7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷及其熒光標(biāo)記物的合成方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種7?酮基膽甾醇?9?羧基壬烷及其熒光標(biāo)記物的合成方法。本發(fā)明以膽固醇和壬二酸為原料，以1,3?二環(huán)已基碳化二亞胺和4?二甲氨基吡啶作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，建立氧化體系并通過建立脂縮反應(yīng)等最終得到7?酮基膽甾醇?9?羧基壬烷。本發(fā)明提供了一種操作簡便、原料易得，雜質(zhì)含量少、生產(chǎn)成本低的7?酮基膽甾醇?9?羧基壬烷的合成方法，以及提供一種引入NBD?熒光基團(tuán)的7?酮基膽甾醇?9?羧基壬烷的合成方法，在保證其基本骨架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入NBD?熒光基團(tuán)，最終合成NBD?oxLig?1，使7?酮基膽甾醇?9?羧基壬烷(oxLig?1)可自發(fā)熒光，為其在細(xì)胞生物學(xué)中的示蹤應(yīng)用。
【專利說明】
7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷及其熒光標(biāo)記物的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷及其熒光標(biāo)記物的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷（oxlig-Ι)最先由劉慶平等人從氧化低密度脂蛋白 (oxLDL)中分離得到，被用來作為血清糖蛋白02-GPI的特異性配體(Liu et al.，J Lipid Res 2002,43:1486-95)。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)oxLig-1可以激活CD36以及PPARy信號(hào)通路， 上調(diào)ABCAl表達(dá)，調(diào)節(jié)促進(jìn)膽固醇的流出，抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生(Wenzhe Li ,Dan Wang,et al:Atheroclerosis.2013,226；102-109Chi,Y,et al.,J Atherosclerosis,2014,234(2): 461-468)。
[0003] 7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷（oxLig-1)作為一類活性脂應(yīng)用價(jià)值巨大，但PCT/ JP02/00723所公開利用WSC/DMAP催化劑體系化學(xué)合成oxLig-Ι的方法，以昂貴的7-酮基膽 固醇(7-KC)為原料，大大增加了成本，因此，開發(fā)一種高效、環(huán)保且降低成本的合成方法，具 有較高的科學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)以及社會(huì)價(jià)值。
[0004] 如上所述，7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷(OXLig-I)有著如此巨大的科研和生物醫(yī)學(xué) 潛力，但其作用機(jī)理并沒有完全清晰，難點(diǎn)主要是其分子無法熒光標(biāo)記，現(xiàn)有的放射性標(biāo)記 技術(shù)，條件苛刻，易產(chǎn)生放射性污染，應(yīng)用有限。本發(fā)明在保證其基本骨架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引 入NBD-熒光基團(tuán)，使7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷(oxLig-Ι)可自發(fā)熒光，以便被示蹤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種操作簡便、原料易得，雜質(zhì)含量少、生產(chǎn)成 本低的7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷的合成方法，以及提供一種引入NBD-熒光基團(tuán)的7-酮基 膽甾醇-9-羧基壬烷的合成方法。
