專利名稱:一種提高丙酮酸產(chǎn)量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提高丙酮酸產(chǎn)量的方法，尤其是在培養(yǎng)中添加能量輔助底物天冬氨酸，提高胞內(nèi)ATP水平，增強菌株酸耐受性，保護細胞生長，提高丙酮酸產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程領域。
背景技術：
發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸從50年代起開始研究，取得不少成果。采用發(fā)酵過程優(yōu)化和代謝工程改造原理，以丙酮酸高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強度相統(tǒng)一為目標，對多重營養(yǎng)缺陷型菌株光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)生產(chǎn)丙酮酸的發(fā)酵過程進行了大量優(yōu)化和改造等研究工作，促使丙酮酸產(chǎn)量大幅度提高。隨著丙酮酸產(chǎn)量提高，隨之而來的問題是酵母對于低PH值和高濃度丙酮酸的敏感性。
通常來說，在有機酸發(fā)酵過程中，為了維持發(fā)酵體系pH處于最適范圍而流加一定量NaOH等堿性物質(zhì)，且隨著NaOH等流加，導致發(fā)酵液滲透壓不斷升高；而發(fā)酵液中滲透壓達到一定濃度時，細胞進一步積累有機酸的能力和速度將逐漸下降，難以達到最大理論產(chǎn)量。盡管生物反應與產(chǎn)物分離組合技術能提高生物反應過程性能和效率，但該方法的適用范圍和高額的設備費用限制了其在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中的應用。為進一步提高丙酮酸產(chǎn)量和產(chǎn)率，需要降低發(fā)酵過程中丙酮酸的抑制或提高細胞耐低pH脅迫能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是一種提高丙酮酸產(chǎn)量的方法，以光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata) 為生產(chǎn)菌株,在初始培養(yǎng)基中添加天冬氨酸使終濃度為0-1.5g/L。
所述光滑球擬酵母為多重維生素營養(yǎng)缺陷型，保藏編號為CCTCC N0:M202019。
初始培養(yǎng)基中天冬氨酸的含量為1.5g/L。
光滑球擬酵母發(fā)酵用用培養(yǎng)基(g/L)為:葡萄糖100，NH4S047, MgSO4.7H20 0.8，KH2P045, CH3COONa 6，天冬氨酸1.5，微量元素液10mL，維生素液IOmL ;pH分別用丙酮酸溶液調(diào)節(jié)至5.5和4.5 ;罐上發(fā)酵用8mol/LNa0H或2mol/L HCl維持適當pH。
所述微量元素液為:CaCl2.2H20 2g，F(xiàn)eSO4.7H20 2g，ZnCl20.5g，MnCl2.4H20 12g，CuSO4.5H20 0.05g,2mol/L HCl溶解后用去離子水定容至1L。
所述維生素液為:煙酸80mg，硫胺素0.15mg,吡哆醇40mg，生物素4mg，核黃素IOmg, 2mol/L HCl溶解后用去離子水定容至1L。
細胞干重的測定方法:取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加2mL鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，用去離子水定容至10mL，搖勻；用UV 7500型可見分光光度計，于660nm處比色測OD值，用細胞干重標準曲線算得細胞干重。
丙酮酸濃度的測定:采用Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、視差折光檢測器和工作站)，色譜柱采用C18柱，5 μ m，4.6mmX 250mm ;流動相:0.1 % H3PO4 ;流速:lmL/min、柱溫:28°C、進樣量:10 μ L、紫外檢測器波長:215nm。[0012]樣品處理方法:5mL發(fā)酵液在IOOOOrpm下離心lOmin，取上清液移入試管中以備測丙酮酸用。測丙酮酸時，取ImL上清液移入50mL容量瓶中，去離子水定容至刻線，經(jīng)0.45 μ m濾膜過濾后，濾液供液相色譜分析用。
本發(fā)明通過添加天冬氨酸增加了 TCA流量，促進了菌株生長，提高了菌株耐酸能力。采用本發(fā)明的方法在PH分別為5.5和4.5的條件下，丙酮酸產(chǎn)量分別為55.8g/L和30.4g/L，與對照組(未添加組)相比分別提高了 12.4% (49.6g/L)和48.4% (20.5g/L)，且具有更好的生長性能。本發(fā)明提供的方法，簡單易行，對操作人員專業(yè)素質(zhì)要求低。
具體實施方式
實施例1菌株
一株四重維生素營養(yǎng)缺陷型、丙酮酸脫羧酶組成型降低及大量積累丙酮酸的光滑球擬酵母CCTCC N0.M202019，分類學命名為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)，為實驗室選育菌株，該菌株已申請中國專利，申請?zhí)枮?2113142.2，公開號CN1392246A。
實施例2發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸
將T.glabrata CCTCC M202019，先轉(zhuǎn)接斜面在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h進行活活。挑取活化后的單菌落接種到種子培養(yǎng)基，30°C，200rpm下培養(yǎng)24h。以10%的接種量將種子分別轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，添加天冬氨酸使終濃度為1.5g/L，pH分別設定為5.5,4.5，用8mol/LNaOH或2mol/L HCl為pH調(diào)節(jié)劑，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)56h。發(fā)酵結(jié)束后測定菌體濃度及丙酮酸產(chǎn)量，結(jié)果如表I所示。
所述種子培養(yǎng)基(g/L)為:葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4I, MgSO4.7H20 0.5 ;斜面培養(yǎng)基添加瓊脂20g/L，pH 5.5。
表1菌體濃度及丙酮酸濃度測定
權利要求
1.一種提高丙酮酸產(chǎn)量的方法，其特征在于以光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)為生產(chǎn)菌株；所述光滑球擬酵母為多重維生素營養(yǎng)缺陷型，保藏編號為CCTCCNO:M202019 ；所述光滑球擬酵母發(fā)酵用培養(yǎng)基用丙酮酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5 ;罐上發(fā)酵用8mol/L NaOH或·2mol/L HCl維持pH ;所述發(fā)酵用培養(yǎng)基IL的組成為:葡萄糖100g，NH4SO4 lg, MgSO4.7H20·0.8g，KH2PO4 5g，CH3COONa 6g，天冬氨酸1.5g，微量元素液10mL，維生素液IOmL ;微量元素液為=CaCl2.2H20 2g, FeSO4.7H20 2g, ZnCl2 0.5g, MnCl2.4H20 12g, CuSO4.5H20 0.05g,·2mol/L HCl溶解后用去離子水定容至IL ;維生素液為:煙酸80mg,硫胺素0.15mg,吡哆醇·40mg,生物素4mg,核黃素10mg , 2mol/LHCl溶解后用去離子水定容至1L。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種提高丙酮酸產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程領域。本發(fā)明在光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata CCTCC NOM202019)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過程中添加天冬氨酸，提高了光滑球擬酵母抵御酸脅迫能力。在pH分別為5.5和4.5的條件下，丙酮酸產(chǎn)量分別為55.8g/L和30.4g/L，與對照組(未添加組)相比分別提高了12.4％(49.6g/L)和48.4％(20.5g/L)，取得了較好的技術效果，有廣闊的應用前景。
文檔編號C12P7/50GKCN102121035 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201010581532
公開日2013年8月7日 申請日期2010年12月10日
發(fā)明者劉立明, 汪軍, 陳堅 申請人:江南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (2),