一種制備IgY過程中的去脂液的配方及其配制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于制備IgY的方法領(lǐng)域，具體地說，涉及一種制備IgY過程中的去脂液的配方及其配制方法。
【背景技術(shù)】
[0002]IgY(eggyolkantibody，IgY)抗體是通過對禽類(雞)免疫注射特定抗原，從而在體內(nèi)產(chǎn)生IgY，經(jīng)血液由母體傳遞到卵黃內(nèi)，在卵黃中富集，進而通過分離卵黃，獲得的特異性多克隆抗體。相對于從哺乳動物血清中獲得抗體，避免了常規(guī)的動物采血，減輕了動物的痛苦，同時通過卵黃獲得抗體，產(chǎn)量大，制備簡單，每枚蛋中可以提純50?10mg的抗體，且母雞易于飼養(yǎng)，費用低，便于大規(guī)模的生產(chǎn)特異性抗體，經(jīng)濟優(yōu)勢明顯。
[0003]與哺乳動物免疫球蛋白IgG(immun0gl0bulinG，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗原結(jié)合位點，F(xiàn)e片段包含的位點有補體激活功能、調(diào)理素作用和致敏過敏反應(yīng)作用等功能。但是其結(jié)構(gòu)同哺乳動物有些不同，相對于IgG，IgY重鏈的氨基酸殘基數(shù)量多于IgG，且重鏈恒定區(qū)(CH區(qū))數(shù)量多于IgG，而輕鏈小于IgG <JgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG JiIgY相對于IgG更適合用于治療制劑。IgY等電點(PI)在5.7?7.6之間，在pH4.0?11.0時IgY穩(wěn)定，比兔IgG對酸變性更為敏感，當(dāng)pH值從4降到3時，IgY活性迅速喪失，而IgG對此只受到微小影響；IgY在低溫下儲存時性能較穩(wěn)定，室溫下可保持6個月的活性，4°C儲存6?7年活性下降僅5 % ; I gY抗胃蛋白酶消化的穩(wěn)定性較牛I gG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力則較強。
[0004]由于系統(tǒng)發(fā)生學(xué)距離造成哺乳動物和雞抗體特異性的差異，相對于哺乳動物IgG，IgY應(yīng)用于檢測也具有多方面的優(yōu)勢如:IgY與風(fēng)濕因子、人類抗鼠抗體(HAMA)沒有交叉反應(yīng)，無補體系統(tǒng)活性和異質(zhì)性凝集素，且不結(jié)合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反應(yīng)。此外，禽類針對保守性強的蛋白質(zhì)往往能引發(fā)較哺乳動物抗體更強烈的抗體反應(yīng)，成為有關(guān)抗體研發(fā)的重要選擇因素。
[0005]鑒于IgY的的應(yīng)用不斷推廣，適用性不同的提取方法被不斷地研發(fā)出來。傳統(tǒng)的提取方法主要由酸化水提取法、PEG沉淀法、有機物抽提法、天然膠提取法、辛酸提取法、色譜法等方法。在工業(yè)生產(chǎn)IgY的過程中傳統(tǒng)方法出現(xiàn)了提取試劑價格高、必須離心或低溫反應(yīng)步驟、耗時太久及涉及到危險試劑等影響成本控制或者應(yīng)用范圍的問題。同樣，現(xiàn)有的單一型除脂配方難以在控制經(jīng)濟成本的前提下除去大多數(shù)的脂類從而得到純度較高的抗體。
[0006]所以，對于技術(shù)人員來說，開發(fā)一種制備IgY過程中的去脂液的配方及其配制方法，設(shè)計合理，可針對免疫雞蛋快速簡單的提取抗體，并且可以去除卵黃中的大部分脂類及脂蛋白有，具體是，經(jīng)鑒定，提純的IgY抗體脂類殘余小于8 %并且經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度與常見的水提法等無差別，成為一個亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述缺陷，提供一種制備IgY過程中的去脂液的配方及其配制方法，設(shè)計合理，可針對免疫雞蛋快速簡單的提取抗體，并且可以去除卵黃中的大部分脂類及脂蛋白有，具體是，經(jīng)鑒定，提純的IgY抗體脂類殘余小于8%并且經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度與常見的水提法等無差別。
[0008]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0009]—種制備IgY過程中的去脂液的配方，其特征在于:配方包括如下分量的及配比的原料:2-5 份的 PluronicF68，5-9 份的 PEG6000干粉，1-3 份的 CaCl2,0.3-1.5 份的 CH3COONa，余量為雙蒸水。