[0006] 本發(fā)明提供的合成7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷的技術(shù)方案如下：
[0007] 方案（1):首先以膽固醇和壬二酸為原料，以1，3_二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸： DCC: DMAP:膽固醇=2:1.5:1:1，應(yīng)始終保證壬二酸過量，在50-80°C下，大約2h，充分反應(yīng)， 縮合成膽固醇壬二酸脂，重結(jié)晶純化。
[0008] 重結(jié)晶溶劑為下列一種或兩種以上任意比例的組合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、 乙酸乙酯、乙醚、水。更進(jìn)一步，所述重結(jié)晶溶劑最優(yōu)選乙醇。
[0009] 所述重結(jié)晶溶劑用量為所得膽固醇壬二酸脂質(zhì)量的0.1~100倍，優(yōu)選1~5倍。 [0010] 反應(yīng)式如下： 「00111
[0012] 以上一步的膽固醇壬二酸酯為原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/Cr〇3為氧化體系， 鉻酐(CrO3)溶于二氯甲烷，待攪拌溶解完全后再加入一次膽固醇壬二酸脂以及4A分子篩。 然后用恒壓分液漏斗滴加體積分?jǐn)?shù)為70 %的TBHP到反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)20-36h，濾去反應(yīng) 固體，除雜，分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉水溶液，然后用無水硫酸鈉 干燥，過濾，旋蒸得到出粗產(chǎn)物7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷，氧化反應(yīng)的物料比滿足中間產(chǎn) 物膽固醇壬二酸酯反應(yīng)完全，以摩爾數(shù)記，膽固醇壬二酸酯:鉻酐=6~7:1;優(yōu)選6.5~7:1; TBHP: CrO3 = 50 ~60:1，優(yōu)選 60:1，反應(yīng)如下：
[0013]
[0014] 方案（1)中的以膽固醇為原料，得到中間產(chǎn)物膽固醇壬二酸酯及其建立丙烯位的 氧化最后得到7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷，所使用的酯化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)催化體系不僅 包含文中提到的DCC/DMAP，還應(yīng)有EDC1/DMAP，EDC/DMAP等一系列的催化體系。所使用的丙 烯位的氧化反應(yīng)也不僅包含TBHP/Cr0 3，還應(yīng)有PCC/Si〇2，吡啶/CrO3，TBHP/CuCh/BiuNBr， O2/NHPI等氧化體系。
[0015] 方案(2):首先以膽固醇和乙酸酐為原料由吡啶催化反應(yīng)生成膽固醇乙酸酯，其他 反應(yīng)條件與方案（1)相同，以摩爾數(shù)記，吡啶:膽固醇=5~15:1優(yōu)選10:1;酸酐:膽固醇=2 ~10:1，優(yōu)選5~8:1;充分反應(yīng)，縮合成膽固醇乙酸酯，重結(jié)晶純化；
[0016] 所述重結(jié)晶溶劑為下列一種或兩種以上任意比例的組合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯 甲烷、乙酸乙酯、乙醚、水，更進(jìn)一步，所述重結(jié)晶溶劑最優(yōu)選乙醇。
[0017]所述重結(jié)晶溶劑用量為所得膽固醇乙酸酯質(zhì)量的0.1~100倍，優(yōu)選1~5倍。
[0018]建立丙烯位氧化，以TBHP/Cr〇3為氧化體系，反應(yīng)得到7-酮基膽固醇乙酸酯，其他 反應(yīng)條件與方案（1)相同，以摩爾數(shù)記，丙烯位氧化中，膽固醇乙酸酯:鉻酐=6~7:1;優(yōu)選 6.5~7:1;丁8冊：00 3 = 50~60:1，優(yōu)選60:1。
