專利名稱:青蒿1－羥基－2－甲基－2－(e)－丁烯基4－焦磷酸還原酶蛋白編碼序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列，屬于基因工程領域。
背景技術：
近年的統(tǒng)計資料表明世界有100多個國家和地區(qū)的20多億人生活在瘧疾流行區(qū)，每年約有2.7億人患這種疾病，其中有近300萬人死于瘧疾。正因為瘧疾的危害如此嚴重，世界衛(wèi)生組織1957年就開始實施了一項“全球消滅瘧疾計劃”，但至今成效不顯。其原因是從60年代起瘧原蟲對氯喹等主要抗瘧藥產(chǎn)生抗性，使這些藥失去了抗瘧藥效。為此世界上許多國家都投入了大量人力物力去研究開發(fā)新的抗瘧藥物。青蒿素類天然產(chǎn)物及其衍生物是我國科學工作者發(fā)掘祖國醫(yī)藥學寶庫研究開發(fā)的一類抗瘧新藥，具有自主知識產(chǎn)權，目前廣泛應用于瘧疾的治療。全世界每年青蒿素的需求量為150噸左右，而產(chǎn)量僅為15噸左右，明顯供不應求，目前售價已達到約225美元/g。開展青蒿素相關研究具有很好的經(jīng)濟效益和社會效益。
目前提高我國青蒿產(chǎn)品的科技含量，提升青蒿產(chǎn)業(yè)地位已勢在必行，這有賴于科技的源頭的創(chuàng)新，現(xiàn)代生物技術在生產(chǎn)優(yōu)質青蒿素藥源方面可以起到?jīng)Q定性作用。優(yōu)質藥源的嚴重匱乏是目前青蒿素生產(chǎn)上面臨的最大問題。近幾年來，尋找及擴大天然藥物青蒿素藥源是一個十分活躍的研究領域，取得了很大的進展，主要包括以下三個方面(1)利用傳統(tǒng)育種技術培育高含量青蒿素的青蒿栽培品種；(2)青蒿素的化學全合成或半合成；(3)利用現(xiàn)代生物技術提高青蒿中青蒿素含量。在這些研究領域中，培育高含量青蒿素的青蒿栽培品種所需周期太長，效率很低，青蒿素的含量不可能得到大幅度提高，此外，從天然青蒿中提取，產(chǎn)量受資源、環(huán)境和季節(jié)的限制，且生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低、難以滿足市場需求；青蒿素雖已能人工合成，但成本高、難度大，也未能投入生產(chǎn)。
相比之下，利用基因工程技術遺傳改良青蒿，開展青蒿素代謝工程研究，生產(chǎn)青蒿素就具有很大的優(yōu)勢(1)在生物技術研究領域中，研究人員對青蒿離體培養(yǎng)和青蒿遺傳轉化的成功，為利用生物技術生產(chǎn)青蒿素奠定了良好的理論和實踐基礎；(2)利用基因工程技術在基因水平上快速、高效地遺傳改良青蒿，獲得目標藥用成分含量大為提高且具遺傳穩(wěn)定性的轉基因藥用植物(包括幼苗、毛狀根、細胞系等)已經(jīng)有不少成功報道；(3)由于目前已闡明了青蒿素生物合成代謝途徑中的一些重要步驟的機理且相關的限速酶基因已經(jīng)克隆，使得實現(xiàn)青蒿素的代謝工程成為可能。
青蒿素屬于倍半萜衍生物，青蒿素的生物合成途徑屬于植物類異戊二烯代謝途徑。植物類異戊二烯的生物合成至少存在兩條途徑，即位于胞質的甲羥戊酸途徑和位于質體的丙酮酸/磷酸甘油醛途徑。位于質體的丙酮酸/磷酸甘油醛途徑的最后一步是羥甲基丁烯基-4-磷酸(hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate，HMBPP)在1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase，HDR)作用下轉化為異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)(5∶1)。它們是所有天然萜類的兩個基本的5碳通用前體。然而關于植物hdr基因的研究僅有很少報道，側金盞花(Adonisaestivalis)的lytB基因在大腸桿菌中的表達證明了它編碼的是具有HDR功能的基因，該文獻僅研究該基因的克隆和編碼蛋白質的功能驗證；2005年，Guevara-Garcia等人在The PlantCell報道了擬南芥hdr基因的克隆、HDR蛋白質功能驗證和hdr在擬南芥的表達情況，使得關于植物hdr研究得以深入；為了考察hdr在二萜生物合成中的作用，Botella-Pavia等首先在擬南芥中組成性過量表達紫杉二烯合成酶(TXS)基因，發(fā)現(xiàn)擬南芥中紫杉二烯的含量并不高；然而在同時過量表達HDR和TXS基因的擬南芥中，紫杉二烯含量比單轉TXS的擬南芥提高13倍，該研究表明hdr在萜類物質生物合成中是一個限速酶基因，是開展萜類代謝工程的重要功能基因。然而遺憾的是，到目前為止，還未見從青蒿中克隆HDR基因的報道。根據(jù)GeneBank中部分植物的1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的核苷酸序列，結合RACE技術我們從青蒿中克隆了相關序列，根據(jù)GeneBank的搜索和功能驗證結果，將該基因命名為青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因。
在對現(xiàn)有文獻的分析中，未見青蒿中丙酮酸/磷酸甘油醛生物合成途徑上的HDR基因的克隆，至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻的報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列。本發(fā)明公開了青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的氨基酸序列以及青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的核苷酸序列，為最終打破丙酮酸/磷酸甘油醛途徑上的限速反應步驟，為青蒿素的代謝工程提供了一個功能基因，及其在利用轉基因技術提高青蒿素含量的應用。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第36-1403位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第36-1403位的核苷酸序列雜交。
