本公開和發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域。特別地，本公開和發(fā)明涉及一種檢測靶核酸分子中靶核酸序列的方法，所述方法在2-階段rca反應(yīng)使用掛鎖探針和滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircle?amplification，rca)，即所謂的超級rca(superrca,srca))中產(chǎn)生第二代rca產(chǎn)物，通過所述方法可以檢測靶核酸序列并將其與其他核酸序列區(qū)分開。所述方法利用不對稱pcr技術(shù)，并且可以多重進(jìn)行以檢測一個或多個靶核酸分子中不同的多個靶核酸序列。還提供了用于所述方法的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、靶核酸序列的檢測可應(yīng)用于許多不同的領(lǐng)域，特別是臨床上，用于個性化醫(yī)學(xué)和疾病的診斷、預(yù)后和/或治療，例如癌癥、傳染病和遺傳性或基因性疾病，以及研究和生物安全。

2、使用標(biāo)記的雜交探針可以容易地檢測靶核酸序列，但是簡單的雜交探針具有相對較高的檢測下限，并且不能容易地用于區(qū)分相似的核酸序列。為了提高靈敏度，通常可以擴(kuò)增含有靶序列的靶核酸分子，以增加可用于檢測的靶序列的量。本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)中的任何一種都可以用于擴(kuò)增，包括pcr和rca。

3、pcr當(dāng)然是一種眾所周知的核酸檢測技術(shù)，用于使用兩種引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增以產(chǎn)生線性擴(kuò)增產(chǎn)物。雖然在核酸檢測的背景下pcr被廣泛使用，但其也有如下缺點(diǎn)：擴(kuò)增子包含靶核酸分子的正向和反向鏈，其中只有正向鏈包含所需的靶核酸序列，因此擴(kuò)增子必須變性以分離雙鏈并允許探針與靶核酸序列雜交。此外，在pcr期間，由聚合酶引入的錯誤會被放大，并且隨著pcr循環(huán)次數(shù)的增加，聚合酶錯誤率也增加。雖然在許多應(yīng)用中這是可以容忍的，但是當(dāng)pcr用于檢測變體序列，例如突變特別是僅在個別核苷酸上不同的那些，尤其當(dāng)這些變體是低頻或低豐度時，這是一個特殊的問題。

4、不對稱pcr是pcr的一種變體，也是本領(lǐng)域眾所周知的，通常用于優(yōu)先擴(kuò)增核酸分子的一條鏈而不是另一條鏈。引物以不等摩爾比例如10:1加入，以偏向于所需鏈的合成。因此，與非所需鏈的引物(限制性引物)相比，所需鏈的引物非常過量，這種不平衡導(dǎo)致了兩個階段的擴(kuò)增。第一階段是指數(shù)的，并且類似于常規(guī)pcr，產(chǎn)生包含兩條鏈的擴(kuò)增子。這一初始階段在消耗了非所需鏈的引物后結(jié)束，隨后是第二階段，其使用所述鏈的過量引物選擇性擴(kuò)增所需鏈，構(gòu)成不對稱pcr的線性階段。這一階段具有較低的反應(yīng)效率，這是由于限制性引物的解鏈溫度因其較低的濃度而降低到最佳反應(yīng)退火溫度以下，并且需要額外的循環(huán)以產(chǎn)生合理產(chǎn)量的擴(kuò)增子。

5、指數(shù)后線性(linear-after-the-exponential,late)-pcr是為了解決不對稱pcr面臨的效率和產(chǎn)率問題而開發(fā)的，并且因為限制性引物濃度在反應(yīng)中期降低，其利用具有比過量引物更高解鏈溫度的限制性引物來維持反應(yīng)效率。wo2016/184902中描述了一種方法，其中，線性不對稱增量聚合酶反應(yīng)(asymmetric?incremental?polymerase?reaction,aipr)之后是指數(shù)pcr。這是為了通過減少pcr早期循環(huán)中的聚合酶錯誤率，從而減少假陽性信號來提高檢測低豐度突變dna序列的準(zhǔn)確性。最初的aipr發(fā)生在高退火溫度下，而后的指數(shù)pcr發(fā)生在較低的退火溫度下，兩個階段都在分區(qū)反應(yīng)例如液滴數(shù)字pcr中進(jìn)行。

6、rca使用鏈置換聚合酶，并需要環(huán)狀擴(kuò)增模板。環(huán)形模板的擴(kuò)增提供了串聯(lián)的rca產(chǎn)物，其包含與擴(kuò)增模板互補(bǔ)的序列的多個拷貝。這種多聯(lián)體通常會形成一個球或“斑點(diǎn)”,其可以容易地被可視化和檢測，因此基于rca的檢測已經(jīng)被用于核酸的檢測，實(shí)際上，更廣泛地作為報告系統(tǒng)用于任何靶分析物的檢測。兩種靶核酸分析物(其本身可以被直接環(huán)化)、探針或報告核酸更廣泛地可以為rca提供模板核酸環(huán)。

7、核酸檢測方法的特異性可以通過使用需要雙重識別或靶核酸序列有兩個結(jié)合位點(diǎn)的探針(例如掛鎖探針)來改善。掛鎖探針通常是線性寡核苷酸，具有兩個獨(dú)立的靶互補(bǔ)結(jié)合區(qū)，通過中間的“骨架”區(qū)連接。當(dāng)探針與靶核酸序列結(jié)合(雜交)后，探針的兩端可連接在一起使探針環(huán)化，在連接位點(diǎn)周圍6bp內(nèi)具有單核苷酸鑒別特異性。之后可以將環(huán)化的掛鎖探針用作rca反應(yīng)的模板，并且可以檢測rca產(chǎn)物。這形成了目前使用的許多檢測分析的基礎(chǔ)。因此，掛鎖探針提供了一層額外的特異性，因為只有在連接位點(diǎn)正確堿基配對的探針才會被連接以產(chǎn)生將被檢測的分子的模板。