[0010]作為一種優(yōu)化的技術(shù)方案，配方包括如下分量的及配比的原料:3份的PluronicF68，7.5份的PEG6000干粉，1.5份的CaCl2，0.8份的CH3COONa，余量為雙蒸水。
[0011]本發(fā)明還提供了一種制備IgY過程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于:
[0012]配置過程如下；
[0013](I)稱取3g食用級PluronicF68加入200ml藍(lán)蓋絲口瓶；
[0014](2)稱取 7.5gPEG6000 加入瓶中；
[0015](3)稱取 1.5gCaCl2 加入瓶中；
[0016](4)稱取0.85g的醋酸鈉加入瓶中，并加入10ml的雙蒸水，充分混勻形成澄清透明的卵黃去脂液，常溫保存；
[0017](5)選取免疫蛋，分離蛋清與蛋黃，收集蛋黃液并以PBSl:4稀釋為蛋黃稀釋液；
[0018](6)將所述蛋黃液與之前配置的卵黃去脂液1:1進行混合，室溫靜置2h，使用紗布對分層卵黃液進行過濾，收取上清;所獲得上清即為去除脂質(zhì)后的IgY抗體液，保存在-20°c備用。
[0019]作為一種優(yōu)化的技術(shù)方案，所述制備免疫蛋方法如下:向20周齡禽類進行初次免疫注射，免疫劑量為300yg/只，初次免疫21天之后，進行4次加強免疫，間隔時間為21天，免疫劑量為250yg/只。
[0020]作為一種優(yōu)化的技術(shù)方案，所述PBS的pH值為7.4。
[0021 ]由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明設(shè)計合理，可針對免疫雞蛋快速簡單的提取抗體，并且可以去除卵黃中的大部分脂類及脂蛋白有，具體是，經(jīng)鑒定，提純的IgY抗體脂類殘余小于8%并且經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度與常見的水提法等無差別。
[0022]同時下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步說明。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明一種實施例中特異性IgY抗體效價測定的結(jié)果顯示圖。
【具體實施方式】
[0024]實施例:
[0025]一種制備I gY過程中的去脂液的配方，配方包括如下分量的及配比的原料:3份的PluronicF68，7.5份的PEG6000干粉，1.5份的CaCl2，0.8份的CH3COONa，余量為雙蒸水。
[0026]本發(fā)明還提供了一種制備IgY過程中的去脂液的配方的配制方法，配置過程如下；
[0027](I)稱取3g食用級PluronicF68加入200ml藍(lán)蓋絲口瓶。
[0028](2)稱取 7.5gPEG6000 加入瓶中。
[0029](3)稱取 1.5gCaCl2 加入瓶中。
[0030](4)稱取0.85g的醋酸鈉加入瓶中，并加入10ml的雙蒸水，充分混勻形成澄清透明的卵黃去脂液，常溫保存。
[0031](5)選取免疫蛋，分離蛋清與蛋黃，收集蛋黃液并以PBSl:4稀釋為蛋黃稀釋液。所述制備免疫蛋方法如下:向20周齡禽類進行初次免疫注射，免疫劑量為300yg/只，初次免疫21天之后，進行4次加強免疫，間隔時間為21天，免疫劑量為250yg/只。另外PBS的pH值為7.4。
[0032](6)將所述蛋黃液與之前配置的卵黃去脂液1:1進行混合，室溫靜置2h，使用紗布對分層卵黃液進行過濾，收取上清;所獲得上清即為去除脂質(zhì)后的IgY抗體液，保存在_20°C備用。
[0033]上述抽取的特異性IgY抗體效價進行測定:方法如下:
[0034](I)包被酶標(biāo)版:用CBS溶液配制蛋白濃度為5yg/mL的抗原包被液，10yL/孔加入96孔酶標(biāo)板，37°C溫育過夜，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板3次，每次5分鐘；
[0035](2)封閉:用5%脫脂奶粉，滿孔封閉，37°C溫育2h，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板3次，每次5分鐘；
[0036](3)加IgY提取液:首先每孔加入10yL PBS鋪底，取出分離純化得到的IgY溶液，恢復(fù)至室溫后，用稀釋液I3BS 1:100稀釋，取50yL加入第一孔，吹吸混勻后吸取50yL加入第二孔，依次倍比稀釋至I: 102400 ο空白雞蛋提取的IgY 50yL為陰性對照(NC)，PBS 50yL為空白對照(BC)，37°C溫育Ih，棄去孔內(nèi)液體，洗板；