本發(fā)明所分離出的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列編碼多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發(fā)明DNA分子包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明DNA分子轉化的宿主細胞是真核細胞。在實例中該宿主細胞是青蒿。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發(fā)明中，術語“青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列”指編碼具有活性多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.31中第36-1403位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框第36-1403位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中第36-1403位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.1所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ IDNO.1中從核苷酸第36-1403位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第36-1403位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術語“青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶”指具有蛋白活性的SEQ ID NO.1序列的多肽。該術語還包括具有相關相同功能的、SEQ IDNO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括其活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶編碼多肽的血清獲得的多肽蛋白。
在本發(fā)明中，“青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
表1
表2
Query青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的氨基酸序列Sbjct甜菊(Stevia rebaudiana)1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的氨基酸序列(ABB88836.2)表2為本發(fā)明的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶與長春花1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。
發(fā)明還包括青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白或多肽的類似物。這些類似物與青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白相關多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白時，可以將青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因表達載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果質體轉運肽DNA作為前體表達并參與多肽的質體定位，那么質體轉運肽DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于質體轉運肽序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。
此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的核酸分子。
本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
本發(fā)明的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶相關發(fā)生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發(fā)明在提高青蒿素含量上具有明顯的作用。提高青蒿素的產(chǎn)量，以滿足全世界對抗瘧疾藥物的巨大需求。因此，本發(fā)明具有很大的應用價值。
具體實施方式下面結合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1
青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的克隆1.組織分離(Isolation)青蒿從重慶酉陽采集，將種子播種于溫室中，待青蒿苗長至10cm高時，準備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)各種植物的1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)核心片斷的克隆PCR[BP001(5’-GTYGAGCGYGCHGTBCAGATYGC-3’)+BP002(5’-CATCYTCMACDRCCTTRTCNGG-3’)]得到2002BP(976bp)的核心片斷，回收后連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知甜菊的HDR基因的同源性較高，故初步認為它是一個1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的片段。
(2)3’-RACEPCR[AP+BP003(5’-GTTACATCTGGTGCTTCTAC-3’)]得到2002BP 3’端序列(389bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與甜菊的HDR基因的同源性很高，故初步認為它是一個1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因。