8、已描述了基于rca的檢測，其依賴于初始rca產(chǎn)物的二級擴(kuò)增，以增加被檢測產(chǎn)物的量，從而在檢測中提供信號的擴(kuò)增。這些包括例如超支化rca，其通過鏈置換活性產(chǎn)生許多未成簇的后續(xù)rca產(chǎn)物。最近，所謂的“超級rca”(superrca,srca)反應(yīng)被開發(fā)，其包括兩輪或更多輪rca擴(kuò)增，其中第二rca反應(yīng)的產(chǎn)物與第一rca的產(chǎn)物相連。wo2014/0796209中描述了這種srca方法的一個版本。在該方法中，能夠提供引物或起引物作用的探針與初始rca產(chǎn)物雜交，并用于引發(fā)與“引物-探針”雜交的第二rca模板環(huán)的擴(kuò)增。第二rca模板可以通過與“引物-探針”雜交的掛鎖探針的環(huán)化產(chǎn)生。在wo?2015/071445中，描述了稱為“掛鎖srca”的一種替代srca方法，其中，掛鎖探針用于直接地與初始rca產(chǎn)物結(jié)合。

9、在許多應(yīng)用中，待檢測的核酸序列以低水平存在，例如在罕見突變、或者血漿中的無細(xì)胞dna(cfdna)或其他臨床樣本、或者在可獲得的樣本量有限的情況下。在這種情況下，需要非常靈敏的檢測方法，特別是能夠?qū)崿F(xiàn)靶核酸高度擴(kuò)增的方法。pct/ep2021/084061描述了在這方面特別有用的基于srca的檢測方法，其中，掛鎖探針與靶核酸序列結(jié)合，并經(jīng)歷間隙填充延伸和連接以產(chǎn)生靶核酸序列的許多環(huán)狀拷貝，其用作srca反應(yīng)的第一rca模板。

10、鑒于pcr作為一種擴(kuò)增方法的普遍性和便利性，我們一直致力于提供一種穩(wěn)定且易于自動化的檢測方法，其結(jié)合了pcr和srca，適用于檢測罕見變體。然而，pcr步驟中的聚合酶錯誤率仍然是一個需要解決的問題，因為它從整體上負(fù)面影響了測定的準(zhǔn)確性，例如，當(dāng)進(jìn)行大量指數(shù)pcr循環(huán)以產(chǎn)生用于rca反應(yīng)的環(huán)狀擴(kuò)增模板時。此外，擴(kuò)增子的非所需鏈通過與所需鏈競爭產(chǎn)生rca模板而降低了檢測的效率。

11、存在對具有改進(jìn)的效率和靈敏度的進(jìn)一步優(yōu)化的分析的持續(xù)需求。本公開和本發(fā)明旨在提供這樣一種方法。

12、簡述

13、在本方法中，不對稱pcr用于產(chǎn)生靶核酸序列的擴(kuò)增子，用于隨后的superrca(srca)反應(yīng)。使用具有不同解鏈溫度的引物改進(jìn)了不對稱pcr步驟，其包括在第一退火溫度下的指數(shù)pcr階段和在第二較高退火溫度下的線性擴(kuò)增階段以擴(kuò)增所需鏈。這兩個階段可以按先指數(shù)階段或后指數(shù)階段的任一順序進(jìn)行。為了提高本方法的準(zhǔn)確性，保持較低的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)以減少聚合酶錯誤的發(fā)生，特別是保持指數(shù)循環(huán)的低次數(shù)。將所需鏈的擴(kuò)增子連接成環(huán)，然后通過rca擴(kuò)增，產(chǎn)生含有靶序列的多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝的第一rca產(chǎn)物。然后用對靶序列的互補(bǔ)拷貝特異的掛鎖探針探測得到的第一rca產(chǎn)物。使用環(huán)狀掛鎖探針進(jìn)行進(jìn)一步的第二rca反應(yīng)，以產(chǎn)生第二(即二級)rca產(chǎn)物，該第二rca產(chǎn)物被檢測以檢測靶序列。

14、低次數(shù)的指數(shù)pcr循環(huán)的應(yīng)用，例如不超過12次，能夠減少擴(kuò)增子中聚合酶錯誤的積累，并通過減少假陽性或假陰性的數(shù)量使測定結(jié)果的準(zhǔn)確性提高。此外，當(dāng)線性階段位于指數(shù)階段之后，在線性擴(kuò)增階段之后所需鏈的單鏈擴(kuò)增子的積累使得雙鏈擴(kuò)增子變性成為任選的，以允許與連接模板雜交或接近連接酶。此外，由于減少了與所需鏈對連接模板或連接酶的競爭，非所需鏈的低產(chǎn)率提高了擴(kuò)增子連接步驟的效率。

15、因此，本發(fā)明第一方面提供了一種檢測樣本中靶核酸分子中靶核酸序列的方法，所述方法包括：

16、(a)使用一組引物進(jìn)行不對稱pcr反應(yīng)以產(chǎn)生靶序列的擴(kuò)增子，所述引物包括具有第一熔解溫度(tm)的第一引物和具有比第一tm低至少10℃的第二tm的第二引物，其中所述不對稱pcr反應(yīng)以任一順序包含：

