一種營養(yǎng)切換培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微藻生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種營養(yǎng)切換培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著全球能源需求的不斷擴(kuò)大和環(huán)境污染問題的日益嚴(yán)重，對于綠色環(huán) 保可再生的新能源的研宄日益深入。其中，生物柴油作為一種可生物再生、環(huán)境友好型的綠 色新能源而被廣泛關(guān)注。自20世紀(jì)80年代開始，許多西方國家就已經(jīng)開始利用油料作物 (如大豆、油菜等）生產(chǎn)生物柴油作為傳統(tǒng)化石燃料的替代品。
[0003] 藻類是最原始的生物之一，通常呈單細(xì)胞、絲狀體或片狀體，結(jié)構(gòu)簡單，整個(gè)生 物體都能進(jìn)行光合作用，所以光合作用效率高，生長周期短、速度快。產(chǎn)油微藻為在一定 條件下能將二氧化碳、碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭忍荚崔D(zhuǎn)化為藻體內(nèi)大量貯存 的油脂，且油脂含量超過生物總量20%的微型藻類。同時(shí)與其他油料作物相比，利用微藻 培養(yǎng)生產(chǎn)生物柴油所需占地面積最少，同時(shí)微藻培養(yǎng)可以利用灘涂地、荒廢地等非耕地， 因此微藻培養(yǎng)生產(chǎn)生物柴油不會(huì)導(dǎo)致世界糧食供應(yīng)問題。所以，近幾年來，利用產(chǎn)油微藻生 產(chǎn)生物柴油成為目前國內(nèi)外生產(chǎn)生物柴油的主要方法。
[0004] 目前產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)模式主要有兩種：光反應(yīng)器（如跑道池，光照培養(yǎng)箱等）中的 自養(yǎng)培養(yǎng)和發(fā)酵罐中的異養(yǎng)培養(yǎng)。自養(yǎng)培養(yǎng)雖然降低了培養(yǎng)成本且有利于緩解溫室效應(yīng)， 但生物質(zhì)產(chǎn)量也較低同時(shí)生長周期相對較長；而異養(yǎng)培養(yǎng)雖可獲得較高的培養(yǎng)密度，但失 去了微藻作為綠色植物固定二氧化碳的重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，對數(shù)生 長期的產(chǎn)油微藻接種到含有有機(jī)碳源的培養(yǎng)基中，在光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行 培養(yǎng)，培養(yǎng)至平臺(tái)期。此方法在光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，保證了生物質(zhì)和 脂質(zhì)產(chǎn)量的同時(shí)又兼顧了其固定二氧化碳的重要作用并大大縮短了微藻培養(yǎng)的周期。
[0006] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來解決以上技術(shù)問題：
[0007] -種培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，對數(shù)生長期的產(chǎn)油微藻接種到含有有機(jī)碳源的培養(yǎng)基 中，在光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至平臺(tái)期。
[0008] 優(yōu)選的，培養(yǎng)初始pH值為7. 5-8. 5,初始接種濃度為0? 05-0. 15g/L。
[0009] 優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為：溫度25-30攝氏度，光照時(shí)的光照強(qiáng)度為6000-100001UX，通 氣速率為0. 3-0. 7vvm。
[0010] 優(yōu)選的，在光暗比為18h:6h-6h: 18h條件下進(jìn)行光照與無光照交替循環(huán)。若光暗 比為Ah:Bh，代表有光照的培養(yǎng)時(shí)間為Ah，無光照的培養(yǎng)時(shí)間為Bh，（A+B)小時(shí)進(jìn)行有光照 和無光照循環(huán)直至平臺(tái)期結(jié)束。對數(shù)生長期的產(chǎn)油微藻在光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下 進(jìn)行培養(yǎng)，通過控制光暗比達(dá)到混養(yǎng)和化能異養(yǎng)兩者切換培養(yǎng)的目的。在培養(yǎng)基中添加有 機(jī)碳源（如葡萄糖）之后，有光照時(shí)為混養(yǎng)培養(yǎng)，無光照時(shí)為化能異養(yǎng)培養(yǎng)?；祓B(yǎng)培養(yǎng)是指 微藻在利用光能和二氧化碳等無機(jī)碳源的同時(shí)，以有機(jī)碳源（如葡萄糖）作為補(bǔ)充碳源進(jìn) 行生長；化能異養(yǎng)培養(yǎng)是指微藻僅以有機(jī)碳源（如葡萄糖）作為能源和碳源進(jìn)行生長。
[0011] 優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基為含有5-15g/L有機(jī)碳源的BG11培養(yǎng)基。所述BG11培養(yǎng)基的 成分為 NaN03l. 5g/L，K2HP04.3H20 0? 04g/L，MgS04.7H20 0? 〇75g/L，CaCl2，211200. 〇1g/L，檸 檬酸 0? 006g/L，檸檬酸鐵銨 0? 006g/L，乙二胺四乙酸 0? 001g/L，Na2C030. 02g/L，A5 溶液 lmL/ L，用去離子水定容，其中 A5 溶液的組成為 H3B032. 86g/L，MnCl2 ? 4H20 1. 81g/L，ZnS04 ? 7H20 0? 222g/L，CuS04 ? 5H20 0? 079g/L，Co(N03)2 ? 6H200. 0494g/L，NaMo04 ? 2H20 0? 390g/L。有 機(jī)碳源可為糖類如葡萄糖，醇類如甘油，脂類如乙酸乙酯等。
[0012] 所述產(chǎn)油微藻為能異養(yǎng)培養(yǎng)的產(chǎn)油微藻，可選自淡水小球藻株或蛋白核小球藻， 淡水小球藻株如保藏號(hào)為CCTCC M2013607的淡水小球藻株Chlorella sorokiniana GS02。
[0013] 任一上述培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法用于生物柴油制造領(lǐng)域。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：通過光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方 法，不僅獲得了明顯高于自養(yǎng)的生物質(zhì)和脂質(zhì)產(chǎn)量，同時(shí)也發(fā)揮了微藻作為綠色植物固定 二氧化碳的重要作用；通過控制光照時(shí)間即光照比，巧妙地控制了光照與無光照的迅速切 換，達(dá)到混養(yǎng)和化能異養(yǎng)交替培養(yǎng)的目的。
【附圖說明】
[0015]圖1為實(shí)施例1中蛋白核小球藻在自養(yǎng)和營養(yǎng)切換時(shí)的生長曲線。
[0016] 圖2為實(shí)施例2中小球藻Chlorella sorokiniana GS02在自養(yǎng)和營養(yǎng)切換時(shí)的 生長曲線。
[0017] 圖3為實(shí)施例3中小球藻Chlorella sorokiniana GS02在自養(yǎng)和營養(yǎng)切換時(shí)的 生長曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0019]藻細(xì)朐的細(xì)朐干重和油脂含量的測量方法 [0020] (1)測量藻細(xì)胞的細(xì)胞干重
[0021] 培養(yǎng)結(jié)束后，將獲得的藻液通過離心收集藻粉，進(jìn)行干燥；干燥方式為冷凍干燥， 最后獲得純凈的藻粉。
[0022] 細(xì)胞干重（g/L)=干燥后所得藻粉總質(zhì)量（g)/藻液總體積（L)
[0023] (2)測量藻細(xì)胞中脂質(zhì)含量
[0024] 取0. 2g干燥的藻粉，加適量蒸餾水溶解后超聲破碎，離心去掉上清，用氯仿：甲醇 =2:1混合溶液進(jìn)行提取，離心收集上清液，重復(fù)提取三次后，將上清液混合，水浴蒸發(fā)去 掉有機(jī)溶劑，殘留物即為脂質(zhì)。
[0025] 脂質(zhì)含量（％ )=脂質(zhì)質(zhì)量（g)/〇. 2(g)
[0026] 實(shí)施例1蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa
[0027] (1)蛋白核小球藻的活化：配制50mlBGll培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，高壓滅菌后，從固 體平板中挑取單菌落進(jìn)行接種，并置于30001UX光強(qiáng)下24小時(shí)光照培養(yǎng)7天至對數(shù)生長 期。
[0028] (2)在1L通氣瓶中加入600ml含5g/L葡萄糖的BG11培養(yǎng)基，高壓滅菌后從步驟 (1)所述錐形瓶中吸取20ml活化完全的藻液進(jìn)行接種，培養(yǎng)初始pH值為7. 5,初始接種濃 度為0. 05g/L，培養(yǎng)溫度為25攝氏度，并置于80001ux光強(qiáng)下以0. 3vvm通氣速率進(jìn)行通氣 培養(yǎng)，控制光暗比為16h:8h，通過對光暗比的控制，使對數(shù)生長期的產(chǎn)油微藻在光照與無光 照的環(huán)境進(jìn)行切換（即營養(yǎng)切換），培養(yǎng)至平臺(tái)期。
[0029] (3)在1L通氣瓶中加入600mlBGll培養(yǎng)基，高壓滅菌后從步驟（1)所述錐形瓶中 吸取20ml活化完全的藻液進(jìn)行接種，培養(yǎng)初始pH值為7. 5,初始接種濃度為0. 05g/L，培養(yǎng) 溫度為25攝氏度，并置于80001ux光強(qiáng)下以0. 3vvm通氣速率進(jìn)行通氣培養(yǎng)，控制光暗比為 16h: 8h，不添加葡萄糖，作為對照。
[0030] 蛋白核小球藻在自養(yǎng)和營養(yǎng)切換時(shí)的生長曲線見圖1。
[0031] 培養(yǎng)八天后，采用上述藻細(xì)胞的細(xì)胞干重和油脂含量的測量方法獲得表1數(shù)據(jù)。
[0032]表1
[0033]
[0034]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，對數(shù)生長期的產(chǎn)油微藻接種到含有有機(jī)碳 源的培養(yǎng)基中，在光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至平臺(tái)期。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，培養(yǎng)初始pH值為 7. 5-8. 5,初始接種濃度為0. 05-0. 15g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，培養(yǎng)條件為：溫度為 25-30攝氏度，光照時(shí)的光照強(qiáng)度為6000-100001ux，通氣速率為0. 3-0. 7vvm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，在光暗比為 18h:6h-6h: 18h條件下進(jìn)行光照與無光照交替循環(huán)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含有 5-15g/L有機(jī)碳源的BGll培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，所述有機(jī)碳源為葡萄糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，所述BGll培養(yǎng)基的成分 為 NaNO3L 5g/L，K2HPO4 · 3H2O 0· 04g/L，MgSO4 · 7H2O 0· 〇75g/L，CaCl2 · 2H2O 0· 〇36g/L，檸檬 酸(λ 006g/L，檸檬酸鐵銨(λ 006g/L，乙二胺四乙酸(λ 001g/L，Na2CO30.0 2g/L，A5 溶液 ImL/ L，用去離子水定容，其中 A5 溶液的組成為 H3B032. 86g/L，MnCl2 · 4H201. 81g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 222g/L，CuSO4 · 5H20 0· 079g/L，Co(NO3)2 · 6H20 0· 0494g/L，NaMoO4 · 2H20 0· 390g/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，所述產(chǎn)油微藻選自淡水 小球藻株或蛋白核小球藻。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一所述的培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法用于生物柴油制造領(lǐng)域。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，對數(shù)生長期的產(chǎn)油微藻接種到含有有機(jī)碳源的培養(yǎng)基中，在光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至平臺(tái)期。此方法在光照與無光照交替循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，保證了生物質(zhì)和脂質(zhì)產(chǎn)量的同時(shí)又兼顧了其固定二氧化碳的重要作用并大大縮短了微藻培養(yǎng)的周期。
【IPC分類】C12N1-12, C12P7-64
【公開號(hào)】CN104830693
【申請?zhí)枴緾N201510259576
【發(fā)明人】繆曉玲, 劉國棟
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月20日