本發(fā)明涉及用于檢測肽鍵水解酶的熒光探針。

背景技術：

1、利用微型裝置進行單酶水平的酶活性檢測方法已被廣泛應用于明確酶的單個生化參數(shù)、利用單個生化參數(shù)作為報告蛋白高靈敏度地檢測特定蛋白的存在等目的。

2、本發(fā)明人的研究小組迄今已利用一組微型裝置兼容的酶熒光探針進行活性檢測，在單分子水平上進行了基于血液中酶的檢測和活性的剖析，并發(fā)現(xiàn)了與疾病新的相關性。

3、另一方面，在利用微型裝置進行單酶水平的酶活性檢測方法中，通過充分稀釋生物樣品并將生物樣品加入到微型裝置中，可以形成在一個孔中存在一分子或更少酶的狀態(tài)，并且所謂的多色分析，其中酶之間具有不同反應性的多種顏色的熒光探針同時反應，測量各孔中多種波長的熒光增加，并從其組合中指定孔中的酶，理論上是可行的。

4、然而，作為可用于利用微型裝置的酶活性檢測方法的熒光探針，尚未發(fā)現(xiàn)可實際使用的發(fā)出紅色熒光的探針(紅色熒光探針)或發(fā)出綠色熒光的探針(綠色熒光探針)。

技術實現(xiàn)思路

1、技術問題

2、本發(fā)明的目的是提供可用于酶活性檢測方法的熒光探針。

3、技術問題的解決方案

4、本發(fā)明人為解決上述技術問題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，通過在具有羅丹明骨架的化合物中引入特定的水溶性取代基，并進一步將該化合物的logp值設定在特定范圍內(nèi)，可以提供一種也可用于利用微型裝置的酶活性檢測方法的熒光探針，從而完成了本發(fā)明。

5、根據(jù)本發(fā)明，提供了以下發(fā)明。

6、[1]

7、用于檢測水解酶的熒光探針，所述熒光探針包含具有至少一個選自由-co2h、-po3h2和-so3h組成的組的水溶性取代基且由以下通式(ii)表示的化合物或其鹽：

8、[化學式1]

9、

10、其中環(huán)a是芳香環(huán)，其是苯基或5或6元雜芳基；

11、環(huán)q1是以下式(i)或(ii)的環(huán)結構，

12、[化學式2]

13、

14、其中r2、r4、r6和r0如下定義；

15、環(huán)q2是以下式(iii)、(iv)、(v)或(vi)的環(huán)結構，

16、[化學式3]

17、

18、其中r3、r5、r7、r8、r9、r10和r11如下定義；

19、在含x原子的環(huán)結構中，表示為1的鍵和表示為2的鍵各自代表單鍵或雙鍵，條件是這兩個鍵不能同時代表雙鍵；

20、r選自由-co2h、-po3h2、-so3h、-l-co2h、-l-po3h2和-l-so3h組成的組，其中l(wèi)是接頭；

21、n是0至5的整數(shù)；

22、r1代表芳香環(huán)上任選地存在的一價取代基，其中當存在兩個或更多個一價取代基時，所述取代基可以相同或不同，

23、其中r1與r1所鍵合的環(huán)a上的碳原子、環(huán)a所鍵合的含x原子的環(huán)結構上的碳原子以及環(huán)a的一部分可形成5或6元碳環(huán)或雜環(huán)；

24、r2和r3各自獨立地為氫原子、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基、鹵素原子、水溶性取代基，或具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基；

25、r4和r5各自獨立地為氫原子、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基、鹵素原子、水溶性取代基，或具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基；

26、r6和r7各自獨立地為氫原子、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基、鹵素原子、水溶性取代基，或具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基；

27、r8和r9各自獨立地為氫原子，具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基，具有1至6個碳原子的取代或未取代的烯基，具有水溶性取代基且具有1至10個碳原子、優(yōu)選1至6個碳原子的烷基(該烷基可被芳基取代，并且該芳基可被水溶性取代基取代)，或具有水溶性取代基且具有1至10個碳原子、優(yōu)選1至6個碳原子的烯基(該烯基可被芳基取代，并且該芳基可被水溶性取代基取代)，