17、(i)指數(shù)pcr階段，包括不超過12個的循環(huán)，其中引物在使用第一和第二引物

18、退火的第一退火溫度下退火；和

19、(ii)線性擴(kuò)增階段，其中引物在僅使得第一引物退火的更高的第二退火溫度下退火，并且擴(kuò)增僅一條鏈，從而優(yōu)先積累(或換句話說，擴(kuò)增)靶核酸序列的單鏈擴(kuò)增子；

20、

21、(b)將來自步驟(a)的單鏈擴(kuò)增子與包含連接酶的連接混合物接觸并連接擴(kuò)增子的5’和3’端以環(huán)化單鏈擴(kuò)增子；

22、(c)使用環(huán)化的擴(kuò)增子作為第一rca模板進(jìn)行第一rca反應(yīng)，以產(chǎn)生包含擴(kuò)增子中靶核酸序列的多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝的第一rca產(chǎn)物(rcp)；

23、(d)將第一rcp與對靶核酸序列特異的掛鎖探針接觸，并使得探針與多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝雜交；

24、(e)直接或間接連接雜交的掛鎖探針使雜交的掛鎖探針環(huán)化；

25、(f)使用環(huán)化掛鎖探針作為第二rca模板進(jìn)行第二rca反應(yīng)，以產(chǎn)生包含環(huán)化掛鎖探針的多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝的第二rcp；

26、其中步驟(d)至(f)可選地重復(fù)一或多次；和

27、(g)檢測第二或最終rcp以檢測環(huán)化掛鎖探針，從而檢測靶核酸序列。

28、第二rcp(也可稱為二級rcp)與它們所附著的第一rcp一起形成superrca(srca)產(chǎn)物，其是被檢測用于分析的產(chǎn)物。類似地，如果重復(fù)掛鎖探測和rca步驟，則更多代的rcp(直到最后一輪rcp(所述“最終rcp”))將附接到上一輪rcp，共同形成srca產(chǎn)物。

29、在一個實(shí)施方案中，首先進(jìn)行指數(shù)階段pcr反應(yīng)(i)，然后進(jìn)行線性擴(kuò)增反應(yīng)(ii)。在所述實(shí)施方案中，可以說不對稱pcr反應(yīng)包括(i)第一指數(shù)階段和(ii)第二線性擴(kuò)增階段，其中各期如上所定義。

30、應(yīng)當(dāng)理解，可以根據(jù)第一和第二引物結(jié)合的相應(yīng)鏈來選擇優(yōu)先擴(kuò)增和環(huán)化成第一rca模板的所需鏈。因此，靶序列可以根據(jù)選擇在任一方向優(yōu)先擴(kuò)增。接下來，因此，本發(fā)明中提到的靶核酸序列包括與靶核酸序列互補(bǔ)的序列。

31、因此，在步驟(d)中，使得掛鎖探針與靶序列的多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝雜交。在這種情況下，第一rcp中被掛鎖探針結(jié)合的靶序列的互補(bǔ)體是在擴(kuò)增子中出現(xiàn)的靶序列的互補(bǔ)體。在這方面，術(shù)語“互補(bǔ)體”與“互補(bǔ)序列”或“互補(bǔ)拷貝”同義。

32、還應(yīng)當(dāng)理解，步驟(b)中的單鏈擴(kuò)增子是優(yōu)先擴(kuò)增的鏈。

33、在一個實(shí)施方案中，步驟(b)是模板導(dǎo)向的連接，并且步驟(b)的接觸包括將擴(kuò)增子與連接模板接觸。方便的是，連接反應(yīng)混合物中包含連接模板。然而，這不是絕對必要的，并且在一個實(shí)施方案中，可以進(jìn)行非模板的連接。這種方法使用不需要連接模板的連接酶，例如circligasetm酶。

34、所述靶核酸序列可以是用于通過所述方法檢測的分析物，或者是用于通過所述方法檢測的分析物的報告物。

35、上述方法可以多重方式進(jìn)行以檢測可能存在于一個或多個核酸分子中的多個不同的靶核酸序列，其中在步驟(a)中，使用不同的引物組進(jìn)行多個不對稱pcr反應(yīng)，以產(chǎn)生多個不同的靶核酸分子的擴(kuò)增子或多個不同的靶核酸序列的擴(kuò)增子，其中所述多個pcr反應(yīng)單獨(dú)地平行進(jìn)行，或一起多重進(jìn)行。

36、在一個實(shí)施方案中，在步驟(b)之前，池化來自多個單獨(dú)的不對稱pcr反應(yīng)的擴(kuò)增子。在另一個實(shí)施方案中，多個不對稱pcr反應(yīng)在同一反應(yīng)混合物中一起進(jìn)行。

37、上述方法可用于檢測靶核酸分子中的變體靶核酸序列。靶核酸序列通?？梢砸宰凅w形式出現(xiàn)，例如等位基因變體，或突變體和野生型序列，并且可能需要檢測存在哪種變體。由此可見，靶核酸序列可以是核酸序列可能出現(xiàn)的的許多不同變體中的一種。

38、因此，在一個實(shí)施方案中，所述方法用于檢測樣本中靶核酸分子中一種變體靶核酸序列，并且步驟(d)至(g)包括：

39、(d)將第一rcp與兩種或更多種掛鎖探針接觸，各掛鎖探針包含對靶核酸序列的不同變體特異的靶結(jié)合區(qū)，并使得探針與多個重復(fù)的靶序列互補(bǔ)體雜交；

40、(e)直接或間接連接雜交于變體靶序列互補(bǔ)體的掛鎖探針(即與作為靶或?qū)?yīng)于掛鎖探針的變體序列互補(bǔ)體雜交)，以環(huán)化雜交的掛鎖探針；