(3).5’-RACE第一輪PCR[AAP+BP004(5’-ATCTTGTCATCAGGGAACTG-3’)]第二輪PCR[(AUAP+BP005(5’-CTAGCTTCATAAGCAATCTGC-3’)]得到2002BP5’端序列(406bp)，(過程同(1))。
將測序結果的重疊區(qū)拼接，得到全長片段序列信息，并設計一對特異引物進行PCR擴增青蒿HDR編碼區(qū)(BP006F1(5’-ATGGCGTCTTTGCAGCTAAC-3’)+BP007R1(5’-CTACACCAATTGCAGGGC-3’))得到HDR的編碼區(qū)(1368bp)。
BLAST的結果證明從青蒿中新得到的基因確為一個1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因。由于己知的同源1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因具有將HMBPP還原為IPP和DMAPP的功能，故推測此基因具有相同的功能。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的全長編碼序列。在拼接得到全長(包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物BP008 F15’-CGCGGGACACACAAAAACACA-3’為正向引物，BP009 R15’-GTAACAAGTCGTTTATAGCAACC-3’為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，F(xiàn)l/R2的PCR條件為94℃預變性2min；然后94℃變性45s、50℃退火45s、72℃延伸2min；30個循環(huán)；最后72℃延伸8min；電泳檢測PCR產(chǎn)物，獲得擴增片斷長度為1617bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進行克隆，測序，獲得SEQ ID NO.1所示的序列。
實施例2青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因序列信息與同源性分析本發(fā)明新的1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因序列全長cDNA的長度為1696bp，詳細序列見SEQ ID NO-1，其中開放讀框位于36-1403位核苷酸(1428個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導出青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶氨基酸序列，共455個氨基酸殘基，分子量為51.44kDa，等電點(pI)為5.63。詳細序列見SEQIDNO.1。
將青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的全長cDNA序列及其編碼蛋白質序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)它與甜菊1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因序列在核苷酸水平上具有83％的相同性(附表2)；在氨基酸水平上，它與甜菊HDR在蛋白水平上具有82％的相同性，(附表3)。由此可見，青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因與甜菊1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶在丙酮酸/磷酸甘油醛途徑上也具有相似的作用。
實施例3青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白或多肽在大腸桿菌中進行功能驗證在該實施例中，將全長的青蒿HDR編碼序列或片斷構建入商品化的蛋白質表達載體之中，以表達該蛋白，使宿主菌獲得在營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長的能力。
根據(jù)青蒿HDR的氨基酸序列，設計擴增出HDR的蛋白編碼區(qū)的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這根據(jù)選用的pQE30載體而定)，以便構建表達載體。以青蒿RNA為模板，進行RT-PCR擴增后，將青蒿HDR基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pQE30載體(Novagen)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌MG1655ara◇ispH，篩選鑒定得到含有pQE30-HDR表達載體的工程菌。同時將pQE30以相同方法轉入MG1655ara◇ispH，篩選鑒定得到含有pQE30表達載體的工程菌，作為對照實驗。
大腸桿菌MG1655ara◇ispH是HDR基因突變的菌株，在無阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基上無法生長。含有pQE30-HDR表達載體的工程菌在IPTG(異丙基-b-d-硫代半乳糖苷)和GLc(葡萄糖)的LB培養(yǎng)基上能夠生長，而含有pQE30表達載體的工程菌在IPTG和GLu的LB培養(yǎng)基上不能夠生長。說明實施事例1中獲得的基因具有1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶的功能，確實為青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因。
實施例4青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白或多肽在青蒿中進行真核細胞表達及轉基因植株的青蒿素含量檢測含目的基因的表達載體的構建，根據(jù)青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因cDNA克隆至中間載體(如pGEM T-ease)，進一步克隆到雙元表達載體(如改進的pCAMBIA1304)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定表達載體，再將其轉入發(fā)根農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術轉化青蒿。
