發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物技術(shù)生產(chǎn)方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于生物技術(shù)生產(chǎn)方法中的改善的培養(yǎng)基，使用這樣的改善的培養(yǎng)基的方法，以及從使用該改善的培養(yǎng)基的方法獲得的產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、生物技術(shù)方法被廣泛用于生產(chǎn)生物產(chǎn)品。這些方法通常涉及在允許培養(yǎng)的細(xì)胞的生長和產(chǎn)物形成的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞?？捎糜谏锛夹g(shù)生產(chǎn)的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞以及動物或植物來源的細(xì)胞。

2、長期以來，動物細(xì)胞培養(yǎng)已用于生產(chǎn)生物產(chǎn)品，例如治療性蛋白質(zhì)、多肽、寡肽或其他生物分子，例如治療性多糖。在這樣的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通常經(jīng)過基因修飾以產(chǎn)生所需產(chǎn)物的動物細(xì)胞在液體、固體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以用于細(xì)胞增殖和產(chǎn)物形成。細(xì)胞培養(yǎng)的一個顯著優(yōu)點是動物細(xì)胞和植物細(xì)胞能夠?qū)Τ跫壆a(chǎn)物進行翻譯后修飾，例如多肽的折疊和翻譯后修飾。

3、在生物技術(shù)生產(chǎn)方法中，特別是在動物細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞培養(yǎng)條件的控制和優(yōu)化對于細(xì)胞增殖和產(chǎn)物形成至關(guān)重要。一個決定性因素是培養(yǎng)基組成。最終細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的濃度和質(zhì)量在很大程度上取決于培養(yǎng)基組成。就所需的營養(yǎng)組成和培養(yǎng)條件而言，動物和植物細(xì)胞培養(yǎng)是特別有需要的。所需的營養(yǎng)物不僅包括碳、氮和能量的基本來源，例如糖和氨，還包括更復(fù)雜的營養(yǎng)物，例如必需氨基酸、生長因子和維生素。由于這個原因，向動物細(xì)胞培養(yǎng)基補充復(fù)雜的營養(yǎng)成分例如血清已用于向動物細(xì)胞提供廣泛多樣的營養(yǎng)物。但是，監(jiān)管和安全問題以及與可用血清來源的異質(zhì)性相關(guān)的問題已導(dǎo)致業(yè)界努力從工業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中消除血清和其他成分不確定的培養(yǎng)基。但是，在無血清培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞培養(yǎng)物通常顯示營養(yǎng)不足。由于這個原因，已經(jīng)付出了很多努力來鑒定復(fù)雜培養(yǎng)基的那些營養(yǎng)成分及其最佳濃度，這是細(xì)胞培養(yǎng)物中令人滿意的生長和蛋白質(zhì)形成所必需的?？朔I養(yǎng)不足的一種常用策略是在培養(yǎng)過程中進料用過的培養(yǎng)基成分。用于補給的高度濃縮的溶液被稱為進料培養(yǎng)基。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一起優(yōu)化它們的組成遵循相同的邏輯。

4、一個具體的應(yīng)用子集是生產(chǎn)病毒作為疫苗或作為用于基因治療的載體。在這兩種情況下，細(xì)胞培養(yǎng)過程均顯示出明顯的分離成兩個階段。第一階段是病毒的制造，旨在最大化病毒產(chǎn)率。第二階段是使用載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在此，培養(yǎng)基理想地支持高轉(zhuǎn)染效率。

5、向細(xì)胞培養(yǎng)物提供氨基酸已知對生長速率和產(chǎn)量具有顯著作用。谷氨酰胺常規(guī)用于細(xì)胞培養(yǎng)基和進料，因為它是培養(yǎng)的細(xì)胞的重要碳、氮和能量來源。已經(jīng)證明，動物細(xì)胞培養(yǎng)物的最佳生長所必需的谷氨酰胺的量是其他氨基酸的量的3至10倍（eagle等人，science?130：432-37）。然而，谷氨酰胺作為營養(yǎng)物當(dāng)在升高的溫度下（例如熱滅菌條件）溶解于水中時不穩(wěn)定，因為在加熱下形成焦谷氨酸和氨（roth等人，1988,?in?vitrocellular?&?developmental?biology?24(7):?696-98）。因此，通常在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用谷氨酸代替谷氨酰胺（cell?culture?technology?for?pharmaceutical?and?cell-basedtherapies,?52,?sadettin等人編輯，taylor?and?francis?group,?2006）。

6、以前已經(jīng)描述了在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中在l-谷氨酰胺代謝和krebs能量循環(huán)中均起關(guān)鍵作用的戊二酸的酮衍生物α-酮戊二酸（akg）的用途（hassel?&?butler,?journal?ofcell?science?96,501-508,?evonik?nutrition?&?care?gmbh,?scientific?overview:cqrex??akg,?february?2016）?？梢宰C明，在cho和雜交瘤細(xì)胞系的情況下，通過將akg加入商購可得的培養(yǎng)基，最大活細(xì)胞密度（vcd）可以增加超過30％，并且整體活細(xì)胞密度（ivcd）可以增加超過50％。