41、(f)使用環(huán)化掛鎖探針作為第二rca模板進(jìn)行第二rca反應(yīng)，以產(chǎn)生包含環(huán)化掛鎖探針的多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝的第二rcp；

42、(g)檢測最終(例如第二)rcp以檢測環(huán)化掛鎖探針，從而檢測所述變體靶核酸序列。

43、在步驟(e)中，連接正確雜交的掛鎖探針，即與它們被設(shè)計用于檢測的變體靶序列的互補(bǔ)體正確且特異性雜交的那些(即，與它們各自的靶序列的互補(bǔ)體雜交的掛鎖探針)。

44、所述方法可用于dna或rna的檢測，并可以以同源或異源形式進(jìn)行。其可用于檢測原位樣本或分離形式樣本或液體樣本中的靶核酸序列。

45、有利地，上述方法可以在溫度控制的單個反應(yīng)容器中進(jìn)行，所述方法包括:

46、(i)提供包含來自步驟(a)的單鏈擴(kuò)增子的反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物包含pcr聚合酶和相對于擴(kuò)增子過量的pcr引物，

47、(ii)從(i)的反應(yīng)混合物中減少過量的引物和/或從(i)產(chǎn)生的擴(kuò)增子中去除引物序列；

48、(iii)將所述反應(yīng)混合物與包含連接酶的連接混合物接觸，并進(jìn)行連接反應(yīng)以連接擴(kuò)增子的5’和3’端從而環(huán)化擴(kuò)增子，其中所述連接反應(yīng)在pcr聚合酶在連接模板上延伸擴(kuò)增子的雜交的3’端的能力受到抑制的條件下進(jìn)行；

49、(iv)向來自(iii)的反應(yīng)混合物中加入包含一種或多種rca試劑的rca混合物，所述rca試劑至少包含rca聚合酶，并使用環(huán)化的擴(kuò)增子作為第一rca模板進(jìn)行第一rca反應(yīng)，以產(chǎn)生包含擴(kuò)增子中靶核酸序列的多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝的第一rca產(chǎn)物(rcp)；

50、(v)加熱以失活rca聚合酶；

51、(vi)將第一rcp與對靶核酸序列特異的掛鎖探針接觸，并使掛鎖探針與多個重復(fù)中的靶序列互補(bǔ)體雜交；

52、(vii)將雜交掛鎖探針直接或間接連接以環(huán)化雜交掛鎖探針，其中，連接反應(yīng)在聚合酶延伸掛鎖探針的雜交的3’端的能力受到抑制的條件下進(jìn)行；

53、(viii)去除(vii)的反應(yīng)混合物中未連接的掛鎖探針或使其呈惰性；

54、(ix)使用環(huán)化的掛鎖探針作為第二rca模板進(jìn)行第二rca反應(yīng)，以產(chǎn)生包含環(huán)化掛鎖探針的多個重復(fù)的互補(bǔ)拷貝的第二rcp；

55、其中步驟(i)至(ix)在單個反應(yīng)容器中進(jìn)行，并且在步驟中控制溫度；其中步驟(vi)至(ix)可選地重復(fù)一或多次；和

56、(x)檢測第二或最終rcp以檢測所述環(huán)化掛鎖探針，從而檢測靶核酸序列。

57、在上述方法中，掛鎖探針可以是：

58、(i)單個可環(huán)化寡核苷酸形式的1-部分掛鎖探針，其5’和3’端包含靶-結(jié)合區(qū)；或

59、(ii)2-部分掛鎖探針，包含第一寡核苷酸，其3’端具有與靶互補(bǔ)的第一結(jié)合區(qū)，5’端具有與連接模板互補(bǔ)的第二結(jié)合區(qū)；以及第二寡核苷酸，其5’端具有與靶互補(bǔ)的第一結(jié)合區(qū)和其3’端具有與連接模板互補(bǔ)的第二結(jié)合區(qū)；其中第一和第二寡核苷酸的3’和5’端連接在一起，分別以第一rcp中的靶序列，和連接模板作為模板。

60、在第二方面，提供了一種用于檢測靶核酸分子中靶核酸序列的試劑盒，所述試劑盒包括：

61、(i)用于不對稱pcr反應(yīng)的引物組，其中引物能夠擴(kuò)增靶核酸序列，并且包含具有第一熔解溫度(tm)的第一引物和具有比第一tm低至少10℃的第二tm的第二引物；和

62、(ii)掛鎖探針，其包含對靶核酸序列特異的靶結(jié)合區(qū)；以及可選地，

63、(iii)連接模板，所述連接模板在5’和3’端或其附近包含能夠與靶核酸序列的擴(kuò)增子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)雜交的結(jié)合區(qū)；

64、在一個實(shí)施方案中，所述試劑盒用于在一個或多個靶核酸分子中檢測多個不同的靶核酸序列，并且包含多個不同的引物組(i)和掛鎖探針(ii)，各掛鎖探針對不同的靶核酸序列特異，以及可選的連接模板(iii)。

65、在另一個實(shí)施方案中，所述試劑盒用于檢測靶核酸序列的不同變體，并且包含兩種或更多掛鎖探針，各探針對靶序列的不同變體特異。

66、詳細(xì)說明

67、本方法提供了一種用于檢測特定核苷酸序列(術(shù)語“核苷酸序列”和“核酸序列”在本文中可互換使用)的高保真和高靈敏度的方法。所述方法特別適用于檢測樣本中可能存在的靶序列的變體，例如突變序列。特別地，可以檢測罕見的靶序列或序列變體，或者以低豐度或低水平存在的序列或變體。