1.發(fā)苗采取青蒿成熟的種子，用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡5分鐘，用無菌水沖洗6次；將青蒿種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g/L蔗糖，調節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)青蒿的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動后，改變培養(yǎng)條件為25℃，12小時光照，光照強度為25μmol.m-2.s-1。等到植株片長到3cm高時時可用于遺傳轉化。
2.轉化共培養(yǎng)將青蒿無菌苗的幼嫩葉片用小刀片削成約1cm2放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD600值在0.4-0.6之間)侵染3-5分鐘。接著取出放入共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
3.除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結束后，將外植體放入除菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。4周繼代一次。待除菌培養(yǎng)結束后，轉入抗性篩選培養(yǎng)基進行轉基因毛狀根初步篩選。
除菌培養(yǎng)基MS+cb(頭孢菌素)(250mg/l)篩選培養(yǎng)基MS+hygr(潮霉素)(30mg/l)4.毛狀根的離體培養(yǎng)當毛狀根長至大約4cm長時切下，在不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上于25±1.0℃無光照的恒溫培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。每三周繼代一次，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后可進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，以進一步進行分子檢測。
5.轉基因青蒿的分子檢測毛狀根DNA的提取和純化均參照分子克隆實驗指南(Sambrook，J.et al 1993)根據(jù)Fumer等的Ri質粒基因序列分析設計rolB、rolC基因的特異性引物。rolB基因的一對引物為5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’。rolC基因的一對引物為5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’。rolB、rolC基因的片段大小分別423bp和626bp。
由于青蒿中含有1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因，所以在對轉1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的毛狀根克隆時不能檢測直接DXR基因，而檢測植物表達載體上的潮霉素(hygr)抗性基因，潮霉素抗性基因(812bp)的檢測使用引物fhygr(5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’)和rhygr(5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’，退火溫度，58℃)。
PCR結果表明所獲得的根為毛狀根，對潮霉素抗性基因的檢測表明青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因已經(jīng)成功整合到青蒿基因組。
6.1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因在青蒿毛狀根中的northern blot分析1).RNA的提取利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)提取青蒿轉基因毛狀根各個單克隆的RNA。
2).RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1 OD260＝40μg/ml。
3).總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉入55℃水浴中。
3)于通風櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4).RNA尼龍膜上轉移1)轉移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉移12-20小時。4)轉移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5).膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。
Northern blot結果表明轉青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的毛狀根中1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因轉錄水平比空白毛狀根的明顯偏高。
7.轉1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因的毛狀根中青蒿素的HPLC分析青蒿素提取將烘干的青蒿轉基因毛狀根研成細粉，準確稱取0.125g細粉置于提取瓶中，加入10ml 30～60℃石油醚，在超聲波浴中提取30min，過濾，減壓回收溶劑，將殘渣用1ml甲醇重新溶解，12000r/min下離心10min以沉淀不溶部分，上清液用于測定青蒿素含量。
