本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的引物組合物及其用途。

背景技術(shù)：

1、trna微小而復(fù)雜，但它卻被廣泛用于?rna翻譯、多肽合成及基因表達(dá)等研究和生物學(xué)應(yīng)用中。trna可以在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中形成聚集體，并參與到基因的傳遞、表達(dá)、翻譯及調(diào)節(jié)等過程。

2、trna可分為酶調(diào)節(jié)的trna，如rnasep-trna和rnase?mrp-trna，前者由核酸復(fù)制機(jī)制驅(qū)動(dòng)，用于基因表達(dá)；后者由多肽合成機(jī)制驅(qū)動(dòng)，用于翻譯。trna有助于基因表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)和生理反應(yīng)的發(fā)生，因此trna在生物體的各種功能中發(fā)揮著重要作用。

3、近年來，利用trna在基因組中的變異，也可以增強(qiáng)某種基因的表達(dá)。比如，利用rnasep-trna的變異，可以促進(jìn)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，激活一系列基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)某一基因的表達(dá)。

4、trna作為一種重要的核酸分子，參與細(xì)胞的各個(gè)功能，在基因表達(dá)、多肽合成、細(xì)胞分化和發(fā)育等方面有著重要的作用，而且促進(jìn)細(xì)胞的抗病毒機(jī)制，在生物學(xué)研究和應(yīng)用中同樣重要，但trna二級(jí)構(gòu)象中富含莖環(huán)結(jié)構(gòu)（由許多反向互補(bǔ)序列組成），因而對(duì)于其分子生物學(xué)檢測(cè)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。同時(shí)如何建立簡(jiǎn)單快速的類似trna這種富含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的rna檢測(cè)成為分子診斷行業(yè)內(nèi)的難題。在實(shí)踐中的trna絕大多數(shù)經(jīng)過primer?express、beacon?designer、oligo、ncbi的primer?blast等專業(yè)軟件均篩選不到合適的引物與探針。

5、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)于2023年申請(qǐng)了trna氨酰化水平定量qpcr檢測(cè)方法及試劑盒發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?02310516407.9)，其流程是，體外合成一段與trna?3’-末端cca互補(bǔ)的接頭序列，通過t4連接酶與靶trna連接后再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、qpcr檢測(cè)。

6、上述方案檢測(cè)存在接頭結(jié)構(gòu)復(fù)雜合成難度大、且涉及的檢測(cè)流程（t4連接、逆轉(zhuǎn)錄和qpcr）分步進(jìn)行，因而操作復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)，考慮到rna易降解的風(fēng)險(xiǎn)，這些復(fù)雜的操作不利于rna的檢測(cè)。因而有必要提出一種新方法用于對(duì)trna等富含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的高級(jí)rna進(jìn)行檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的引物組合物及其用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的引物組合物，所述引物組合物包含反轉(zhuǎn)錄引物和擴(kuò)增引物，所述反轉(zhuǎn)錄引物包含與待測(cè)序列互補(bǔ)段和非相關(guān)的通用序列段。

3、優(yōu)選地，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.16所示的核酸片段時(shí)，所述引物組合物包含核苷酸序列如seq?id?no.4所示的反轉(zhuǎn)錄引物、核苷酸序列如seq?id?no.1和2所示的擴(kuò)增引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.3所示的探針；或，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.17所示的核酸片段時(shí)，所述引物組合物包含核苷酸序列如seq?id?no.11所示的反轉(zhuǎn)錄引物、核苷酸序列如seq?id?no.8和9所示的擴(kuò)增引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.10所示的探針；或，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.18所示的核酸片段時(shí)，所述引物組合物包含核苷酸序列如seq?id?no.15所示的反轉(zhuǎn)錄引物、核苷酸序列如seq?id?no.11和12所示的擴(kuò)增引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.14所示的探針。

4、本發(fā)明還提供前述引物組合物在制備trna檢測(cè)產(chǎn)品中的用途。

5、本發(fā)明還提供一種檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的方法，所述方法包含如下步驟：

6、1）將前述引物組合物、待測(cè)樣本、逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、甜菜堿、海藻糖和水混合；

7、2）對(duì)步驟1）所得混合物執(zhí)行如下程序：a）逆轉(zhuǎn)錄；b）預(yù)變性；c）變性、延伸；

8、3）根據(jù)步驟2）中混合物的擴(kuò)增曲線的cq值判斷待測(cè)樣本是否含有目標(biāo)核酸片段。

9、如上所述，本發(fā)明的一種用于檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的引物組合物及其用途，具有以下有益效果：