68、所述方法將通過不對稱pcr步驟對靶序列的初步擴(kuò)增與srca反應(yīng)相結(jié)合，以產(chǎn)生包含至少第一和第二rcp的srca產(chǎn)物(srcp)，檢測其以檢測靶序列。

69、因此，在第一步中，通過不對稱pcr產(chǎn)生樣本中靶核酸分子中存在的靶核酸序列的擴(kuò)增子。這些擴(kuò)增子包括在指數(shù)pcr反應(yīng)(例如在第一階段，或不對稱pcr的第一反應(yīng))中產(chǎn)生的雙鏈擴(kuò)增子，以及在線性擴(kuò)增反應(yīng)(例如在第二階段或不對稱pcr步驟的第二反應(yīng))中產(chǎn)生的包含靶核酸序列的所需鏈的單鏈擴(kuò)增子。指數(shù)pcr反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)保持較低，不超過12次，特別地不超過11或10次。因此，所需鏈的單鏈擴(kuò)增子占優(yōu)勢。如果需要，雙鏈擴(kuò)增子可以變性以釋放所需的單鏈。通過連接使單鏈擴(kuò)增子環(huán)化，并進(jìn)行rca以產(chǎn)生包含靶序列的多個重復(fù)串聯(lián)的互補(bǔ)拷貝的rca產(chǎn)物。然后用靶序列特異性掛鎖探針探測這些擴(kuò)增的靶序列，所述掛鎖探針在與靶序列-互補(bǔ)序列雜交后，依次環(huán)化(形成第二rca模板，也稱為二級rca模板)并被rca擴(kuò)增，產(chǎn)生第二(或二級)rca產(chǎn)物，通過其可以檢測靶序列。

70、rca產(chǎn)物的產(chǎn)生，特別是srca產(chǎn)物，提供了容易被檢測和計數(shù)的信號。可以實(shí)現(xiàn)數(shù)字計數(shù)讀數(shù)。這使得可以對每個檢測到的靶分子的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)字檢測。此外，第二(或進(jìn)一步)rca反應(yīng)的產(chǎn)物是大型產(chǎn)物，其包含靶序列的互補(bǔ)體的多個(數(shù)百個，并且可能高達(dá)1000個或左右)拷貝，并且具有顯著的大小。這種顯著的反應(yīng)產(chǎn)物可以容易地收集，與反應(yīng)中的任何其他材料混合的風(fēng)險最小。

71、本方法提供了靶序列的高水平擴(kuò)增，通過所述方法提高了檢測方法的靈敏度，使其能夠檢測和鑒定非常罕見的靶序列。因此，罕見序列變體，或以低水平(“低豐度”)存在的序列或變體可以被檢測、或鑒定或區(qū)分。此外，所述方法允許精確定量靶核酸序列。例如，可以高精度地確定不同靶核酸序列的比率，例如在確定染色體拷貝數(shù)的情況下，其中可以檢測和比較來自2條不同染色體的靶序列。例如，在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive?prenataltesting,nipt)中，這可能對檢測三體型特別有用，例如21號染色體。檢測方法的基本原理如圖1所示。

72、如上所述，使用不對稱pcr檢測靶核酸序列是本領(lǐng)域已知的，并且各種形式的不對稱pcr實(shí)驗方案是已知的。為了優(yōu)化superrca實(shí)驗方案，本方法為隨后的2-階段rca反應(yīng)提供了來自特定不對稱pcr實(shí)驗方案的環(huán)化rca模板。值得注意的是，通過包括不對稱pcr步驟，所述方法的靈敏度由于提供靶核酸序列的高產(chǎn)量擴(kuò)增子而增加，但限制了聚合酶錯誤對所述方法準(zhǔn)確性的負(fù)面影響。

73、在本發(fā)明方法中使用的不對稱pcr實(shí)驗方案中，兩個pcr引物被設(shè)計成具有不同的退火溫度i，并且在所述方法期間使用溫度控制來控制哪些引物退火，因此能夠引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)(即，所述方法中存在溫度“開關(guān)”)。因此，指數(shù)反應(yīng)是在較低溫度下進(jìn)行的，在這一溫度下兩種引物都退火，而線性擴(kuò)增是在較高溫度下進(jìn)行的，在這一溫度下只有較高tm的引物退火。溫度的升高或降低用于在階段之間切換，取決于先進(jìn)行哪個階段。如上所述，兩個階段(i)和(ii)可以以任一順序進(jìn)行，即首先是指數(shù)階段(i)，然后是線性階段(ii)；或者在替代實(shí)施例中，首先執(zhí)行線性階段(ii)，隨后是指數(shù)階段(i)。

74、在所述方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，首先使用兩種引物進(jìn)行第一指數(shù)反應(yīng)，然后僅使用第一引物進(jìn)行第二線性擴(kuò)增反應(yīng)。

75、在步驟(a)的反應(yīng)(i)中，兩種引物都被延伸，兩條鏈都被擴(kuò)增(例如，包含靶序列及其互補(bǔ)體(互補(bǔ)鏈)的鏈)。在步驟(a)的反應(yīng)(ii)中，僅延伸第一引物，因此僅擴(kuò)增一條鏈(例如，僅擴(kuò)增包含靶序列的鏈)。

76、換句話說，在線性擴(kuò)增反應(yīng)中，存在單向復(fù)制(僅在單個方向)，與指數(shù)反應(yīng)中的雙向復(fù)制相反。在線性擴(kuò)增反應(yīng)中，合成的拷貝是第一引物退火的序列(或鏈)的互補(bǔ)體，因此合成的拷貝不能成為進(jìn)一步擴(kuò)增的模板。因此，對于每個熱循環(huán)，每個原始單鏈模板只合成一個互補(bǔ)拷貝。