[0037](4)加酶標(biāo)二抗:辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgY用I3BS 1:6000稀釋，每孔加入10yL，37°C溫育Ih，棄去孔內(nèi)液體，洗板；
[0038](5)顯色:加入新鮮配制的TMB-H202底物液10yL/孔，室溫避光放置15?20分鐘，棄去孔內(nèi)液體，洗板；
[0039](6)終止:最后加入50yL 2mol/L的H2S04終止反應(yīng)，在450nm波長處用酶標(biāo)儀測其
OD值，每孔重復(fù)三次求平均值；
[0040](7)結(jié)果判定:求樣品孔0D450值(P)與陰性對照孔0D450值(N)的比值，當(dāng)P/N 2 2.1時，判斷為陽性，所對應(yīng)的抗體最大稀釋倍數(shù)即為該抗體效價。
[0041 ] 如圖1所示，結(jié)果顯示特異性IgY在初免20天左右，開始產(chǎn)生抗體，在初免后90天左右，抗體滴度達(dá)到最高，即1:102400，停止加強免疫后，抗體效價仍能維持一個多月。效價與使用水提法等比較基本沒有差別，在保存性上也有很好的表現(xiàn)。
[0042]本發(fā)明不局限于上述的優(yōu)選實施方式，任何人應(yīng)該得知在本發(fā)明的啟示下做出的結(jié)構(gòu)變化，凡是與本發(fā)明具有相同或者相近似的技術(shù)方案，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種制備IgY過程中的去脂液的配方，其特征在于:配方包括如下分量的及配比的原料:2-5 份的 PluronicF68，5-9 份的 PEG6000 干粉，1-3 份的 CaCl2,0.3-1.5 份的 CH3COONa，余量為雙蒸水。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備IgY過程中的去脂液的配方，其特征在于:配方包括如下分量的及配比的原料:3份的PluronicF68，7.5份的PEG6000干粉，I.5份的CaCl2，0.8份的CH3COONa,余量為雙蒸水。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備IgY過程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于: 配置過程如下； (1)稱取3g食用級PluronicF68加入200ml藍(lán)蓋絲口瓶； (2)稱取7.5gPEG6000加入瓶中； (3)稱取1.5gCaCl2加入瓶中; (4)稱取0.85g的醋酸鈉加入瓶中，并加入10ml的雙蒸水，充分混勻形成澄清透明的卵黃去脂液，常溫保存； (5)選取免疫蛋，分離蛋清與蛋黃，收集蛋黃液并以PBSl:4稀釋為蛋黃稀釋液； (6)將所述蛋黃液與之前配置的卵黃去脂液1:1進行混合，室溫靜置2h，使用紗布對分層卵黃液進行過濾，收取上清;所獲得上清即為去除脂質(zhì)后的IgY抗體液，保存在_20°C備用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備IgY過程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于:所述制備免疫蛋方法如下:向20周齡禽類進行初次免疫注射，免疫劑量為300yg/只，初次免疫21天之后，進行4次加強免疫，間隔時間為21天，免疫劑量為250yg/只。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備IgY過程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于:所述PBS的pH值為7.4。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備IgY過程中的去脂液的配方，配方包括如下分量的及配比的原料：2-5份的PluronicF68，5-9份的PEG6000干粉，1-3份的CaCl2，0.3-1.5份的CH3COONa，余量為雙蒸水。本發(fā)明設(shè)計合理，可針對免疫雞蛋快速簡單的提取抗體，并且可以去除卵黃中的大部分脂類及脂蛋白有，具體是，經(jīng)鑒定，提純的IgY抗體脂類殘余小于8％并且經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度與常見的水提法等無差別。
【IPC分類】C07K16/02, C07K1/14
【公開號】CN105541999
【申請?zhí)枴緾N201610065187
【發(fā)明人】張小鶯, 任昊, 徐夢飛
【申請人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月29日