高壓液相檢測樣品及標準品的制備取青蒿素甲醇溶液200μl于10ml試管中，加入800μl甲醇、4ml 0.2％NaOH溶液，混勻，在50℃水浴中反應30min，冷卻至室溫，取0.5ml反應液于1.5ml塑料離心管中，加入100μl甲醇、400μl 0.05mol/L醋酸，混勻，過C18預分離小柱純化。按照同樣方法制備用于高壓液相分析的青蒿素標準品溶液，標準品濃度分別為每10ml溶液中含青蒿素標準品0、40、80、120、160、200、240μg。
高壓液相檢測條件色譜柱為C18柱，150mm×416mm，流動相為0.01mol/L磷酸緩沖液∶甲醇(55∶45)，pH7.0，流速1ml/min，紫外檢測器檢測波長設在258nm，注射體積10μl。在上述條件下，青蒿素出峰時間大約在4min。
測定結果表明轉基因青蒿中青蒿素含量明顯比野生型青蒿中青蒿素含量要高。
序列表<110>西南大學<120>青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶基因序列<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1696<212>DNA<213>青蒿(Artemisia annua L.)CGCGGGACAC ACAAAAACAC ACGCAGCATA ATTCA ATG GCG TCT TTG CAG CTA ACA 56Met Ala Ser Leu Gln Leu Thr1 5CCT CTG TCA ACT CGC ACA GAC TAC CTC TCC TTA CCT GCA GAC ATA AAA 104Pro Leu Ser Thr Arg Thr Asp Tyr Leu Ser Leu Pro Ala Asp Ile Lys10 15 20GTA TTC CGG TGC CGG AAG CCG TTA ACA GTC CGA TGC TCC GGC GGT GAC 152Val Phe Arg Cys Arg Lys Pro Leu Thr Val Arg Cys Ser Gly Gly Asp25 30 35ACG TCA TCG TCA ACG CAA TTT GAT GCG AAG GTG TTC AGG CAT AAT TTG 200Thr Ser Ser Ser Thr Gln Phe Asp Ala Lys Val Phe Arg His Asn Leu40 45 50 55ACA AGG AGC GAG AAT TAT AAT AGG AAA GGA TTT GGT CAT AAG AAG GAG 248Thr Arg Ser Glu Asn Tyr Asn Arg Lys Gly Phe Gly His Lys Lys Glu60 65 70ACT CTT GAG CTC ATG AGT CAG GAG TAT TTT AGC GAC ATT ATA AAG ACT 296Thr Leu Glu Leu Met Ser Gln Glu Tyr Phe Ser Asp Ile Ile Lys Thr75 80 85TTG AAG GAG AAT AAC TAC GAA TAT ACA TGG GGA AAT GTC ACT GTA AAG 344Leu Lys Glu Asn Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Gly Asn Val Thr Val Lys
90 95 100CTT GCA GAA GCT TTT GGT TTT TGT TGG GGT GTT GAG CGT GCC GTC CAG 392Leu Ala Glu Ala Phe Gly Phe Cys Trp Gly Val Glu Arg Ala Val Gln105 110 115ATT GCT TAT GAA GCT AGG AAA CAG TTC CCT GAT GAC AAG ATA TGG ATC 440Ile Ala Tyr Glu Ala Arg Lys Gln Phe Pro Asp Asp Lys Ile Trp Ile120 125 130 135ACA AAT CAA ATT ATT CAC AAC CCT ACT GTT AAC AAG AGG CTA GAA GAG 488Thr Asn Gln Ile Ile His Asn Pro Thr Val Asn Lys Arg Leu Glu Glu140 145 150ATG GAA GTT ACG GAT ATC CCC ATT GAC GGC GGA GAG AAA CAG TTT GAT 536Met Glu Val Thr Asp Ile Pro Ile Asp Gly Gly Glu Lys Gln Phe Asp155 160 165GTT GTT GAC AAG GGC GAT GTT GTA ATT CTG CCT GCC TTT GGA GCT GCA 584Val Val Asp Lys Gly Asp Val Val Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala170 175 180GTA GAC GAG ATG CGG ATT TTG AGT AAC AAA GAA GTA CAA ATA GTC GAT 632Val Asp Glu Met Arg Ile Leu Ser Asn Lys Glu Val Gln Ile Val Asp185 190 195ACA ACA TGC CCA TGG GTG ACT AAG GTG TGG AAT GTT GTC GAA AAG CAT 680Thr Thr Cys Pro Trp Val Thr Lys Val Trp Asn Val Val Glu Lys His200 205 210 215AAG AAG GGG GAC TAT ACG TCA GTA ATT CAT GGT AAA CAT AAC CAT GAG 728Lys Lys Gly Asp Tyr Thr Ser Val Ile His Gly Lys His Asn His Glu220 225 230GAG ACT GTA GCA ACA GCA TCT TTT GCA GGA AAG TTT ATC GTT GTG AAG 776Glu Thr Val Ala Thr Ala Ser Phe Ala Gly Lys Phe Ile Val Val Lys235 240 245AAC ATT GAT GAG GCG ACA TAT GTG TGT GAT TAC ATT CTT GGT GGT AAA 824Ash Ile Asp Glu Ala Thr Tyr Val Cys Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Lys250 255 260
