本發(fā)明屬于生物催化，涉及一種利用頭孢菌素c?；复呋铣深^孢菌素母核的方法。

背景技術(shù)：

1、β-內(nèi)酰胺類抗生素是一類抗菌藥物，占全球抗生素市場的一半以上。其中頭孢菌素在治療多種傳染病方面處于市場領(lǐng)先地位。7-氨基頭孢烷酸(7-aca)是合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的核心，7-aca最初發(fā)現(xiàn)是在絲狀真菌中由頭孢菌素c(cpc)反應(yīng)得到的，cpc是合成7-aca的主要代謝源。7-氨基頭孢烷酸是當(dāng)前和未來半合成頭孢菌素藥物的主要核心化合物。

2、在早期，工業(yè)上通過一系列化學(xué)反應(yīng)從cpc合成7-aca。它不僅是在極低溫度下使用有機(jī)溶劑，而且這種化學(xué)生產(chǎn)方法會(huì)釋放有毒的化學(xué)廢物和含磷酸鹽的污染水，造成了嚴(yán)重的環(huán)境危害。因此，近年來酶催化方法因能耗低并且對環(huán)境友好而逐漸成為了工業(yè)生產(chǎn)上的新方向。最初工業(yè)上利用兩步酶法從頭孢菌素c合成7-氨基頭孢烷酸。首先利用d-氨基酸氧化酶(daao)將cpc催化氧化脫羧生成戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸(gl-7-aca)，再由戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；?gla)催化水解生成7-氨基頭孢烷酸。這種兩步酶法生產(chǎn)7-aca需要兩種不同的細(xì)菌發(fā)酵程序和復(fù)雜的酶純化-固定化過程，所以制造成本仍然較高。后來一步酶法被開發(fā)出來，它可直接由頭孢菌素c?；?cca)催化頭孢菌素c生成7-氨基頭孢烷酸。相比之下，一步酶法將cpc直接轉(zhuǎn)化為7-aca更具有經(jīng)濟(jì)可行性，同時(shí)避免了過氧化氫的產(chǎn)生。

3、頭孢菌素c的生物合成由三種氨基酸開始，分別為l-纈氨酸、l-半胱氨酸、l-氨基乙二酸。這三種氨基酸在胞漿中被氨基頭孢烷酸(acv)合成酶催化生成三肽acv，再由異青霉素n(ipn)合成酶介導(dǎo)進(jìn)行環(huán)化生成ipn；產(chǎn)生的ipn通過位于過氧化物酶體中的雙組分外膜酶異構(gòu)化為青霉素n；青霉素n被daoc合成酶轉(zhuǎn)化為去乙酰氧基頭孢菌素c(daoc)；胞質(zhì)羥化酶促進(jìn)daoc側(cè)鏈修飾生成去乙酰頭孢菌素c(dac)。最后，乙酰轉(zhuǎn)移酶在dac上添加一個(gè)乙?；鶊F(tuán)生成cpc，再從真菌胞漿中分泌到胞外空間。

4、因頭孢菌素c酰化酶對daoc、dac、cpc都具有催化活性，為保證代謝通路中成分的充分利用和更加高效的生產(chǎn)7-aca，從而獲得具有底物特異性且酶活高的cpc?；?cca)。本發(fā)明努力投入于cca的蛋白質(zhì)工程，獲得了具有cpc催化活性且抑制daoc和dac的?；敢灾С止I(yè)應(yīng)用，并使各種核心β-內(nèi)酰胺抗生素的合成成為可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何利用生物催化合成的方法高效制備頭孢菌素母核7-aca。以解決現(xiàn)有技術(shù)中突變型頭孢菌素c?；复呋钚孕?，底物特異性低的問題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種頭孢菌素c?；竿蛔凅w，其中野生型的?；傅陌被嵝蛄腥鐂eq?id?no:1所示，來源于bosea?sp.ok403，所述?；竿蛔凅w是在所述野生型序列上進(jìn)行突變的seq?id?no:2所示,然后以seq?id?no:2為模板在第r158、m163、r261、a602位進(jìn)行突變得到的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)對a602位點(diǎn)突變獲得的突變體具有較高的底物特異性。

3、本發(fā)明相應(yīng)提供上述頭孢菌素c?；竿蛔凅w的編碼核酸分子，其表達(dá)盒，含有所述編碼基因或其表達(dá)盒的重組載體、含有所述基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體的重組微生物；

4、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

5、所述的核酸分子的表達(dá)盒是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述突變頭孢菌素c?；傅膁na，該dna不但可包括啟動(dòng)突變頭孢菌素c酰化酶編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括突變頭孢菌素c酰化酶轉(zhuǎn)錄的終止子。更進(jìn)一步的，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。