10、1、本發(fā)明的引物組合物能通過應(yīng)用熒光定量pcr技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確且更加靈敏地對(duì)trna檢測(cè)，檢測(cè)敏感性高（檢出下限均可以達(dá)到1拷貝）、特異性好，具有高通量、低成本等特點(diǎn)。

11、2、本發(fā)明的引物組合物能使熒光定量pcr反應(yīng)程序一步完成，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化測(cè)序等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。

12、3、本發(fā)明檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的方法，突破了傳統(tǒng)檢測(cè)體系需要至少三到四步才能完成trna的限制。

13、4、本發(fā)明的引物組合物和檢測(cè)方法不僅僅適用于trna的檢測(cè)，也適用于高級(jí)結(jié)構(gòu)類似于trna其他rna或者rna結(jié)構(gòu)域的檢測(cè)。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物包含反轉(zhuǎn)錄引物和擴(kuò)增引物，所述反轉(zhuǎn)錄引物包含與待測(cè)序列互補(bǔ)段和非相關(guān)的通用序列段；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸選自trna。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物組合物，其特征在于，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.16-18任一所示的核酸片段。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.16所示的核酸片段時(shí)，所述反轉(zhuǎn)錄引物包含核苷酸序列如seq?idno.4所示的核酸片段；或，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.17所示的核酸片段時(shí)，所述反轉(zhuǎn)錄引物包含核苷酸序列如seq?id?no.11的核酸片段；或，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.18所示的核酸片段時(shí)，所述反轉(zhuǎn)錄引物包含核苷酸序列如seq?id?no.15所示的核酸片段。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述擴(kuò)增引物包含核苷酸序列如seq?id?no.1、2、8、9、11或12任一所示的核酸片段。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物組合物，其特征在于，所述擴(kuò)增引物包含核苷酸序列如seq?id?no.1和2所示的核酸片段；或，所述擴(kuò)增引物包含核苷酸序列如seq?id?no.8和9所示的核酸片段；或，所述擴(kuò)增引物包含核苷酸序列如seq?id?no.11和12所示的核酸片段。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物還包含探針；和/或，所述探針包含核苷酸序列如seq?id?no.3、10或14所示的核酸片段；和/或，所述探針還包含標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)；和/或，所述標(biāo)記熒光基團(tuán)選自fam、hex、vic、rox、tamra、cy5中的一種或多種；和/或，所述淬滅熒光基團(tuán)選自tamra、bhq1、bhq2、mgb、dabcyl、bhq3中的一種或多種。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.16所示的核酸片段時(shí)，所述引物組合物包含核苷酸序列如seq?idno.4所示的反轉(zhuǎn)錄引物、核苷酸序列如seq?id?no.1和2所示的擴(kuò)增引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.3所示的探針；或，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?idno.17所示的核酸片段時(shí)，所述引物組合物包含核苷酸序列如seq?id?no.11所示的反轉(zhuǎn)錄引物、核苷酸序列如seq?id?no.8和9所示的擴(kuò)增引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.10所示的探針；或，所述含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸包含核苷酸序列如seq?id?no.18所示的核酸片段時(shí)，所述引物組合物包含核苷酸序列如seq?id?no.15所示的反轉(zhuǎn)錄引物、核苷酸序列如seq?id?no.11和12所示的擴(kuò)增引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.14所示的探針。

9.權(quán)利要求1-8任一所述的引物組合物在制備trna檢測(cè)產(chǎn)品中的用途。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述trna檢測(cè)產(chǎn)品還包含逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、緩沖液試劑、表面活性劑或防腐劑中的一種或多種。

11.一種檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包含如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的引物組合物及其用途。本發(fā)明提供用于檢測(cè)含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸的引物組合物包含反轉(zhuǎn)錄引物和擴(kuò)增引物，所述反轉(zhuǎn)錄引物包含與待測(cè)序列互補(bǔ)段和非相關(guān)的通用序列段。本發(fā)明的引物組合物能通過應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確且更加靈敏地對(duì)tRNA檢測(cè)，檢測(cè)敏感性高、特異性好，具有高通量、低成本等特點(diǎn)，能使熒光定量PCR反應(yīng)程序一步完成，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化測(cè)序等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。

技術(shù)研發(fā)人員：陳順靚,倪佳歡,王爽,朱化星,王英明,何小明
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19