7、盡管上述現(xiàn)有技術(shù)中描述的細(xì)胞培養(yǎng)基為某些細(xì)胞培養(yǎng)過程提供了令人滿意的性能和特性，但是現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基仍然不是最佳的。仍然需要在生物技術(shù)生產(chǎn)過程中促進更好的生長和產(chǎn)物形成的進一步改良的培養(yǎng)基。這對于基于細(xì)胞的病毒生產(chǎn)（無論是作為疫苗還是用于治療）的新興領(lǐng)域尤其相關(guān)。通常，該領(lǐng)域的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是去除血清以改善增殖性能并提高病毒差率。后者對于這兩種應(yīng)用是特別相關(guān)的。在流行病的情況下，需要在很短的時間內(nèi)制作大量的疫苗。對于基因治療，最小化起始載體生產(chǎn)和施用之間的時間是確保治療成功的關(guān)鍵參數(shù)。

8、因此，本發(fā)明的目的是提供一種高級培養(yǎng)基，其促進各種細(xì)胞系的更好的生長和產(chǎn)物形成，并且另外減少毒性氨的量。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本發(fā)明解決了已知培養(yǎng)基的上述缺點。本發(fā)明由所附獨立權(quán)利要求的術(shù)語限定。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案由從屬權(quán)利要求限定。

2、因此，本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，優(yōu)選地為細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含選自酮亮氨酸、酮纈氨酸、酮異亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一種酮酸和/或這些酮酸的鹽。

3、本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選植物細(xì)胞、動物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞的用途。

4、本發(fā)明的另一方面涉及一種制造細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的方法，該方法包括以下步驟：（i）提供能夠產(chǎn)生所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的細(xì)胞；（ii）使所述細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基接觸；和（iii）從所述培養(yǎng)基或所述細(xì)胞獲得所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物。

5、在本發(fā)明的以下詳細(xì)描述中進一步詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。

技術(shù)特征：

1.一種培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含選自酮亮氨酸、酮纈氨酸、酮異亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一種酮酸和/或這些酮酸的鹽。

2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述酮酸是選自酮亮氨酸、酮纈氨酸、酮異亮氨酸的支鏈酮酸。

3.前述權(quán)利要求中任一項的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含2:1:1的大致比例的酮亮氨酸、酮纈氨酸和酮異亮氨酸。

4.前述權(quán)利要求中任一項的培養(yǎng)基，其包含所述酮酸的堿金屬鹽或堿土金屬鹽。

5.前述權(quán)利要求中任一項的培養(yǎng)基，其包含所述酮酸的na+、k+、ca2+和mg2+鹽，優(yōu)選na+或k+鹽。

6.前述權(quán)利要求中任一項的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基還包含至少一種碳水化合物、至少一種游離氨基酸、至少一種無機鹽、緩沖劑和/或至少一種維生素。

7.前述權(quán)利要求中任一項的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基為液體形式、凝膠、粉末、顆粒、丸劑的形式或片劑的形式。

8.前述權(quán)利要求中任一項的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基或成分確定的培養(yǎng)基。

9.前述權(quán)利要求中任一項的培養(yǎng)基，其中所述酮酸以0.01至10g/l、或0.1至5g/l、或0.1至0.5g/l的濃度，優(yōu)選0.01至0.2?g/l的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。

10.前述權(quán)利要求中任一項所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基相對于所述培養(yǎng)基的使用濃度是2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍濃縮的形式。

11.權(quán)利要求1-9中任一項的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞的用途。

12.權(quán)利要求11的用途，其中所述細(xì)胞是動物細(xì)胞或植物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。

13.權(quán)利要求12的用途，其中所述細(xì)胞選自：cho細(xì)胞、cos細(xì)胞、vero細(xì)胞、bhk細(xì)胞、hek細(xì)胞、hela細(xì)胞、ae-1細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞。

14.選自酮亮氨酸、酮纈氨酸、酮異亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一種酮酸和/或這些酮酸的鹽在培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)細(xì)胞的用途。

15.一種制造細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟：

16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物選自：治療性蛋白質(zhì)、診斷性蛋白質(zhì)、多糖例如肝素、抗體、單克隆抗體、生長因子、白介素、病毒、病毒樣顆粒和酶。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含選自酮亮氨酸、酮纈氨酸、酮異亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一種酮酸和/或這些酮酸的鹽。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選植物細(xì)胞、動物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞的用途。本發(fā)明的另一方面涉及一種制造細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的方法，該方法包括以下步驟：（i）提供能夠產(chǎn)生所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的細(xì)胞；（ii）使所述細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基接觸；和（iii）從所述培養(yǎng)基或從所述細(xì)胞獲得所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物。

技術(shù)研發(fā)人員：C·科斯勒,A·卡勞
受保護的技術(shù)使用者：贏創(chuàng)運營有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23