CTT AAT GGA TCT AGC TCA ACC AAA GAA GCT TTC ATG GAG AAA TTC AAA 872Leu Asn Gly Ser Ser Ser Thr Lys Glu Ala Phe Met Glu Lys Phe Lys265 270 275TCT GCA GTT TCT GAG GGT TTT GAT CCT GAC AAG GAT CTT GTC AAA GCT 920Ser Ala Val Ser Glu Gly Phe Asp Pro Asp Lys Asp Leu Val Lys Ala280 285 290 295GGT ATC GCA AAC CAA ACT ACA ATG TTG AAG GGA GAA ACA GAG GAG ATA 968Gly Ile Ala Ash Gln Thr Thr Met Leu Lys Gly Glu Thr Glu Glu Ile300 305 310GGA AAA TTA TTA GAA AGA ACT ATG ATG CAA AAG TAT GGA GTA GAA AAT 1016Gly Lys Leu Leu Glu Arg Thr Met Met Gln Lys Tyr Gly Val Glu Asn315 320 325GTC AAC AAT CAT TTC CTA AGT TTT AAC ACC ATC TGT GAC GCC ACT CAG 1064Val Asn Asn His Phe Leu Ser Phe Asn Thr Ile Cys Asp Ala Thr Gln330 335 340GAG CGA CAA GAT GCT ATG TAT AAG TTG GTA GAT GAC AAA GTT GAT CTT 1112Glu Arg Gln Asp Ala Met Tyr Lys Leu Val Asp Asp Lys Val Asp Leu345 350 355ATG TTG GTA ATT GGT GGG TTC AAC TCG AGC AAC ACC TCA CAC TTA CAA 1160Met Leu Val Ile Gly Gly Phe Asn Ser Ser Asn Thr Ser His Leu Gln360 365 370 375GAG ATT GCT GAG GAG CGT AAA ATT CCA TCT TAT TGG ATT GAC AGT GAG 1208Glu Ile Ala Glu Glu Arg Lys Ile Pro Ser Tyr Trp Ile Asp Ser Glu380 385 390AAA AGA ATA GGC CCT GGA AAC CGA ATA GCT TAC AAG TTA TTG CAC GGT 1256Lys Arg Ile Gly Pro Gly Asn Arg Ile Ala Tyr Lys Leu Leu His Gly395 400 405GAA TTG GTT GAG CAA GAA AAC TGG CTA CCA AAG GGG CCT ATC ACA ATT 1304Glu Leu Val Glu Gln Glu Asn Trp Leu Pro Lys Gly Pro Ile Thr Ile410 415 420GGT GTT ACA TCT GGT GCT TCT ACC CCT GAC AAG GTT GTT GAA GAT GCT 1352
Gly Val Thr Ser Gly Ala Ser Thr Pro Asp Lys Val Val Glu Asp Ala425 430 435CTT CTT AAG GTA TTT GAG ATC AAA CGT GAG GAA GCC CTG CAA TTG GTG 1400Leu Leu Lys Val Phe Glu Ile Lys Arg Glu Glu Ala Leu Gln Leu Val400 445 450 455TAG ATTAGGCATG TACCTTGGCA AGAGAATCGA ACAGTATAGA TAAATCAAGT 1453***CTGAGCACCG AAACATGATG TCATCCATTG CAACTTGCAG CTGCATGTAC CTTTATATCT 1513GAAATGTATT GTATGCATAC TACAAAACCA TGGGTTCAGT ATCGACATTG ATACACACCA 1573CCCTTTAATA TGAAGTATCA TGGCTCTGGT TGCTATAAAC GACTTGTTAC AAAAAAAAAA 1633AAAAAACAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAG AAAAAAAAAA 1693AAA 1696<210>2<211>456<212>PRT<213>青蒿(Artemisia annua L.)<400>2Met Ala Ser Leu Gln Leu Thr Pro Leu Ser Thr Arg Thr Asp Tyr Leu1 5 10 15Ser Leu Pro Ala Asp Ile Lys Val Phe Arg Cys Arg Lys Pro Leu Thr20 25 30Val Arg Cys Ser Gly Gly Asp Thr Ser Ser Ser Thr Gln Phe Asp Ala35 40 45Lys Val Phe Arg His Asn Leu Thr Arg Ser Glu Asn Tyr Asn Arg Lys50 55 60Gly Phe Gly His Lys Lys Glu Thr Leu Glu Leu Met Ser Gln Glu Tyr65 70 75 80Phe Ser Asp Ile Ile Lys Thr Leu Lys Glu Asn Asn Tyr Glu Tyr Thr