28、其中r8和r9可一起形成4至7元雜環(huán)基，所述雜環(huán)基可含有氮原子，r8和r9與所述氮原子連接并且可具有取代基，

29、r8或r9，或r8和r9兩者，與r5或r7一起，各自可形成含有氮原子的5至7元雜環(huán)基或雜芳基，r8或r9與所述氮原子連接，并且進一步，所述雜環(huán)基或雜芳基可具有選自由以下組成的組的取代基：具有1至6個碳原子的烷基、具有2至6個碳原子的烯基、具有2至6個碳原子的炔基、具有6至10個碳原子的芳基烷基和具有6至10個碳原子的烷基取代烯基，

30、水溶性取代基可以直接或通過取代基鍵合到這些雜環(huán)基和雜芳基上；

31、r11是氫原子，具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基，具有1至6個碳原子的取代或未取代的烯基，具有水溶性取代基且具有1至10個碳原子、優(yōu)選1至6個碳原子的烷基(該烷基可被芳基取代，并且該芳基可被水溶性取代基取代)，或具有水溶性取代基且具有1至10個碳原子、優(yōu)選1至6個碳原子的烯基(該烯基可被芳基取代，并且該芳基可被水溶性取代基取代)；

32、x選自氧原子、si(ra)(rb)、c(ra)(rb)、p(＝o)rc、s(rd)2、ge(ra)(rb)、碲原子或鉍原子，

33、其中ra和rb各自獨立地為具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基，

34、rc是具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基，或取代或未取代的苯基，

35、rd是相同或不同的取代或未取代的芳基，

36、ra、rb、rc和rd的烷基、芳基和苯基可被水溶性取代基取代；以及

37、r0和r10各自獨立地選自氨基酸的部分結構、羧酸的部分結構、t-o-、或飽和或不飽和的5或6元碳環(huán)或雜環(huán)基團，

38、其中氨基酸的部分結構與r0或r10所鍵合的c＝o一起構成氨基酸、氨基酸殘基、肽或氨基酸的一部分，

39、羧酸的部分結構與r0或r10所鍵合的c＝o一起構成羧酸的一部分，

40、t是糖、糖的部分結構或具有自裂解接頭的糖，以及

41、t的糖的部分結構與t所鍵合的o一起構成糖或糖的一部分。

42、[2]

43、根據(jù)[1]所述的熒光探針，其中q2代表式(iii)的環(huán)結構。

44、[3]

45、根據(jù)[1]所述的熒光探針，其中q2代表式(iv)、(v)或(vi)的環(huán)結構。

46、[4]

47、根據(jù)[1]至[3]中任一項所述的熒光探針，其中n為1至3。

48、[5]

49、根據(jù)[1]至[4]中任一項所述的熒光探針，其中r2至r9以及ra、rb、rc和rd中的至少一個是水溶性取代基、具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基、具有水溶性取代基的芳基以及具有水溶性取代基的苯基。

50、[6]

51、根據(jù)[1]至[5]中任一項所述的熒光探針，其中x是氧原子或si(ra)(rb)。

52、[7]

53、根據(jù)[1]至[6]中任一項所述的熒光探針，其中r是-so3h或-l-so3h。

54、[8]

55、根據(jù)[1]至[7]中任一項所述的熒光探針，其中所述水解酶是選自氨肽酶、肽酶、蛋白酶或酰胺酶的肽鍵水解酶。

56、[9]

57、根據(jù)[1]至[8]中任一項所述的熒光探針，其中所述化合物或其鹽的milogp值為2.56或更低。

58、[10]

59、根據(jù)[1]至[8]中任一項所述的熒光探針，其中所述化合物或其鹽的熒光母核的milogp值小于2.47。

60、[11]

61、根據(jù)[1]至[8]中任一項所述的熒光探針，其中所述化合物或其鹽的milogp值為2.56或更低，且所述化合物或其鹽的熒光母核的milogp值小于2.47。

62、[12]

63、根據(jù)[1]至[11]中任一項所述的熒光探針，其是用于微型裝置的熒光探針。

64、[13]

65、根據(jù)[1]至[12]中任一項所述的熒光探針，其中通式(ii)表示的化合物或其鹽是以下通式(ia)至(ie)中任一項表示的化合物或其鹽：

66、[化學式4]

67、

68、

69、其中r4至r9、ra、rb和r0如通式(ii)所定義。

70、[14]

71、根據(jù)[1]至[13]中任一項所述的熒光探針，其中通式(ii)表示的化合物或其鹽是以下通式(if)表示的化合物或其鹽：

72、[化學式5]

73、

74、其中r4至r9和r0如通式(ii)所定義。

75、[15]

76、根據(jù)[1]至[14]中任一項所述的熒光探針，其中所述化合物或其鹽是選自下列化合物的化合物或其鹽：

77、[化學式6]

78、

79、[16]

80、用于診斷胰腺癌的方法或用于預測生物樣品所來源的測試受試者患有胰腺癌的可能性的方法，所述方法包括使用根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中cd13的單分子酶活性，其中-co-r0和任選的-co-r10是通式(ii)中的丙氨酸、賴氨酸、精氨酸或甲硫氨酸殘基。

81、[17]

82、用于診斷胰腺癌的方法或用于預測生物樣品所來源的測試受試者患有胰腺癌的可能性的方法，所述方法包括使用根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中dpp4的單分子酶活性，其中-co-r0和任選的-co-r10是通式(ii)中的-pro-xaa(pro代表脯氨酸殘基，xaa代表氨基酸殘基，如甘氨酸、絲氨酸或谷氨酸)。

83、[18]

84、用于診斷胰腺癌的方法或用于預測生物樣品所來源的測試受試者患有胰腺癌的可能性的方法，所述方法包括：

85、使用根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中cd13的單分子酶活性，其中-co-r0和任選的-co-r10是通式(ii)中的丙氨酸、賴氨酸、精氨酸或甲硫氨酸殘基；以及

86、使用根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中dpp4的單分子酶活性，其中-co-r0和任選的-co-r10是通式(ii)中的-pro-xaa(pro代表脯氨酸殘基，xaa代表氨基酸殘基，如甘氨酸、絲氨酸或谷氨酰胺)。

87、[19]

88、根據(jù)[16]至[18]中任一項所述的方法，其中所述生物樣品是胰腺癌患者、疑似患有胰腺癌的患者或健康受試者的生物樣品。

89、[20]

90、下式(1)至(5)中任一項表示的化合物或其鹽：

91、[化學式7]

92、

93、其中

94、r0選自氨基酸的部分結構、羧酸的部分結構或t-o-，

95、其中氨基酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成氨基酸、氨基酸殘基、肽或氨基酸的一部分，

96、羧酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成羧酸的一部分，

97、t是糖、糖的部分結構或具有自裂解接頭的糖，以及

98、t的糖的部分結構與t所鍵合的o一起構成糖或糖的一部分。

99、[21]

100、下式(6)表示的化合物或其鹽：

101、[化學式8]

102、

103、其中

104、r0選自氨基酸的部分結構、羧酸的部分結構或t-o-，

105、其中氨基酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成氨基酸、氨基酸殘基、肽或氨基酸的一部分，

106、羧酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成羧酸的一部分，

107、t是糖、糖的部分結構或具有自裂解接頭的糖，以及

108、t的糖的部分結構與t所鍵合的o一起構成糖或糖的一部分。

109、[22]

110、根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的熒光探針，其中在密封油中的溶解度測量測試(25℃)中，所述化合物或其鹽在十六烷中的溶解度為0.3μm或更小。

111、[23]

112、根據(jù)[1]至[15]和[22]中任一項所述的熒光探針，其中在微型裝置中的熒光強度測量測試中，所述化合物或其鹽的酶解物的孔邊緣區(qū)域的熒光強度與孔中心區(qū)域的熒光強度的比值為0.6或更小。

113、[24]

114、根據(jù)[1]至[15]、[22]和[23]中任一項所述的熒光探針，其中在熒光探針在微型裝置和比色皿中的酶解測試中，所述化合物或其鹽的酶解物在微型裝置中的信噪比(第一比值)與酶解物在比色皿中的信噪比(第二比值)的比值為0.4或更大。

115、[101]

116、以下通式(iii)表示的化合物或其鹽用于生產(chǎn)根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的化合物或其鹽的用途：

117、[化學式9]

118、

119、其中環(huán)a、環(huán)q2、x、n、r、r1、r2、r4和r6如通式(ii)所定義，鍵代表單鍵或雙鍵。

120、[102]

121、以下通式(iv)表示的化合物或其鹽用于生產(chǎn)根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的化合物或其鹽的用途：

122、[化學式10]

123、

124、其中環(huán)a、x、n、r和r1至r9如通式(ii)所定義。

125、[103]

126、以下通式(v)表示的化合物或其鹽：

127、[化學式11]

128、

129、其中

130、環(huán)a、r、r8和r9如通式(ii)所定義，

131、n是1或2，

132、r1是氫原子、具有1至4個碳原子的未取代烷基、或被羥基取代且具有1至4個碳原子的烷基，

133、r2至r7是氫原子，

134、r8和r9各自獨立地為氫原子或具有1至4個碳原子的取代或未取代的烷基，以及

135、x是氧原子或si(ra)(rb)(ra和rb如式(ii)所定義)。

136、[104]

137、根據(jù)[103]所述的化合物或其鹽，其是選自下列化合物的化合物或其鹽：

138、[化學式12]

139、

140、[105]

141、根據(jù)[103]或[104]所述的化合物或其鹽用于生產(chǎn)根據(jù)[1]至[15]中任一項的化合物或其鹽的用途。

142、[201]

143、選擇熒光探針的方法，所述方法包括：

144、制備根據(jù)[1]至[15]中任一項所述的熒光探針；以及

145、選擇滿足以下條件的熒光探針：(a)在密封油中的溶解度測量測試(25℃)中，熒光探針及其酶解物在十六烷中的溶解度為0.3μm或更小；(b)在微型裝置中的熒光強度測量測試中，熒光探針的酶解物的孔邊緣區(qū)域的熒光強度與孔中心區(qū)域的熒光強度的比值為0.6或更小，并且(c)在微型裝置和比色皿中的熒光探針酶解測試中，微型裝置中的酶解物的信噪比(第一比值)與比色皿中的酶解物的信噪比(第二比值)的比值為0.4或更大。

146、根據(jù)本發(fā)明，還提供了以下發(fā)明。

147、[301]

148、用于檢測微型裝置的水解酶的熒光探針，所述熒光探針包含具有至少一個選自由-co2h、-po3h2和-so3h組成的組的水溶性取代基且由以下通式(i)表示的化合物或其鹽：

149、[化學式13]

150、

151、其中

152、[化學式14]

153、

154、是芳香環(huán)，其是苯基或5或6元雜芳基；

155、r選自由-co2h、-po3h2、-so3h、-l-co2h、-l-po3h2和-l-so3h組成的組，其中l(wèi)是接頭；

156、n是0至5的整數(shù)；

157、r1代表芳香環(huán)上任選地存在的一價取代基，其中當存在兩個或更多個一價取代基時，所述取代基可以相同或不同，

158、r2和r3各自獨立地為氫原子、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基、鹵素原子、水溶性取代基，或具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基；

159、r4和r5各自獨立地為氫原子、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基、鹵素原子、水溶性取代基，或具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基；

160、r6和r7各自獨立地為氫原子、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基、鹵素原子、水溶性取代基，或具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基；

161、r8和r9各自獨立地為氫原子、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基、具有1至6個碳原子的取代或未取代的烯基、具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基、或具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烯基，

162、其中r8和r9可一起形成4至7元雜環(huán)基，所述雜環(huán)基可含有氮原子，r8和r9與所述氮原子連接并且可具有取代基，

163、r8或r9，或r8和r9兩者，與r5或r6一起，各自可形成含有氮原子的5至7元雜環(huán)基或雜芳基，r8或r9與所述氮原子連接，并且進一步，所述雜環(huán)基或雜芳基可具有選自由以下組成的組的取代基：具有1至6個碳原子的烷基、具有2至6個碳原子的烯基、具有2至6個碳原子的炔基、具有6至10個碳原子的芳基烷基和具有6至10個碳原子的烷基取代烯基，

164、水溶性取代基可以直接或通過取代基鍵合到這些雜環(huán)基和雜芳基上；

165、x選自氧原子、si(ra)(rb)、c(ra)(rb)、p(＝o)rc、s(rd)2、ge(ra)(rb)、碲原子或鉍原子，

166、其中ra和rb各自獨立地為具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基，

167、rc是具有1至6個碳原子的取代或未取代的烷基，或取代或未取代的苯基，

168、rd是相同或不同的取代或未取代的芳基，

169、ra、rb、rc和rd的烷基、芳基和苯基可被水溶性取代基取代；以及

170、r0選自氨基酸的部分結構、羧酸的部分結構或t-o-，

171、其中氨基酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成氨基酸、氨基酸殘基、肽或氨基酸的一部分，

172、羧酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成羧酸的一部分，

173、t是糖、糖的部分結構或具有自裂解接頭的糖，以及

174、t的糖的部分結構與t所鍵合的o一起構成糖或糖的一部分，

175、所述化合物或其鹽的logp值為1.09或更低。

176、[302]

177、根據(jù)[301]所述的熒光探針，其中n為1至3。

178、[303]

179、根據(jù)[301]或[302]中任一項所述的熒光探針，其中r2至r9以及ra、rb、rc和rd中至少一個是水溶性取代基、具有水溶性取代基且具有1至6個碳原子的烷基、具有水溶性取代基的芳基以及具有水溶性取代基的苯基。

180、[304]

181、根據(jù)[301]至[303]中任一項所述的熒光探針，其中x是氧原子或si(ra)(rb)。

182、[305]

183、根據(jù)[302]所述的熒光探針，其中r是-so3h或-l-so3h。

184、[306]

185、根據(jù)[301]至[305]中任一項所述的熒光探針，其中所述水解酶是選自氨肽酶、肽酶、蛋白酶或酰胺酶的肽鍵水解酶。

186、[307]

187、根據(jù)[301]至[306]中任一項所述的熒光探針，其中通式(i)表示的化合物或其鹽是以下通式(ia)至(ie)中任一項表示的化合物或其鹽：

188、[化學式15]

189、

190、其中r4至r9、ra、rb和r0如通式(i)所定義。

191、[308]

192、根據(jù)[301]至[307]中任一項所述的熒光探針，其中通式(i)表示的化合物或其鹽是以下通式(if)表示的化合物或其鹽：

193、[化學式16]

194、

195、其中r4至r9和r0如通式(i)所定義。

196、[309]

197、用于診斷胰腺癌的方法，所述方法包括使用根據(jù)[301]至[308]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中cd13的單分子酶活性，其中-co-r0是通式(i)中的丙氨酸、賴氨酸、精氨酸或甲硫氨酸殘基。

198、[310]

199、用于診斷胰腺癌的方法，所述方法包括使用根據(jù)[301]至[308]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中dpp4的單分子酶活性，其中-co-r0為通式(i)中的-pro-xaa(pro代表脯氨酸殘基，xaa代表氨基酸殘基，如甘氨酸、絲氨酸或谷氨酸)。

200、[311]

201、用于診斷胰腺癌的方法，所述方法包括：

202、使用根據(jù)[301]至[308]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中cd13的單分子酶活性，其中-co-r0是通式(i)中的丙氨酸、賴氨酸、精氨酸或甲硫氨酸殘基；以及

203、使用根據(jù)[301]至[308]中任一項所述的熒光探針，通過微型裝置檢測從受試者獲得的生物樣品中dpp4的單分子酶活性，其中-co-r0是通式(i)中的-pro-xaa(pro代表脯氨酸殘基，xaa代表氨基酸殘基，如甘氨酸、絲氨酸或谷氨酰胺)。

204、[312]

205、下式(1)至(5)中任一項表示的化合物或其鹽：

206、[化學式17]

207、

208、

209、其中

210、r0選自氨基酸的部分結構、羧酸的部分結構或t-o-，

211、其中氨基酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成氨基酸、氨基酸殘基、肽或氨基酸的一部分，

212、羧酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成羧酸的一部分，

213、t是糖、糖的部分結構或具有自裂解接頭的糖，以及

214、t的糖的部分結構與t所鍵合的o一起構成糖或糖的一部分。

215、[313]

216、下式(6)表示的化合物或其鹽：

217、[化學式18]

218、

219、其中

220、r0選自氨基酸的部分結構、羧酸的部分結構或t-o-，

221、其中氨基酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成氨基酸、氨基酸殘基、肽或氨基酸的一部分，

222、羧酸的部分結構與r0所鍵合的c＝o一起構成羧酸的一部分，

223、t是糖、糖的部分結構或具有自裂解接頭的糖，以及

224、t的糖的部分結構與t所鍵合的o一起構成糖或糖的一部分。

225、本發(fā)明的技術效果

226、根據(jù)本發(fā)明，可以提供可用于酶活性檢測方法的紅色熒光探針和綠色熒光探針，本發(fā)明的優(yōu)點特別在于這些熒光探針可用于使用微型裝置的酶活性檢測方法。

227、本發(fā)明的熒光探針可有效用于檢測胰腺癌等。

228、例如，根據(jù)本發(fā)明，通過使用本發(fā)明的熒光探針，可以提供通過檢測血液中dpp4的單分子酶活性和檢測血液中cd13的單分子酶活性來診斷胰腺癌的方法。