本發(fā)明涉及杏仁加工。具體地說是具有降壓和降血糖效果的多肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-i?convert?ing?enzyme，ace)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，能夠催化血管緊張素i(angiotensin?i)轉(zhuǎn)化為血管緊張素i?i(angiotensin?i?i)，后者是一種強(qiáng)效的血管收縮劑，能顯著增加血壓。ace還參與降解緩激肽(bradykinin)，后者具有擴(kuò)血管作用。因此，ace的活性直接影響血壓調(diào)節(jié)。抑制ace的活性是治療高血壓的重要途徑，ace抑制劑因此被廣泛應(yīng)用于抗高血壓藥物的開發(fā)。

2、目前，市場(chǎng)上已存在多種ace抑制劑，如替普羅肽等，這些化合物在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著的ace抑制活性，能夠有效降低血壓。此外，基于食源性肽的天然ace抑制劑因其較少的副作用和良好的生物相容性，受到了廣泛關(guān)注。研究表明，一些天然存在的多肽具有較強(qiáng)的ace抑制活性，可作為開發(fā)新型抗高血壓藥物的潛在候選物。

3、盡管現(xiàn)有的ace抑制劑如替普羅肽在降壓方面具有顯著效果，但針對(duì)同時(shí)具有降壓和降血糖雙重功效的多肽類藥物的研究尚顯不足。此外，現(xiàn)有技術(shù)中的多肽藥物可能存在制備工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、生物利用度低等問題，限制了其臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供具有降壓和降血糖效果的多肽及其制備方法和應(yīng)用，所述多肽不僅能夠有效抑制ace活性，降低血壓，還能通過抑制dpp4的活性調(diào)節(jié)血糖水平，且制備方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，生物活性高。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種具有降血壓和降血糖效果的多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq?id?no.1、或者seq?id?no.3、或者seq?id?no.4、或者seq?id?no.5、或者seq?id?no.6、或者seq?idno.8、或者seq?id?no.9、或者seq?id?no.10所示。

4、上述的多肽，氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽和seq?id?no.8所示的多肽均為具有降血壓效果的多肽，氨基酸序列如seq?id?no.10所示的多肽為具有降血糖效果的多肽。

5、上述的多肽的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將所述多肽中的任一種用于制造具有降血壓和/或降血糖功能的藥物。

6、上述的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將氨基酸序列如seq?id?no.1或者seq?id?no.8所示的多肽用于制造具有降血壓功能的藥物，將氨基酸序列如seq?id?no.10所示的多肽用于制造具有降血糖功能的藥物。

7、多肽的制備方法，包括以下步驟：

8、s1、杏仁脫苦脫皮并破碎，然后進(jìn)行亞臨界脫脂，得到脫脂杏仁粉；

9、s2、使用流動(dòng)的水對(duì)脫脂杏仁粉進(jìn)行除雜；

10、s3、將除雜后的脫脂杏仁粉進(jìn)行堿溶，而后除去不溶物，對(duì)溶液進(jìn)行酸沉，對(duì)酸沉得到的沉淀進(jìn)行洗滌和干燥，得到杏仁蛋白粉；

11、s4、使用蛋白酶水解杏仁蛋白粉，得到杏仁蛋白水解物；

12、s5、對(duì)杏仁蛋白水解物進(jìn)行純化和冷凍干燥，得到上述的多肽。

13、上述的制備方法，在步驟s1中，亞臨界脫脂時(shí)使用的溶劑為丁烷；在步驟s2中，除雜時(shí)，使用流動(dòng)的水對(duì)脫脂杏仁粉進(jìn)行超濾；超濾時(shí)使用的超濾膜為3kda超濾膜，超濾時(shí)的水溫為4～10℃，超濾時(shí)間為22～26小時(shí)。使用丁烷作為亞臨界脫脂溶劑可有效去除杏仁中的脂肪，保留蛋白質(zhì)，為后續(xù)的水解提供高效基質(zhì)。使用3kda超濾膜在4～10℃下超濾，有助于除去雜質(zhì)，保留目標(biāo)蛋白質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性。

14、上述的制備方法，在步驟s3中，堿溶時(shí)，脫脂杏仁粉與堿溶反應(yīng)體系的質(zhì)量/體積比為1g：(15～20)ml，堿溶反應(yīng)體系的ph為8.8～9.5，堿溶時(shí)間為1～3小時(shí)；酸沉?xí)r使用的酸為鹽酸，鹽酸的濃度為8～12mo?l/l，酸沉反應(yīng)體系的ph為3.3～4.7。堿溶的ph、反應(yīng)時(shí)間和質(zhì)量/體積比影響蛋白質(zhì)的溶解度和結(jié)構(gòu)，鹽酸的濃度和酸沉ph調(diào)控蛋白質(zhì)的沉淀效率和產(chǎn)物純度，影響最終多肽的純度。

15、上述的制備方法，在步驟s4中，使用木瓜蛋白酶對(duì)杏仁蛋白粉進(jìn)行水解；水解反應(yīng)體系中，杏仁蛋白粉的濃度為30～50mg/ml，木瓜蛋白酶的用量與杏仁蛋白粉的質(zhì)量之比為18000～20000u/g；水解反應(yīng)體系的ph為6.5～7.2，水解反應(yīng)的溫度為55～65℃，水解反應(yīng)的時(shí)間為3～4小時(shí)。在利用蛋白酶水解蛋白質(zhì)制備多肽時(shí)，酶的種類、用量和水解條件對(duì)產(chǎn)物多肽序列有顯著影響。不同的酶的特異性一般不同，且酶用量影響也會(huì)影響蛋白質(zhì)的降解程度，較高濃度酶將加速酶解反應(yīng)，并產(chǎn)生更短的肽。水解條件如ph、溫度和時(shí)間等會(huì)影響酶的活性。在上述條件下，使用木瓜蛋白酶水解杏仁蛋白粉，能夠制得具有降壓和降血糖效果的多肽。

16、上述的制備方法，水解反應(yīng)體系中，杏仁蛋白粉的濃度為40mg/ml，木瓜蛋白酶的用量與杏仁蛋白粉的質(zhì)量之比為20000u/g；水解反應(yīng)體系的ph為6.5，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為220分鐘。

17、上述的制備方法，在步驟s5中，對(duì)杏仁蛋白水解物進(jìn)行純化時(shí)，使用超濾除去杏仁蛋白水解物中分子量小于3kda的組分，而后對(duì)余留組分依次進(jìn)行凝膠色譜純化和反向色譜分離純化。

18、本發(fā)明的技術(shù)方案取得了如下有益的技術(shù)效果：

19、1、本發(fā)明提供了同時(shí)具有降血壓和降血糖效果的多肽，并通過分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)測(cè)試了這些多肽與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ace和二肽基肽酶-ⅳdpp4的結(jié)合能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些多肽能夠與ace和dpp4的活性位點(diǎn)結(jié)合，這表明這些多肽能夠抑制ace和dpp4的活性，發(fā)揮降血壓和降血糖的功能。抑制率測(cè)試實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了，ylsf和wnprdpq能夠抑制ace和dpp4的活性，hlpl能夠抑制dpp4的活性，且結(jié)合能測(cè)試結(jié)果顯示，這三種多肽與ace和dpp4的結(jié)合均較為穩(wěn)定。

20、2、本發(fā)明提供的多肽能夠與ace、dpp4和其他的一些與調(diào)節(jié)血壓和調(diào)節(jié)血糖有關(guān)的酶發(fā)生相互作用，本發(fā)明為開發(fā)新型治療高血壓、糖尿病等疾病的藥物提供了新的策略，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種具有降血壓和降血糖效果的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如seqid?no.1、或者seq?id?no.3、或者seq?id?no.4、或者seq?id?no.5、或者seq?id?no.6、或者seq?id?no.8、或者seq?id?no.9、或者seq?id?no.10所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽和seq?id?no.8所示的多肽均為具有降血壓效果的多肽，氨基酸序列如seq?id?no.10所示的多肽為具有降血糖效果的多肽。

3.多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1或2所述多肽中的任一種用于制造具有降血壓和/或降血糖功能的藥物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為將氨基酸序列如seq?id?no.1或者seq?id?no.8所示的多肽用于制造具有降血壓功能的藥物，將氨基酸序列如seq?idno.10所示的多肽用于制造具有降血糖功能的藥物。

5.多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟s1中，亞臨界脫脂時(shí)使用的溶劑為丁烷；在步驟s2中，除雜時(shí)，使用流動(dòng)的水對(duì)脫脂杏仁粉進(jìn)行超濾；超濾時(shí)使用的超濾膜為3kda超濾膜，超濾時(shí)的水溫為4～10℃，超濾時(shí)間為22～26小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟s3中，堿溶時(shí)，脫脂杏仁粉與堿溶反應(yīng)體系的質(zhì)量/體積比為1g：(15～20)ml，堿溶反應(yīng)體系的ph為8.8～9.5，堿溶時(shí)間為1～3小時(shí)；酸沉?xí)r使用的酸為鹽酸，鹽酸的濃度為8～12mol/l，酸沉反應(yīng)體系的ph為3.3～4.7。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟s4中，使用木瓜蛋白酶對(duì)杏仁蛋白粉進(jìn)行水解；水解反應(yīng)體系中，杏仁蛋白粉的濃度為30～50mg/ml，木瓜蛋白酶的用量與杏仁蛋白粉的質(zhì)量之比為18000～20000u/g；水解反應(yīng)體系的ph為6.5～7.2，水解反應(yīng)的溫度為55～65℃，水解反應(yīng)的時(shí)間為3～4小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，水解反應(yīng)體系中，杏仁蛋白粉的濃度為40mg/ml，木瓜蛋白酶的用量與杏仁蛋白粉的質(zhì)量之比為20000u/g；水解反應(yīng)體系的ph為6.5，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為220分鐘。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟s5中，對(duì)杏仁蛋白水解物進(jìn)行純化時(shí)，使用超濾除去杏仁蛋白水解物中分子量小于3kda的組分，而后對(duì)余留組分依次進(jìn)行凝膠色譜純化和反向色譜分離純化。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開具有降壓和降血糖效果的多肽及其制備方法和應(yīng)用。具有降血壓和降血糖效果的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1、或者SEQ?ID?NO.3、或者SEQ?ID?NO.4、或者SEQ?ID?NO.5、或者SEQ?ID?NO.6、或者SEQ?ID?NO.8、或者SEQ?ID?NO.9、或者SEQ?ID?NO.10所示。多肽的應(yīng)用，用于制造具有降血壓和降血糖功能的藥物。本發(fā)明還公開具有降壓和降血糖效果的多肽的制備方法。本發(fā)明提供的多肽不僅能夠有效抑制ACE活性，降低血壓，還能通過抑制DPP4的活性調(diào)節(jié)血糖水平，且制備方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，生物活性高。

技術(shù)研發(fā)人員：朱緒春,劉紅芝,李鑫昕,王彥波,嚴(yán)超,周麟依
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京工商大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17