6、所述的核酸分子的重組載體可為攜帶有所述突變頭孢菌素c?；妇幋a基因的細(xì)菌質(zhì)粒(如在細(xì)菌中表達(dá)的基于t7啟動(dòng)子的表達(dá)載體，具體如pet-28a等)、噬菌體、酵母質(zhì)粒(如yep系列載體等)或逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒。

7、所述重組載體為將所述核酸分子插入表達(dá)載體中得到的載體。

8、所述的含有編碼所述突變頭孢菌素c酰化酶的核酸分子的重組微生物可為攜帶有頭孢菌素或所述頭孢菌素突變蛋白質(zhì)編碼基因的酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如大腸桿菌等。

9、本發(fā)明還提供了一種制備頭孢菌素母核7-aca的方法，具體包括以化合物ⅰ為底物，利用如seq?id?no:1所示頭孢菌素c?；富蛩龅念^孢菌素突變體的催化劑相接觸進(jìn)行催化反應(yīng)，得到化合物ⅱ。

10、

11、其中r為乙酰氧基、羥基、氫。

12、上述方法中，所述重組細(xì)胞可通過向生物細(xì)胞中導(dǎo)入能表達(dá)所述頭孢菌素c?；竿蛔凅w的重組載體獲得。

13、所述生物細(xì)胞可為微生物。所述微生物可為大腸桿菌，也可以是其他菌。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述微生物為大腸桿菌bl21(de3)。

14、所述反應(yīng)的溫度可為10-40℃，具體可為25℃；所述反應(yīng)的ph?6.5-9.5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行的，具體為8.0。一般可為0.5-24h，具體可為1h。所述重組細(xì)胞的裂解產(chǎn)物可由裂解所述重組細(xì)胞得到。

15、本發(fā)明通過半理性的設(shè)計(jì)，構(gòu)建突變體，獲得了酶活提高且具有底物特異性的突變體，所得突變體可以催化頭孢菌素衍生物產(chǎn)生頭孢菌素母核，在生物催化制備頭孢菌素母核中具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種頭孢菌素c?；竿蛔凅w，其特征在于，氨基酸序列為將序列表中seq?id?no.2所述的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)取代得到的突變體。氨基酸位點(diǎn)包括r158、m163、r261、a602。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的頭孢菌素c酰化酶突變體，其特征在于：其相對于出發(fā)頭孢菌素c酰化酶而言，其氨基酸序列的r158、m163、r261、a602位點(diǎn)為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

3.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述頭孢菌素c?；竿蛔凅w的相關(guān)的生物材料，為下述(1)至(4)中任一種：

4.一種制備化合物ⅱ的方法，其特征在于，包括以化合物ⅰ為底物，權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的頭孢菌素c酰化酶突變體的作為催化劑相接觸進(jìn)行催化反應(yīng)，得到化合物ⅱ：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述重組細(xì)胞通過向生物細(xì)胞中導(dǎo)入能表達(dá)權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的頭孢菌素c?；竿蛔凅w的重組載體實(shí)現(xiàn)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的頭孢菌素c酰化酶突變體通過重組細(xì)胞表達(dá)獲得，具體是通過向生物細(xì)胞中導(dǎo)入能表達(dá)如權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的頭孢菌素c?；竿蛔凅w的重組載體實(shí)現(xiàn)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的頭孢菌素c?；竿蛔凅w以全細(xì)胞、粗酶液、粗酶粉、固定化酶或純酶的形式發(fā)生催化作用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述的全細(xì)胞為含有編碼權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的頭孢菌素c酰化酶突變體的核酸分子的重組微生物，優(yōu)選是酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如大腸桿菌等；

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：以所述?；缸鳛樯锩复呋孜锷上鄳?yīng)的產(chǎn)物的反應(yīng)是在濃度為40mmol/l-60mmol/l，ph6.5～9.5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行的。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述催化反應(yīng)的溫度可為20-40℃；所述催化反應(yīng)的時(shí)間可為0.5-28h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明通過定點(diǎn)突變技術(shù)對頭孢菌素C?；高M(jìn)行改造，得到對頭孢菌素C酶活提高且具有底物特異性的突變體。本發(fā)明獲得的突變體對頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化率比出發(fā)酶高1.2?3倍；對去乙酰氧基頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化率比出發(fā)酶低28?20倍；其對去乙酰基頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化率比出發(fā)酶低10?15倍。因此本發(fā)明提供的突變體能高效特異的催化底物頭孢菌素C生成7?氨基頭孢烷酸，且具有反應(yīng)溫和、操作簡單、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：孫周通,袁波,蘭金,曲戈
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19