85 90 95Trp Gly Asn Val Thr Val Lys Leu Ala Glu Ala Phe Gly Phe Cys Trp100 105 110Gly Val Glu Arg Ala Val Gln Ile Ala Tyr Glu Ala Arg Lys Gln Phe115 120 125Pro Asp Asp Lys Ile Trp Ile Thr Asn Gln Ile Ile His Asn Pro Thr130 135 140Val Asn Lys Arg Leu Glu Glu Met Glu Val Thr Asp Ile Pro Ile Asp145 150 155 160Gly Gly Glu Lys Gln Phe Asp Val Val Asp Lys Gly Asp Val Val Ile165 170 175Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Val Asp Glu Met Arg Ile Leu Ser Asn180 185 190Lys Glu Val Gln Ile Val Asp Thr Thr Cys Pro Trp Val Thr Lys Val195 200 205Trp Asn Val Val Glu Lys His Lys Lys Gly Asp Tyr Thr Ser Val Ile210 215 220His Gly Lys His Asn His Glu Glu Thr Val Ala Thr Ala Ser Phe Ala225 230 235 240Gly Lys Phe Ile Val Val Lys Asn Ile Asp Glu Ala Thr Tyr Val Cys245 250 255Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Lys Leu Asn Gly Ser Ser Ser Thr Lys Glu260 265 270Ala Phe Met Glu Lys Phe Lys Ser Ala Val Ser Glu Gly Phe Asp Pro275 280 285Asp Lys Asp Leu Val Lys Ala Gly Ile Ala Asn Gln Thr Thr Met Leu290 295 300Lys Gly Glu Thr Glu Glu Ile Gly Lys Leu Leu Glu Arg Thr Met Met305 310 315 320Gln Lys Tyr Gly Val Glu Asn Val Asn Asn His Phe Leu Ser Phe Asn325 330 335
Thr Ile Cys Asp Ala Thr Gln Glu Arg Gln Asp Ala Met Tyr Lys Leu340 345 350Val Asp Asp Lys Val Asp Leu Met Leu Val Ile Gly Gly Phe Asn Ser355 360 365Ser Asn Thr Ser His Leu Gln Glu Ile Ala Glu Glu Arg Lys Ile Pro370 375 380Ser Tyr Trp Ile Asp Ser Glu Lys Arg Ile Gly Pro Gly Asn Arg Ile385 390 395 400Ala Tyr Lys Leu Leu His Gly Glu Leu Val Glu Gln Glu Asn Trp Leu405 410 415Pro Lys Gly Pro Ile Thr Ile Gly Val Thr Ser Gly Ala Ser Thr Pro420 425 430Asp Lys Val Val Glu Asp Ala Leu Leu Lys Val Phe Glu Ile Lys Arg435 400 445Glu Glu Ala Leu Gln Leu Val TAG ***450 455 456
權利要求
1.一種青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第36-1403位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第36-1403位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權利要求
1所述的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權利要求
1或2所述的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第36-1403位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求
1所述的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權利要求
4所述的青蒿1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-焦磷酸還原酶蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。
專利摘要
一種青蒿1－羥基－2－甲基－2－(E)－丁烯基4－焦磷酸還原酶蛋白編碼序列，屬于基因工程領域。包括編碼具有1－羥基－2－甲基－2－(E)－丁烯基4－焦磷酸還原酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第36－1403位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45－55℃條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第36－1403位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明對提高青蒿素等萜類化合物含量具有明顯的作用，具有很大的應用價值。
文檔編號C12N9/02GK1995355SQ200610054600
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月14日
發(fā)明者廖志華, 陳敏, 諶容 申請人:西南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan