性條件下進(jìn)行，條件溫和，對(duì)蛋白質(zhì)天然屬性的影響較小或沒有影響。
【專利說明】
一種蛋白質(zhì)固定化的新方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是指一種蛋白質(zhì)固定化的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)的固定化有許多種方法，目前最常用的是用溴化氰活化瓊脂糖，然后將蛋白質(zhì)接到活化的瓊脂糖上，這種方法需要在堿性條件下進(jìn)行，有事會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象及性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，因而該方法在使用上受到了限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種不需要在堿性條件下進(jìn)行的蛋白質(zhì)固定化的新方法，使蛋白質(zhì)固定化的條件更加溫和，降低對(duì)蛋白質(zhì)天然屬性的影響。
[0004]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):采用的是氰基硼氫化納還原法，包括以下步驟: 步驟11:制備環(huán)氧化瓊脂糖；
步驟12:對(duì)步驟I中得到的環(huán)氧化瓊脂糖進(jìn)行氨化處理；
步驟13:制備甲酰載體；
步驟14:將蛋白質(zhì)與甲酰載體進(jìn)行偶聯(lián)。
[0005]進(jìn)一步地，所述步驟11中制備環(huán)氧化瓊脂糖步驟進(jìn)一步包括步驟111:
步驟111:將洗凈抽干后的瓊脂糖懸浮于重蒸水中，依次混入濃度為2M的氫氧化鈉和濃度為5%的環(huán)氧氯丙烷，將這一懸浮液于40°C振蕩反應(yīng)2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入砂芯漏斗，用大量的水抽濾洗凈；
或步驟111為:將吸干的瓊脂糖在砂芯上用水洗凈并吸干，然后分別混入二甘油醚及濃度為2mg/ml的硼氫化鈉和濃度為0.6M的氫氧化鈉溶液，將這一懸浮液于25°C振蕩保溫反應(yīng)8小時(shí)后轉(zhuǎn)移到砂芯漏斗，用大量的水抽濾洗膠。
[0006]進(jìn)一步地，所述步驟14中蛋白質(zhì)和甲酰載體的偶聯(lián)步驟進(jìn)一步包括:
步驟141:將蛋白質(zhì)與氰基硼氫化鈉溶解于PH為6.4的濃度為0.1M的醋酸緩沖液中，所述醋酸緩沖液中還包括ImM的氯化錳、ImM的氯化鎂、ImM的氯化鈣以及0.2M的α-甲基甘露糖苷；
步驟142:將步驟141中所得到的溶液與步驟13中制得的甲酰載體混合，置4 °C攪動(dòng)反應(yīng)過夜；
步驟143:將步驟142中所得到的凝膠懸于1%的戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液中還包含氰基硼氫化鈉以及0.2M的專一的糖，再置4°C攪動(dòng)反應(yīng)過夜。
[0007]步驟144:將凝膠置于PH為7.4濃度為IM的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中，所述三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中還包含有氰基硼氫化鈉，室溫反應(yīng)I小時(shí)；
步驟145:反應(yīng)完成后，將凝膠轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗上，用重蒸水洗去未反應(yīng)的氰基硼氫化鈉；
步驟146:分別用2M的氯化鈉、PH為4.0的濃度為0.2M的醋酸緩沖液、以及PH為9.0的濃度為0.1的碳酸緩沖液洗凝膠，用重蒸水洗至中性后，置于PH為7.4的濃度為0.2M的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中，加入防腐劑疊氮化納，置4°C冰箱中保存。
[0008]進(jìn)一步地，所述步驟141中的醋酸緩沖液也可用磷酸緩沖液。
[0009]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
本發(fā)明中對(duì)蛋白質(zhì)的固定化方法不需要在堿性條件下進(jìn)行，條件溫和，對(duì)蛋白質(zhì)天然屬性的影響較小或沒有影響。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0011]實(shí)施例:
本實(shí)施例中采用的是伴刀豆球蛋白，按如下步驟進(jìn)行:
步驟11:制備環(huán)氧化瓊脂糖
步驟111:將20克洗凈后抽干的瓊脂糖懸浮于30毫升的重蒸水中，依次混入13毫升的2M氫氧化鈉和3毫升的環(huán)氧氯丙烷，各物質(zhì)的終濃度分別為:30%(v/v)瓊脂糖凝膠，5%環(huán)氧氯丙烷，0.4M氫氧化鈉，將這一懸液與40 °(:振蕩反應(yīng)2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入砂芯漏斗，用大量的水抽濾洗凈:;
或步驟111為:將I克吸干的瓊脂糖在砂芯上用水洗凈并吸干，然后分別混入I毫升二甘油醚及I毫升含2毫克每毫升硼氫化鈉的0.6M氫氧化鈉溶液，將這一懸液與25°C正當(dāng)保溫反應(yīng)8小時(shí)后轉(zhuǎn)移到砂芯漏斗，用大量的水抽濾洗膠(此反應(yīng)中溫度較為重要，過高或過低都影響反應(yīng)效率)。
[0012]步驟12:對(duì)步驟I中得到的環(huán)氧化瓊脂糖進(jìn)行氨化處理
環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用大量水洗凈后將其懸于1.5倍體積的濃氨水中，將這一懸液在40°C振蕩溫育1.5小時(shí)，反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)入砂芯漏斗中，用重蒸水洗凈。
[0013]步驟13:制備甲酰載體
于I克想吸干的氨化瓊脂糖中加入I毫升25%的戊二醛溶液和82毫克氰基硼氫化鈉，將此混合物在40°C溫育振蕩2小時(shí)，再用重蒸水洗凈。
[0014]步驟14:將蛋白質(zhì)與甲酰載體進(jìn)行偶聯(lián)
步驟141:將10?50毫克的伴刀豆球蛋白和12毫克的氰基硼氫化鈉溶解于I毫升的PH為6.4的濃度為0.1M醋酸緩沖液中，所述醋酸緩沖液中還包括ImM的氯化錳、ImM的氯化鎂、ImM的氯化鈣以及0.2M的α-甲基甘露糖苷；
步驟142:將步驟141中所得到的溶液與0.5克甲酰載體混合，置4°C攪動(dòng)反應(yīng)過夜；
步驟143:將步驟142中所得到的凝膠懸于2毫升1%的戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液中還包含48毫克氰基硼氫化鈉以及0.2M的專一的糖，再置4°C攪動(dòng)反應(yīng)過夜。
[0015]步驟144:將凝膠置于2毫升PH為7.4濃度為IM的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中，所述三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中還包含有6.2毫克氰基硼氫化鈉，室溫反應(yīng)I小時(shí)；
步驟145:反應(yīng)完成后，將凝膠轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗上，用重蒸水洗去未反應(yīng)的氰基硼氫化鈉；
步驟146:分別用2M的氯化鈉、PH為4.0的濃度為0.2M的醋酸緩沖液、以及PH為9.0的濃度為0.1的碳酸緩沖液洗凝膠，用重蒸水洗至中性后，置于PH為7.4的濃度為0.2M的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中，加入防腐劑疊氮化納，置4°C冰箱中保存。
[0016]本發(fā)明并不局限于前述的【具體實(shí)施方式】。本發(fā)明擴(kuò)展到任何本說明書中披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種蛋白質(zhì)固定化的新方法，其特征在于，采用的是氰基硼氫化納還原法，包括以下步驟: 步驟11:制備環(huán)氧化瓊脂糖； 步驟12:對(duì)步驟I中得到的環(huán)氧化瓊脂糖進(jìn)行氨化處理； 步驟13:制備甲酰載體； 步驟14:將蛋白質(zhì)與甲酰載體進(jìn)行偶聯(lián)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)固定化的新方法，其特征在于，所述步驟11中制備環(huán)氧化瓊脂糖步驟進(jìn)一步包括步驟111: 步驟111:將洗凈抽干后的瓊脂糖懸浮于重蒸水中，依次混入濃度為2M的氫氧化鈉和濃度為5%的環(huán)氧氯丙烷，將這一懸浮液于40°C振蕩反應(yīng)2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入砂芯漏斗，用大量的水抽濾洗凈； 或步驟111為:將吸干的瓊脂糖在砂芯上用水洗凈并吸干，然后分別混入二甘油醚及濃度為2mg/ml的硼氫化鈉和濃度為0.6M的氫氧化鈉溶液，將這一懸浮液于25°C振蕩保溫反應(yīng)8小時(shí)后轉(zhuǎn)移到砂芯漏斗，用大量的水抽濾洗膠。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)固定化的新方法，其特征在于，所述步驟14中蛋白質(zhì)和甲酰載體的偶聯(lián)步驟進(jìn)一步包括: 步驟141:將蛋白質(zhì)與氰基硼氫化鈉溶解于PH為6.4的濃度為0.1M的醋酸緩沖液中，所述醋酸緩沖液中還包括ImM的氯化錳、ImM的氯化鎂、ImM的氯化鈣以及0.2M的α-甲基甘露糖苷； 步驟142:將步驟141中所得到的溶液與步驟13中制得的甲酰載體混合，置4°C攪動(dòng)反應(yīng)過夜； 步驟143:將步驟142中所得到的凝膠懸于1%的戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液中還包含氰基硼氫化鈉以及0.2M的專一的糖，再置4 °C攪動(dòng)反應(yīng)過夜； 步驟144:將凝膠置于PH為7.4濃度為IM的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中，所述三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中還包含有氰基硼氫化鈉，室溫反應(yīng)I小時(shí)； 步驟145:反應(yīng)完成后，將凝膠轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗上，用重蒸水洗去未反應(yīng)的氰基硼氫化鈉； 步驟146:分別用2M的氯化鈉、PH為4.0的濃度為0.2M的醋酸緩沖液、以及PH為9.0的濃度為0.1的碳酸緩沖液洗凝膠，用重蒸水洗至中性后，置于PH為7.4的濃度為0.2M的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中，加入防腐劑疊氮化納，置4°C冰箱中保存。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白質(zhì)固定化的新方法，其特征在于:所述步驟141中的醋酸緩沖液也可用磷酸緩沖液。
【文檔編號(hào)】C07K17/02GK105968207SQ201610310137
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】周潔
【申請(qǐng)人】成都易創(chuàng)思生物科技有限公司