77、通過減少指數(shù)pcr循環(huán)的次數(shù)也增加了所述方法的特異性。在本方法中，在不對稱pcr步驟的指數(shù)(例如初始)階段進(jìn)行少量的指數(shù)pcr循環(huán)，具體來說不超過12個，或特別地不超過11或10個循環(huán)，這具有減少擴(kuò)增子中聚合酶錯誤的積累的效果，降低測定結(jié)果中假陽性和假陰性的比率。事實(shí)上，在一些實(shí)施例中，指數(shù)循環(huán)的次數(shù)可以不超過9、8或7個循環(huán)。例如，可以執(zhí)行6個循環(huán)。

78、此外，由于不需要對雙鏈擴(kuò)增子進(jìn)行變性處理以生成用于連接步驟的單鏈，所述方法的效率可以得到提高。在本方法的一個實(shí)施方案中，不對稱pcr步驟的第二階段包括線性擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生靶核酸序列的單鏈擴(kuò)增子，其可以在連接步驟中環(huán)化，而不需要進(jìn)一步的變性步驟。

79、所述方法的效率也通過在連接步驟中減少互補(bǔ)鏈與靶鏈的競爭而提高。在本方法中，當(dāng)不進(jìn)行變性步驟時，雙鏈擴(kuò)增子的互補(bǔ)鏈保持與所需鏈雜交，并且更低可能與單鏈擴(kuò)增子競爭連接模板或連接酶。在一個實(shí)施方案中，可以進(jìn)行變性步驟。然而，在本方法中高產(chǎn)量單鏈擴(kuò)增子的積累有利地超過了相對低數(shù)量的互補(bǔ)鏈，因此所述方法的效率在很大程度上得以保持。

80、在本方法中，與常規(guī)的不對稱pcr(例如late-pcr)不同，不對稱pcr步驟不依賴于使用一種引物的限制濃度。因此，不對稱pcr步驟可以使用基本相等比例的第一和第二引物，進(jìn)一步提高了所述方法的效率和簡便性。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，第一引物比第二引物具有更高的熔解溫度(tm),第二引物與互補(bǔ)鏈(即與第一引物結(jié)合的鏈互補(bǔ)，或者與第一引物的延伸產(chǎn)物)結(jié)合。

81、在所述方法的一個實(shí)施方案中，第一指數(shù)pcr階段的退火溫度低于兩個引物的tm，使得兩個引物能退火。在例如不超過12(或不超過11或10)個指數(shù)pcr循環(huán)后，將退火溫度升高至高于第二引物的tm，但低于第一引物的tm，以啟動第二線性擴(kuò)增階段，其中僅允許第一引物退火，從而僅產(chǎn)生所需鏈的單鏈擴(kuò)增子。

82、類似地，當(dāng)先進(jìn)行線性擴(kuò)增時，第一階段的退火溫度高于第二引物的tm并低于第一引物的tm，使得只有第一引物能夠退火。在選定次數(shù)的線性循環(huán)后，退火溫度降低到低于兩個引物的tm，使它們都退火，并進(jìn)行指數(shù)pcr反應(yīng)，不超過12個循環(huán)。

83、然而，如下文進(jìn)一步討論的，退火溫度不必低于引物的tm以使該引物退火，如下文的實(shí)施例1中確有體現(xiàn)。因此，退火溫度可以比待退火的引物的tm高幾度(例如1-7℃)。重要的是利用兩個退火溫度的差異來區(qū)分引物的退火和兩個階段之間的差異。

84、應(yīng)當(dāng)理解，指數(shù)pcr反應(yīng)將產(chǎn)生雙鏈擴(kuò)增子，其中第二鏈包含與第一鏈序列方向相反的互補(bǔ)拷貝(即反向互補(bǔ)體)。第二線性擴(kuò)增反應(yīng)將僅產(chǎn)生這兩條鏈之一的拷貝，這取決于第一個較高tm引物使兩條鏈中的哪一條退火。因此，根據(jù)引物設(shè)計，可以優(yōu)先選擇擴(kuò)增一條或另一條鏈，例如有義鏈(或正(+)鏈)或反義鏈(或負(fù)(-)鏈)。因此，如上所述，術(shù)語“靶核酸序列”包括序列的兩個方向，例如有義和反義序列。因此，提及靶核酸序列時可以根據(jù)上下文并適當(dāng)?shù)匕ò行蛄械幕パa(bǔ)體，即它們可以包括與靶序列互補(bǔ)的序列。

85、在一個實(shí)施方案中，第一引物結(jié)合包含靶核酸序列的鏈的互補(bǔ)體，并且第二引物結(jié)合包含靶核酸序列的鏈。因此，第一引物的延伸產(chǎn)物含有靶核酸序列的拷貝。通常但不是必須的，在基因組序列的情況下，靶核酸序列將是其在靶核酸分子的有義鏈，或5’至3’鏈中出現(xiàn)的序列。因此，在一個實(shí)施方案中，靶核酸序列可以在雙鏈核酸分子的第一鏈(或者換句說，5’至3’鏈)中，并且第一引物可以結(jié)合第二條鏈(或者換句話說，3’至5’鏈)。

86、在本方法的一個實(shí)施方案中，與aipr方法不同，首先進(jìn)行指數(shù)pcr反應(yīng)，然后進(jìn)行線性擴(kuò)增反應(yīng)。

