利用通過多磷酸分解作用(app)反應(yīng)的活化聚合核酸的制作方法
【專利說明】利用通過多磷酸分解作用（APP)反應(yīng)的活化聚合核酸
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01180067423. X，申請日為2011年12月13日，發(fā)明名稱為"利 用通過多磷酸分解作用（APP)反應(yīng)的活化聚合核酸"的中國專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求在35U.S.C. § 119(e)下，美國臨時專利申請?zhí)?1/422, 477 (其于2010 年12月13日提交，并以其整體通過參考的方式并入本文）的優(yōu)先權(quán)權(quán)益。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本公開涉及利用在存在改進(jìn)的多磷酸化試劑的情況下，通過多磷酸分解作用 (APP)反應(yīng)的活化，進(jìn)行核酸的聚合方法。
【背景技術(shù)】
[0005] 本公開涉及核酸（或者核苷酸）的聚合方法，利用通過多磷酸分解作用（APP) 反應(yīng)的活化。聚合作用可以使用具有3' -末端以雙脫氧核苷酸封閉的引物，在含有焦磷 酸酯（PPi)和dNTP平衡的反應(yīng)混合物中實現(xiàn)。這些方法已經(jīng)先前在，例如，美國專利號 6, 534, 269B2, 7, 033, 763B2, 7, 238, 480, 7, 105, 298, 7, 504, 221 和 7, 919, 253 中描述過。相 似的方法也在USPN 7, 745, 125中描述。這些方法也有許多應(yīng)用，包括存在野生型等位基因 時罕見等位基因的檢測（例如，在存在1〇6-1〇 9野生型等位基因時的一種突變的等位基因）。 所述方法對于以下時有用的，例如，檢測微小殘留病致病劑（例如，在緩解期間罕見的剩余 癌細(xì)胞，尤其是P53基因或其它先前確定腫瘤內(nèi)的抑癌基因的突變），和/或測量突變負(fù)荷 (例如，出現(xiàn)在正常組織中特定的體細(xì)胞突變的頻率，如血液或尿液）。這些方法的其他應(yīng) 用對本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。
[0006] 那些在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員的期望進(jìn)行這種方法的改進(jìn)方法。已經(jīng)令人驚訝 地發(fā)現(xiàn)，其他一些化合物也能夠解封閉核酸。本文所述的方法使用各種多磷酸分解試劑 (polyphosphorolyzing agent)執(zhí)行APP反應(yīng)。從這種改進(jìn)的方法的下面描述中，這些方法 的優(yōu)點將是顯而易見的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本文描述的是利用通過多磷酸分解作用（APP)反應(yīng)的活化，從測試樣品擴(kuò)增靶核 酸的方法。在某些實施方案中，APP使用一種或多種多磷酸分解試劑（polyphosphorolyzing agent)實現(xiàn)。在一些實施方案中，所述一種或多種多磷酸分解試劑可以通過公示I代表：
[0008]
【主權(quán)項】
1. 一種試劑盒，其包括 用于從樣品中擴(kuò)增至少一個靶核酸的至少一對寡核苷酸引物，其中所述引物對的至少 一個是具有不可延長的3'末端的寡核苷酸，所述不可延長的3'末端可通過多磷酸分解作 用除去； 一種或多種多磷酸分解試劑；和 具有多磷酸分解作用活性的生物催化劑； 其中一種或多種多磷酸分解試劑選自： 通式I的化合物：
其中，n選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 ;或 通式II的化合物：
其中，11和/或111選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，條件是11和111不能都為0，和 X選自：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中一種或多種多磷酸分解試劑選自三磷酸酯、四磷酸 酯、五磷酸酯、六磷酸酯，
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括焦磷酸酯。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括可檢測的DNA結(jié)合試劑或一種或多種 被可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中生物催化劑是DNA聚合酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中生物催化劑是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述熱穩(wěn)定的DNA聚合酶選自熱穩(wěn)定的 Tfl、Taq、AMPLlTAQFS、THERMOSEQUENASE、RQ1、RQY、THERMINAT0RI、THERMINATORII、 THERMINATORIII和THERMINATORGAMMA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中生物催化劑具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
9. 一種用于擴(kuò)增靶核酸的反應(yīng)混合物，其包括 用于擴(kuò)增至少一個靶核酸的至少一對寡核苷酸引物，其中所述引物對的至少一個是具 有不可延長的3'末端的寡核苷酸，所述不可延長的3'末端可通過多磷酸分解作用除去； 至少一個靶核酸； 一種或多種多磷酸分解試劑；和 具有多磷酸分解作用活性的生物催化劑； 其中一種或多種多磷酸分解試劑選自： 通式I的化合物：
其中，n選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 ;或 通式II的化合物：
其中，11和/或111選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，條件是11和111不能都為0，和 X選自：
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的反應(yīng)混合物，其進(jìn)一步包括可檢測的DNA結(jié)合試劑或一種或 多種被可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的探針。
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用通過多磷酸分解作用(APP)反應(yīng)的活化聚合核酸。本發(fā)明涉及使用多磷酸分解試劑三磷酸酯、多磷酸酯、亞氨基二磷酸酯、硫代二磷酸酯(或者單硫代焦磷酸酯)和相關(guān)的化合物中的至少一種、通過多磷酸分解(APP)反應(yīng)進(jìn)行活化的方法。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-10
【公開號】CN104694628
【申請?zhí)枴緾N201510044869
【發(fā)明人】（拉里）·L·習(xí), P·肯尼, Z·馬, D·普羅森, S·亨德里克斯, R·內(nèi)格爾
【申請人】生命技術(shù)公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2011年12月13日
【公告號】CN103492587A, CN103492587B, EP2652152A2, EP2652152A4, US8932813, US20120196329, US20150191775, WO2012082753A2, WO2012082753A3