本發(fā)明涉及家蠶物質(zhì)能量代謝與繁殖領(lǐng)域，尤其是涉及了一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna、制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、家蠶(bombyx?mori)是當(dāng)今地球上室內(nèi)飼養(yǎng)量最大的經(jīng)濟(jì)資源昆蟲，它從桑葉(飼料)中攝取各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并通過代謝生理過程供給蠶體內(nèi)各個(gè)組織器官而進(jìn)行生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等。家蠶通過蠶蛾的交配、產(chǎn)卵進(jìn)行繁殖，蠶蛾翅的大小對(duì)其交配、產(chǎn)卵產(chǎn)生一定的影響。
2、神經(jīng)肽在昆蟲的物質(zhì)能量代謝等重要生理過程調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其發(fā)揮作用的信號(hào)通路是由調(diào)節(jié)因子來介導(dǎo)的。昆蟲神經(jīng)肽信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子研究比較滯后，直到2000年才首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)并被命名為kurtz蛋白。在家蠶中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽信號(hào)通路需要家蠶kurtz(bmkurtz)蛋白參與介導(dǎo)，但有關(guān)bmkurtz介導(dǎo)神經(jīng)肽作用，來調(diào)控家蠶生長(zhǎng)與物質(zhì)能量代謝等，均缺乏研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種縮小家蠶蛾翅面積的方法，是采用rt-pcr克隆，pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳回收，與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pflag-cmv-3連接，與t7反應(yīng)緩沖液、atp液、ctp液、gtp液、utp液、t7酶液混合反應(yīng)，再給家蠶蛹腹部注射的方法，通過調(diào)控家蠶物質(zhì)能量代謝，縮小家蠶蛾翅面積。
2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
3、一、一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna制備方法，方法步驟為：
4、(1)解剖并收集五齡第2-3天的家蠶脂肪體，從中提取總rna，然后逆轉(zhuǎn)錄獲得第1鏈cdna；
5、(2)以所述第1鏈cdna為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)進(jìn)行擴(kuò)增克隆獲得家蠶kurtz?cdna(bmkurtz?cdna)；
6、(3)以所述家蠶kurtz?cdna為模板，通過pcr擴(kuò)增并用瓊脂糖凝膠電泳回收得到bmkurtz?dna片段，經(jīng)hindiii/bamhi酶切后，與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pflag-cmv-3連接，獲得pflag-bmkurtz；
7、(4)以所述pflag-bmkurtz為模板，通過pcr擴(kuò)增并用瓊脂糖凝膠電泳回收得到純化的目的pflag-bmkurtz?dna片段，作為反應(yīng)模板；
8、(5)將所述反應(yīng)模板與10×t7反應(yīng)緩沖液、atp液、ctp液、gtp液、utp溶液和t7酶混合進(jìn)行反應(yīng)，然后再進(jìn)行后續(xù)處理得到bmkurtz?sirna，作為所述sirna。
9、所述步驟(1)具體為：解剖并收集五齡第2-3天的家蠶脂肪體，使用triz?ol試劑盒從中提取總rna，再用逆轉(zhuǎn)錄第1鏈cdna合成試劑對(duì)總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得第1鏈cdna；逆轉(zhuǎn)錄的條件是：65℃變性4min，42℃反應(yīng)55min，70℃滅活13min。
10、所述步驟(2)具體為：以第1鏈cdna為模板，分別用如seq?id?no.1的正向引物和seq?id?no.2的反向引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)擴(kuò)增，克隆獲得家蠶kurtzcdna(bmkurtz?cdna)；所述的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)擴(kuò)增的條件是：93℃預(yù)變性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。
11、所述步驟(3)中，bmkurtz?dna片段具體采用以下方式獲得：以家蠶ku?rtz?cdna為模板，分別用seq?id?no.3的正向引物和seq?id?no.4的反向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到bmkurtz?dna片段；所述的pcr擴(kuò)增條件是：93℃預(yù)變性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32個(gè)循環(huán)，加rtaq酶繼續(xù)延伸16min。
12、所述步驟(4)得到pflag-bmkurtz?dna片段所具體采用的方式如下：以pflag-bmkurtz為模板，分別用seq?id?no.5的特異性引物和seq?id?no.6的特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；所述的pcr擴(kuò)增條件是：93℃預(yù)變性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32個(gè)循環(huán)，得到pflag-bmkurtz?dna片段。
13、所述步驟(5)具體為：
14、(5.1)在試管內(nèi)依次加入1.5-2μg反應(yīng)模板以及2μl?10×t7反應(yīng)緩沖液、2μl?atp液、2μl?ctp液、2μl?gtp液、2μl?utp液和2μl?t7酶液混合物；
15、(5.2)繼續(xù)補(bǔ)充無核酸酶的雙蒸餾水至20μl并充分混合，放置于37℃反應(yīng)18h，后冷卻至常溫；
16、(5.3)在步驟(5.2)獲得的混合液中加入1μl?turbo?dna酶，混勻后于37℃下孵育16min；
17、(5.4)再加入30μl無核酸酶的雙蒸餾水、30μl?7.5m氯化鋰和50mm?edta，終止反應(yīng)；
18、(5.5)于4℃下15000rpm離心16min，除去上清液，加入1ml?70％質(zhì)量百分比的乙醇溶液洗滌；
19、(5.6)于4℃下15000rpm離心16min，除去70％質(zhì)量百分比的乙醇上清液，將沉淀用無核酸酶的雙蒸餾水溶解，得到bmkurtz?sirna。
20、二、一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna，采用上述步驟(1)-(5)任一所述制備方法制備而成。
21、三、一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna的應(yīng)用：
22、上述方法獲得的sirna或所述sirna用于縮小家蠶蛾翅面積。
23、四、所述sirna用于縮小家蠶蛾翅面積的方法：
24、將家蠶蛹腹部注射bmkurtz?sirna，后置于一定溫度和一定濕度且晝明夜暗的環(huán)境中保護(hù)，化蛾獲得翅面積縮小的家蠶蛾。
25、將bmkurtz?sirna液過濾膜除菌，后將化蛹第1天的家蠶蛹腹部注射16-22μgbmkurtz?sirna，將注射后的蠶蛹置于溫度為24-25℃、濕度為70-80％、晝明夜暗的環(huán)境中保護(hù)，注射后的蠶蛹化蛾獲得翅面積縮小的家蠶蛾。
26、通過大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在沒有改變家蠶遺傳特性的情況下，采用本發(fā)明技術(shù)的化蛾第1天蠶蛾翅面積較對(duì)照區(qū)未采用本發(fā)明技術(shù)的化蛾第1天蠶蛾翅面積縮小約28％。
27、本發(fā)明具有的有益效果是：
28、本發(fā)明縮小家蠶蛾翅面積的方法，是在沒有改變家蠶遺傳特性的情況下，通過調(diào)控家蠶代謝來實(shí)現(xiàn)的，這對(duì)于研究家蠶的物質(zhì)與能量代謝機(jī)制、進(jìn)一步提高家蠶生理機(jī)能等，具有積極作用。
1.一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna制備方法，其特征在于方法步驟為：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna制備方法，其特征在于：所述步驟(1)具體為：解剖并收集五齡第2-3天的家蠶脂肪體，使用trizol試劑盒從中提取總rna，再用逆轉(zhuǎn)錄第1鏈cdna合成試劑對(duì)總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得第1鏈cdna；逆轉(zhuǎn)錄的條件是：65℃變性4min，42℃反應(yīng)55min，70℃滅活13min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna制備方法，其特征在于：所述步驟(2)具體為：以第1鏈cdna為模板，分別用如seq?id?no.1的正向引物和seq?idno.2的反向引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，克隆獲得家蠶kurtz?cdna；所述的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的條件是：93℃預(yù)變性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中，bmkurtz?dna片段具體采用以下方式獲得：以家蠶kurtz?cdna為模板，分別用seq?id?no.3的正向引物和seq?id?no.4的反向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到bmkurtz?dna片段；所述的pcr擴(kuò)增條件是：93℃預(yù)變性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32個(gè)循環(huán)，加rtaq酶繼續(xù)延伸16min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna制備方法，其特征在于：所述步驟(4)得到pflag-bmkurtz?dna片段所具體采用的方式如下：以pflag-bmkurtz為模板，分別用seq?id?no.5的特異性引物和seqid?no.6的特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；所述的pcr擴(kuò)增條件是：93℃預(yù)變性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32個(gè)循環(huán)，得到pflag-bmkurtz?dna片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna制備方法，其特征在于：所述步驟(5)具體為：
7.一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna，其特征在于：采用權(quán)利要求1-6任一所述制備方法制備而成。
8.一種用于縮小家蠶蛾翅面積的sirna的應(yīng)用，其特征在于：權(quán)利要求1所述方法獲得的sirna或權(quán)利要求7所述sirna用于縮小家蠶蛾翅面積。
9.利用權(quán)利要求8所述sirna用于縮小家蠶蛾翅面積的方法，其特征在于：將家蠶蛹腹部注射bmkurtz?sirna，后置于一定溫度和一定濕度且晝明夜暗的環(huán)境中保護(hù)，化蛾獲得翅面積縮小的家蠶蛾。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的sirna用于縮小家蠶蛾翅面積的方法，其特征在于：將bmkurtz?sirna液過濾膜除菌，后將化蛹第1天的家蠶蛹腹部注射16-22μg?bmkurtz?sirna，將注射后的蠶蛹置于溫度為24-25℃、濕度為70-80％、晝明夜暗的環(huán)境中保護(hù)，注射后的蠶蛹化蛾獲得翅面積縮小的家蠶蛾。