87、在所述方法中，無論指數(shù)期和線性期的順序如何，引物可以有利地以相似或基本相同的濃度在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中提供。在一個實(shí)施方案中，pcr引物以相同的濃度范圍或相同的濃度提供。在一個實(shí)施方案中，兩種引物均以其在不對稱pcr反應(yīng)中不會耗盡的濃度提供。換句話說，兩種引物在不對稱pcr步驟的過程中保持過量。換句話說，兩種引物都不是以限制濃度使用的。另外來說，兩種引物均以非限制濃度使用。方便地，pcr引物可以以常規(guī)或指數(shù)pcr反應(yīng)的典型濃度使用，例如100-1000nm。

88、有利地，不對稱pcr步驟可以通過熱循環(huán)進(jìn)行以使效率最大化。這可以通過本領(lǐng)域公知的程序來完成因此，在一個實(shí)施方案中，所述方法可以包括加熱步驟以使靶核酸分子變性，然后可以降低溫度以允許第一和第二引物退火(結(jié)合或雜交)到它們在靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，隨后退火的引物通過pcr聚合酶進(jìn)行延伸。這可能包括進(jìn)一步降低和/或升高溫度以優(yōu)化引物延伸的條件，這取決于所用的pcr聚合酶。然后再次加熱反應(yīng)以使雙鏈分子變性，并再次開始循環(huán)，即允許進(jìn)一步的引物退火并延伸。

89、在順序相反的情況下，首先進(jìn)行線性擴(kuò)增，在初始變性后，將溫度降低至僅允許第一引物退火的溫度，然后延伸第一引物，并重復(fù)該循環(huán)，類似于上述方法。

90、指數(shù)循環(huán)的次數(shù)可以根據(jù)選擇而變化，并且可以取決于靶核酸、樣本等的性質(zhì)。只要進(jìn)行不超過12個循環(huán)，例如執(zhí)行4、5、6、7、8、9、10、11或12個循環(huán)。因此，在實(shí)施方案中，可以進(jìn)行不超過11、10、9或8個循環(huán)，例如從4、5或6中的任意一個到8、9、10、11或12中的任意一個。這比常規(guī)的pcr反應(yīng)要少得多。已經(jīng)觀察到產(chǎn)物的積累與重復(fù)循環(huán)數(shù)成比例。這導(dǎo)致靶序列的雙鏈擴(kuò)增子的產(chǎn)生增加，因此需要進(jìn)行更少的線性擴(kuò)增循環(huán)來產(chǎn)生合理產(chǎn)量的單鏈擴(kuò)增子。雙鏈擴(kuò)增子的更高產(chǎn)量導(dǎo)致檢測方法的效率和靈敏度增加，但由于聚合酶錯誤的積累，特異性降低。如果需要或合適，可以進(jìn)行更多或更少的指數(shù)循環(huán)，并相應(yīng)地調(diào)整線性擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)?？紤]到樣本量以及循環(huán)數(shù)對方法的效率和結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力決定需要多少個指數(shù)和線性循環(huán)。在一個實(shí)施方案中，進(jìn)行至少7個線性擴(kuò)增循環(huán)，例如進(jìn)行7、8、9、10、11或12個循環(huán)。如上所述，如果需要或合適，可以進(jìn)行更多或更少的線性擴(kuò)增循環(huán)。

91、本方法可以有利地實(shí)現(xiàn)自動化。因此，在一個實(shí)施方案中，本方法被設(shè)計成允許在單個反應(yīng)容器中對靶核酸序列的單鏈擴(kuò)增子進(jìn)行2階段rca反應(yīng)(即srca),而無需任何人工輸入，并且可擴(kuò)展用于機(jī)器人工作流程中的商業(yè)應(yīng)用。

92、最一般的，上述方法可用于檢測靶核酸分子中的靶核酸序列。術(shù)語“檢測”在本文中廣泛使用，包括確定靶核酸分子中靶核酸序列存在的任何方法。在本方法中，通過檢測產(chǎn)生的srca產(chǎn)物(例如第二rca產(chǎn)物)的存在或量來檢測靶核酸，并且可以包括簡單地檢測其是否存在或者對ca產(chǎn)物的任何形式的測量。在這方面應(yīng)當(dāng)理解，通過檢測第二或另外的或最終的rcp，因為其附著于第一或前一rcp，所以實(shí)際上檢測了整個srca產(chǎn)物。因此，步驟(f)的rca產(chǎn)物可作為靶核酸序列的“信號”進(jìn)行檢測。因此，在步驟(g)中檢測第二(或另外)rca產(chǎn)物包括以任何方式測定、測量、評估或化驗第二(或另外)rca產(chǎn)物的存在或不存在或數(shù)量或位置。第二(或進(jìn)一步的)rca產(chǎn)物的存在(即其存在或量的確認(rèn))指示或識別靶核酸序列的存在，因為rca產(chǎn)物的成功產(chǎn)生最終取決于靶核酸分子的存在，更具體地取決于其中的靶核酸序列的存在。

93、包括定量和定性測定、測量或評估，包括半定量。這種測定、測量或評估可以是相對的，例如，當(dāng)檢測樣本中兩種或多種不同的靶核酸序列或靶分子時，也可以是絕對的。因此，在一個實(shí)施方案中，所述方法可以用于定量或測定存在的靶核酸序列的量。術(shù)語“定量”在用于量化樣本中的靶核酸序列時，可以指絕對或相對定量。絕對定量可通過加入已知濃度的一種或多種對照核酸分子和/或?qū)z測到的靶核酸序列水平與已知對照核酸分子或序列進(jìn)行參照(例如通過生成標(biāo)準(zhǔn)曲線)來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，可以通過比較兩種或多種不同靶核酸分子或不同靶序列之間的檢測水平或量來實(shí)現(xiàn)相對定量，以提供兩種或多種不同核酸分子或序列中每一種的相對定量，即相對于彼此的相對定量。因此，如上所述，可以確定樣本中存在的靶核酸序列的比例。因此，可以比較靶核酸分子(例如染色體)的拷貝數(shù)。