[0019] 皂化反應(yīng)，利用KOH堿性水解7-酮基膽固醇乙酸酯，按照7-酮基膽固醇乙酸酯:KOH =1:1~2的摩爾比，7-酮基膽固醇乙酸酯完全溶解在四氫呋喃溶液中，KOH完全溶解在甲醇 中，混合后回流30min，冷卻到室溫，旋干溶劑，得到7-酮基膽固醇(7-KC)，再由7-酮基膽固 醇（7-KC)與壬二酸經(jīng)酯化反應(yīng)，7-酮基膽固醇與壬二酸的摩爾比= 2:1，得到7-酮基膽甾 醇-9羧基壬烷(oxLig-1)。
[0020] 具體如下：
[0021]
[0022]
[0023] 本發(fā)明方案（2)中先由膽固醇合成比較昂貴的7-酮基膽固醇，再合成目的產(chǎn)物 oxLig-Ι，此方案就是以降低成本為原則，得到成本低廉的目的產(chǎn)物oxLig-Ι。
[0024] 7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷的熒光標(biāo)記物的合成方法是引入NBD-熒光基團(tuán)，就是 利用NBD-膽固醇代替方案(1)中的膽固醇，其具體合成方法為：
[0025] 首先，以NBD-膽固醇和壬二酸為原料，以1，3-二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC)和4-二甲 氨基吡啶(DMAP)作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸:DCC: DMAP:NBD-膽固醇=2:1.5:1:1，應(yīng)始終保證壬二酸過量，在50-80°C充分反應(yīng)，縮合成NBD-膽固醇壬二酸脂，重結(jié)晶純化。
[0026] 重結(jié)晶溶劑為下列一種或兩種以上任意比例的組合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、 乙酸乙酯、乙醚、水，更進(jìn)一步，所述重結(jié)晶溶劑最優(yōu)選乙醇。
[0027] 所述重結(jié)晶溶劑用量為所得NBD-膽固醇壬二酸脂質(zhì)量的0.1~100倍，優(yōu)選1~5 倍。
[0028]以上一步的NBD-膽固醇壬二酸酯為原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/Cr03為氧化體 系，鉻酐（CrO3)溶于二氯甲烷，待攪拌溶解完全后再加入一次NBD-膽固醇壬二酸脂以及4A 分子篩。然后用恒壓分液漏斗滴加體積分?jǐn)?shù)為70%的TBHP到反應(yīng)液中室溫反應(yīng)20-36h，濾 去反應(yīng)固體，除雜，分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉水溶液，然后用無水 硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸得到出粗產(chǎn)物NBD-7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷。
[0029] 以摩爾數(shù)記，膽固醇壬二酸酯：鉻酐=6~7:1;優(yōu)選6.5~7:l;TBHP:Cr03 = 50~ 60:1，優(yōu)選 60:1。
[0030] 反應(yīng)如下：
[0031]
[0032] 本發(fā)明的有益效果效果是:本發(fā)明提供了一種操作簡便、原料易得，雜質(zhì)含量少、 生產(chǎn)成本低的7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷的合成方法，以及提供一種引入NBD-熒光基團(tuán)的 7_酮基膽留醇-9-羧基壬烷的合成方法，在保證其基本骨架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入NBD-熒光基 團(tuán)，最終合成NBD-oxLig-Ι，即ΝΚ)-7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷(oxLig-Ι)，使7-酮基膽甾醇-9_羧基壬烷(oxLig-Ι)可自發(fā)熒光，為其在細(xì)胞生物學(xué)中的示蹤應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0034] 實(shí)施例1
[0035]以膽固醇和壬二酸為原料，以1，3_二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶 (DMAP)作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸:DCC: DMAP:膽 固醇= 2:1.5:1:1，縮合成膽固醇壬二酸脂，反應(yīng)物在60°C水浴下進(jìn)行，攪拌反應(yīng)12h后回流 12h，最后過濾。粗產(chǎn)物經(jīng)飽和NaCl萃取清洗，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，隔天蒸干 備用。
[0036] 建立氧化體系，烯丙位的氧化:鉻酐溶于二氯甲烷，待攪拌溶解完全后再加入一次 反應(yīng)產(chǎn)物以及4A分子篩。然后用恒壓分液漏斗滴加體積分?jǐn)?shù)為70%的TBHP到反應(yīng)液中，室 溫?cái)嚢?4小時(shí)停止反應(yīng)。濾去反應(yīng)固體，除雜，分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉溶液，飽和 氯化鈉水溶液，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸得到出粗產(chǎn)物oxLig-Ι。
[0037] 建立脂縮反應(yīng):〇.25mmol的壬二酸、0.1875mmolDCC和0.125mmol催化劑DMAP溶于 15mL二氯甲烷中，由恒壓漏斗逐滴加入同樣溶于二氯甲烷的0.125mmol膽固醇，各物質(zhì)摩爾 比為壬二酸:DCC: DMAP:膽固醇=2:1.5:1:1;反應(yīng)物在60°C攪拌反應(yīng)12h后回流12h，期間利 用薄層層析隨時(shí)監(jiān)測反應(yīng)情況。
[0038]反應(yīng)后處理:將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓過濾，除去不溶的脲;飽和NaCl萃取3次，手機(jī)有 機(jī)相;無水硫酸鈉干燥過夜。
[0039] 建立烯丙位氧化體系：將0.00035gCr03溶于25ml二氯甲烷中，再加入I .3g (0.0023mo 1)膽留醇壬二酸酯已基0.2g4A分子篩。然后，將3ml (0.020mo 1)體積分?jǐn)?shù)為70 % THBP滴加到反應(yīng)液中。試問下攪拌24h后停止反應(yīng)。
[0040] 反應(yīng)后處理:將氧化反應(yīng)液過濾，倒入分液漏斗中，分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫 鈉溶液，飽和NaCl溶液，洗至中性，然后無水硫酸鈉干燥過夜。
[0041] 拌樣:稱取干燥產(chǎn)物3倍質(zhì)量的拌樣硅膠（100-140目）與產(chǎn)物與少量二氯甲烷溶 解，自然晾干。
[0042]裝柱:稱取干燥產(chǎn)物50倍質(zhì)量的純化硅膠(200-300目），連續(xù)導(dǎo)入柱子中，顛實(shí);加 入拌樣硅膠，最后壓成一薄層。
[0043] 純化:先后用純氯仿、氯仿：甲醇= 200:1和氯仿：甲醇= 50:1三種極性的洗脫液進(jìn) 行純化。
[0044] 純品收集:將含有純品的洗脫液收集，旋干得到成品oxLig-1。
[0045] 樣品分析:測定熔點(diǎn)，紅外譜，核磁碳譜、氫譜，質(zhì)譜檢測合成樣品。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] (1)建立反應(yīng)(膽留醇-膽留醇乙酸酯）：在裝有冷凝管、溫度計(jì)的四頸瓶中，加入 15ml (0.18mol)吡啶，10.0 g(0.023mo 1)膽甾醇，加熱攪拌;待膽甾醇在吡啶中全部溶解后， 再加入20ml (0.2 Imo 1)乙酸酐，75 °C恒溫反應(yīng)6h，停止加熱，冷卻至室溫。
[0048] (2)反應(yīng)后處理：加入100mL蒸餾水將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，然后分別用40ml 二氯甲烷萃取3次，合并萃取液;濾液分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉水 溶液，蒸餾水洗至中性。
[0049 ]用50g無水硫酸鈉干燥，過濾掉固體，減壓除去溶劑。
[0050]將粗品轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，自然干燥24h。
[00511 (3)純化:將干燥后的粗品，加 100mL無水乙醇，75°C加熱使其溶解至澄清;趁熱過 濾，將濾液自然冷卻至室溫后，放入4°冰箱放置24h;過濾，將結(jié)晶移至蒸發(fā)皿中，自然干燥 48h;向結(jié)晶固體中加入60ml無水乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，將重結(jié)晶的固體移入蒸發(fā)皿自然干燥得 到膽甾醇乙酸酯。
[0052] (4)建立反應(yīng)(膽甾醇乙酸酯-7-羰基膽甾醇乙酸酯）：將0.OOlSmol鉻酐(Cr03)溶 于1 · 95mo 1二氯甲烷中，再加入0 · 0012mo 1膽留醇乙酸酯以及1 · Og 4A分子篩；將0 · IOmo 1體 積分?jǐn)?shù)為70%TBHP滴加到反應(yīng)液中，室溫下攪拌24h后停止反應(yīng)。
[0053] (5)反應(yīng)后處理:過濾除去24小時(shí)反應(yīng)后的固體;分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉 溶液，飽和氯化鈉水溶液，洗至中性。將洗至中性的溶液傾入分液漏斗中，加入40ml二氯甲 烷萃取，萃取三次，合并萃取相，加入5g無水硫酸鈉過夜干燥。將經(jīng)無水硫酸鈉干燥的溶液 過濾，將粗產(chǎn)物移入蒸發(fā)皿中，自然干燥。
[0054] (6)純化:將脫脂棉放入色譜柱底部，并加入少量洗脫劑(石油醚-乙酸乙酯10:1， v/v)使其塞緊，然后將50g柱層析硅膠，200~300目吸附劑用洗脫劑中極性最低的調(diào)成糊 狀，將其邊敲打邊倒入柱中，同時(shí)，打開下旋活塞，在色譜柱下面用干燥的錐形瓶進(jìn)行接收 洗脫劑，當(dāng)裝入的吸附劑有一定的高度時(shí)，洗脫劑下流速度變慢，待所有吸附劑淋洗下來。 在此過程中，應(yīng)不斷敲打色譜柱，以使色譜柱填充均勻沒有氣泡。柱子填充完后，在吸附劑 上端覆蓋一層約0.5cm厚的石英砂，過夜平衡柱子。
[0055]將Ig樣品以適量10:1石油醚-乙酸乙酯展開劑溶解，加樣前，打開色譜柱下端活 塞，用滴管將樣品溶液滴加到色譜柱上，打開下端活塞，待溶液剛好全部進(jìn)入吸附劑界面 時(shí)，立即用滴管取少量用于溶解樣品的純?nèi)軇┭夭ＡЧ軆?nèi)壁注入，當(dāng)界面的溶劑大部分進(jìn) 入色譜柱后，開始淋洗洗脫。合并流分，減壓除去溶劑，移至蒸發(fā)皿中，自然干燥48h。
[0056] (7)建立反應(yīng)(7-羰基膽甾醇乙酸酯-7-酮基膽甾醇）：將0.OOllmol 7-羰基膽固 醇乙酸酯溶于〇.〇62mol四氫呋喃中，再加入0.0013mol 3 %氫氧化鉀（KOH)的甲醇溶液 0 · 074mol 中，水浴鍋 59 · 5°C 回流 30min。
[0057] (8)反應(yīng)后處理:冷卻至室溫，減壓旋干溶劑;將粗品轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，室溫下自然 干燥24h。
[0058] (9)純化:稱取30g(200~300目）柱層析用硅膠，用100mL石油醚將吸附劑調(diào)成糊 狀，將其邊敲打邊倒入柱中，同時(shí)打開下旋活塞，在色譜柱下面用干燥的錐形瓶接收洗脫 劑，流動(dòng)栗循環(huán)平衡柱子3小時(shí)。柱子填充完后在吸附劑上端覆蓋一層約0.5cm厚的石英砂。 [0059]將樣品以適量展開劑石油醚-乙酸乙酯（3:2)溶解，加樣前，打開色譜柱下端活塞， 讓溶劑慢慢流出，直到溶劑的液面稍高于砂子表面，關(guān)閉活塞，用滴管將樣品溶液滴加到色 譜柱上，打開下端活塞，待溶液剛好全部進(jìn)入吸附劑界面時(shí)，立即用滴管取少量用于溶解樣 品的純?nèi)軇┭夭ＡЧ軆?nèi)壁注入，當(dāng)界面的溶劑大部分進(jìn)入色譜柱后，開始淋洗。
[0060]洗脫劑淋洗，石油醚-乙酸乙酯(3:2);分別接受洗脫組分，并合并相同組分。
[0061 ] 實(shí)施例3
[0062] 以NBD-膽固醇和壬二酸為原料，以1，3_二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC)和4-二甲氨基 吡啶（DMAP)作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸：DCC: DMAP:膽固醇= 2:1.5:1:1，縮合成膽固醇壬二酸脂，反應(yīng)物在60°C水浴下進(jìn)行，攪拌反應(yīng) 12h后回流12h，最后過濾。粗產(chǎn)物經(jīng)飽和NaCl萃取清洗，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜， 隔天蒸干備用。
[0063] 建立氧化體系，烯丙位的氧化。鉻酐溶于二氯甲烷，待攪拌溶解完全后再加入一次 反應(yīng)產(chǎn)物以及4A分子篩。然后用恒壓分液漏斗滴加體積分?jǐn)?shù)為70%的TBHP到反應(yīng)液中，室 溫?cái)嚢?4小時(shí)停止反應(yīng)。濾去反應(yīng)固體，除雜，分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉溶液，飽和 氯化鈉水溶液，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸得到出粗產(chǎn)物oxLig-Ι。
[0064] 建立脂縮反應(yīng):〇.25mmol的壬二酸、0.1875mmolDCC和0.125mmol催化劑DMAP溶于 15mL二氯甲烷中，由恒壓漏斗逐滴加入同樣溶于二氯甲烷的0.125mmol膽固醇，各物質(zhì)摩爾 比為壬二酸:DCC:DMAP:膽固醇=2:1.5:1:1;反應(yīng)物在60°C攪拌反應(yīng)12h后回流12h，期間利 用薄層層析隨時(shí)監(jiān)測反應(yīng)情況。
[0065]反應(yīng)后處理:將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓過濾，除去不溶的脲;飽和NaCl萃取3次，收集有 機(jī)相;無水硫酸鈉干燥過夜。
[0066] 建立烯丙位氧化體系：將0.00035gCr03溶于25ml二氯甲烷中，再加入I .3g (0.0023mo 1)膽留醇壬二酸酯已基0.2g4A分子篩。然后，將3ml (0.020mo 1)體積分?jǐn)?shù)為70 % THBP滴加到反應(yīng)液中。試問下攪拌24h后停止反應(yīng)。
[0067] 反應(yīng)后處理:將氧化反應(yīng)液過濾，倒入分液漏斗中，分別用IN鹽酸溶液，5 %碳酸氫 鈉溶液，飽和NaCl溶液，洗至中性，然后無水硫酸鈉干燥過夜。
[0068]拌樣:稱取干燥產(chǎn)物3倍質(zhì)量的拌樣硅膠（100-140目）與產(chǎn)物與少量二氯甲烷溶 解，自然晾干;稱取干燥產(chǎn)物50倍質(zhì)量的純化硅膠(200-300目），連續(xù)導(dǎo)入柱子中，顛實(shí);加 入拌樣硅膠，最后壓成一薄層。
[0069] 純化:先后用純氯仿、氯仿：甲醇= 200:1和氯仿：甲醇= 50:1三種極性的洗脫液進(jìn) 行純化。
[0070] 純品收集:將含有純品的洗脫液收集，旋干得到成品oxLig-1。
[0071] 樣品分析:測定熔點(diǎn)，紅外譜，核磁碳譜、氫譜，質(zhì)譜檢測合成樣品。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷的合成方法，其特征在于，其合成步驟如下； 方案（1):首先以膽固醇和壬二酸為原料，以1，3-二環(huán)已基碳化二亞胺DCC和4-二甲氨 基吡啶DMAP作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸：DCC: DMAP:膽固醇=2:1.5:1:1，應(yīng)始終保證壬二酸過量，在50-80°C充分反應(yīng)，縮合成膽固醇壬 二酸脂，重結(jié)晶純化； 重結(jié)晶溶劑為下列一種或兩種以下任意比例的組合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸 乙酯、乙醚、水;重結(jié)晶溶劑用量為所得膽固醇壬二酸脂質(zhì)量的0.1~100倍； 反應(yīng)式如下：以上一步的膽固醇壬二酸酯為原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/Cr03為氧化體系，鉻酐 Cr03溶于二氯甲烷，待攪拌溶解完全后再加入一次膽固醇壬二酸脂以及4A分子篩，然后用 恒壓分液漏斗滴加體積分?jǐn)?shù)為70 %的TBHP到反應(yīng)液中室溫反應(yīng)20-36h，濾去反應(yīng)固體，除 雜，分別用1N鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉水溶液，然后用無水硫酸鈉干燥，過 濾，旋蒸得到出粗產(chǎn)物7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷;氧化反應(yīng)的物料比滿足中間產(chǎn)物膽固醇 壬二酸酯反應(yīng)完全，以摩爾數(shù)記，膽固醇壬二酸酯:鉻酐=6~7:1，TBHP: Cr03 = 50~60:1; 反應(yīng)如下：方案（1)中所述的酯化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)催化體系為DCC/DMAP、EDC1/DMAP或EDC/ DMAP，所述的丙烯位氧化反應(yīng)為 TBHP/Cr03、PCC/Si02、吡啶/Cr03，TBHP/CuCl 2/Bu4NBr 或 02/ NHPI； 方案(2):首先以膽固醇和乙酸酐為原料由吡啶催化反應(yīng)生成膽固醇乙酸酯，其他反應(yīng) 條件與方案⑴相同，以摩爾數(shù)記，啦啶:膽固醇=5~15:1，酸酐:膽固醇=2~10:1;充分反 應(yīng)，縮合成膽固醇乙酸酯，重結(jié)晶純化； 重結(jié)晶溶劑為下列一種或兩種以上任意比例的組合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸 乙酯、乙醚、水;所述重結(jié)晶溶劑用量為所得膽固醇乙酸酯質(zhì)量的0.1~100倍； 建立丙烯位氧化，以TBHP/Cr03為氧化體系，反應(yīng)得到7-酮基膽固醇乙酸酯，其他反應(yīng)條 件與方案⑴相同，以摩爾數(shù)記，丙烯位氧化中，膽固醇乙酸酯:絡(luò)酐=6~7:l，TBHP:Cr03 = 50~60:1; 皂化反應(yīng)，利用KOH堿性水解7-酮基膽固醇乙酸酯，按照7-酮基膽固醇乙酸酯:ΚΟΗ= 1: 1~2的摩爾比，7-酮基膽固醇乙酸酯完全溶解在四氫呋喃溶液中，ΚΟΗ完全溶解在甲醇中， 混合后回流30min，冷卻到室溫，旋干溶劑，得到7-酮基膽固醇，再由7-酮基膽固醇與壬二酸 經(jīng)酯化反應(yīng)，7-酮基膽固醇與壬二酸的摩爾比= 2:1，得到7-酮基膽留醇-9羧基壬烷； 具體如下：2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷的合成方法，其特征在于，7-酮基 膽甾醇-9-羧基壬烷的熒光標(biāo)記物的合成方法是引入NBD-熒光基團(tuán)，其具體合成方法為： 首先，以NBD-膽固醇和壬二酸為原料，以1，3-二環(huán)已基碳化二亞胺DCC和4-二甲氨基吡 啶DMAP作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸:DCC: DMAP: NBD-膽固醇=2:1.5:1:1，應(yīng)始終保證壬二酸過量，在50-80 °C充分反應(yīng)，縮合成NBD-膽固醇 壬二酸脂，重結(jié)晶純化； 重結(jié)晶溶劑為下列一種或兩種以上任意比例的組合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸 乙酯、乙醚、水;重結(jié)晶溶劑用量為所得NBD-膽固醇壬二酸脂質(zhì)量的0.1~100倍； 以上一步的NBD-膽固醇壬二酸酯為原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/Cr03為氧化體系，鉻 酐Cr03溶于二氯甲烷，待攪拌溶解完全后再加入一次NBD-膽固醇壬二酸脂以及4A分子篩， 然后用恒壓分液漏斗滴加體積分?jǐn)?shù)為70 %的TBHP到反應(yīng)液中室溫反應(yīng)20-36h，濾去反應(yīng)固 體，除雜，分別用1N鹽酸溶液，5 %碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉水溶液，然后用無水硫酸鈉干 燥，過濾，旋蒸得到出粗產(chǎn)物NBD-7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷；以摩爾數(shù)記，膽固醇壬二酸 酯：鉻酐=6 ~7:l，TBHP:Cr03 = 50 ~60:1; 反應(yīng)如下：3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷的合成方法，其特征在于，所述的 NBD-7-酮基膽留醇-9-羧基壬烷自發(fā)熒光，應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)中的示蹤。
【文檔編號(hào)】C09K11/06GK105859815SQ201610284746
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】劉慶平, 路遙, 林家彬, 喬輝, 王仁軍
【申請人】大連大學(xué)