94、靶核酸序列是期望檢測或鑒定的任何核酸分子中的序列，或換句話說是測定的靶。它可以是dna或rna，或其修飾的變體。因此，核酸可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及能夠參與沃森-克里克型(watson-crick?type)或類似堿基對相互作用的合成核苷酸組成。因此，核酸可以是或可以包含例如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的dna、lna、pna或其它任何含有非核苷酸骨架的衍生物。

95、通常，靶序列是需要檢測的分析物，例如存在于樣本中的核酸，如細(xì)胞或組織樣本或任何生物樣本等。因此，靶序列可以是天然存在的序列，或其衍生物、拷貝或擴(kuò)增子。然而，這不是必需的，并且靶序列可以替代地是檢測的分析物的報告物。報告核酸可以在檢測任何分析物的過程中使用或產(chǎn)生，例如樣本中的蛋白質(zhì)或其他生物分子或小分子。因此，報告核酸可作為分析物結(jié)合探針的標(biāo)簽或標(biāo)記提供，并且可被檢測以檢測分析物，例如在免疫測定中，如在免疫pcr(immunopcr)或免疫rca(immunorca)反應(yīng)中。報告核酸可以在檢測過程中產(chǎn)生，例如，通過鄰近連接檢測中的連接反應(yīng)，或鄰近延伸測定中的延伸反應(yīng)，或通過切割反應(yīng)等。因此，此類報告靶核酸可以是合成或人工序列。

96、在一個實(shí)施方案中，靶核酸是天然或合成的dna分子。靶核酸分子可以是編碼或非編碼dna，例如基因組dna或其亞部分，或者可以衍生自基因組dna，例如其拷貝或擴(kuò)增子，或者它可以是cdna或其亞部分，或擴(kuò)增子或其拷貝等。

97、在另一個實(shí)施方案中，所述靶核酸分子是靶rna分子。它可以是核酸分子池中的rna或其他核酸分子，例如基因組核酸，無論是人的還是來自任何來源的，來自轉(zhuǎn)錄組的，或任何其他核酸(例如細(xì)胞器核酸，即線粒體或質(zhì)體核酸)，無論是天然存在的還是合成的。因此，靶rna分子可以是或可以衍生自編碼(即前mrna或mrna)或非編碼rna序列(例如trna、rrna、snorna、mirna、sirna、snrna、exrna、pirna和長ncrna)。在一個實(shí)施方案中，所述靶核酸分子是微rna(micro?rna,mirna)。在另一個實(shí)施方案中，所述靶rna分子是16s?rna，例如，其中16s?rna來自并鑒定樣本中的微生物(例如病原微生物)?；蛘?，靶rna分子可以是基因組rna，例如以rna作為其遺傳物質(zhì)的病毒的ssrna或dsrna。這些病毒主要包括埃博拉病毒、艾滋病毒、sars、sars-cov2、流感病毒、丙型肝炎病毒、西尼羅熱病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和麻疹病毒。因此，靶rna分子可以是來自病毒基因組的正義rna、反義rna或雙鏈rna，或來自逆轉(zhuǎn)錄病毒rna基因組的正義rna。

98、當(dāng)靶分子是rna分子時，所述方法可以包括產(chǎn)生靶rna分子的cdna拷貝的初始步驟。然后擴(kuò)增cdna分子。

99、使用一組引物進(jìn)行不對稱pcr反應(yīng)以產(chǎn)生靶序列的擴(kuò)增子，所述引物包括具有第一熔解溫度(tm)的第一引物和具有比第一tm低至少10℃的第二tm的第二引物。

100、本發(fā)明使用的術(shù)語“擴(kuò)增子”定義為不對稱pcr反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明所用的擴(kuò)增子通常是指在線性擴(kuò)增階段產(chǎn)生的單鏈擴(kuò)增子，其被連接到用于superrca反應(yīng)的第一rca模板中，但根據(jù)上下文并且適當(dāng)時，也可以包括在指數(shù)pcr階段產(chǎn)生的雙鏈擴(kuò)增子。

101、一對pcr引物可以表示為正向和反向引物，其中正向引物與需要擴(kuò)增的靶序列的互補(bǔ)鏈結(jié)合。因此，在本方法的一個實(shí)施方案中，第一引物(正向引物)具有與第二鏈(負(fù)鏈)互補(bǔ)并因此與之結(jié)合(退火)的序列，之后延伸第一引物以產(chǎn)生所需的第一鏈(正鏈)的拷貝。第二鏈也可以稱為反義鏈或模板鏈，它是第一鏈的互補(bǔ)體，反之亦然。第二引物(反向引物)具有與第一鏈互補(bǔ)的序列，因此與第一鏈結(jié)合(退火)，之后延伸產(chǎn)生第二鏈的拷貝。第一鏈也可以稱為所需鏈、有義鏈或非模板鏈?；蛘?，第一引物與第二鏈退火并在第二鏈上延伸以產(chǎn)生所需的第一鏈的擴(kuò)增子，而第二引物與第一鏈退火并在第一鏈上延伸以產(chǎn)生所需鏈的互補(bǔ)體。第一引物也與第二引物的延伸產(chǎn)物和第二鏈的互補(bǔ)體退火，而第二引物也與第一引物的延伸產(chǎn)物和第一鏈的互補(bǔ)體退火。因此，在這樣的實(shí)施方案中，第一引物可以稱為負(fù)鏈引物，第二引物可以稱為正鏈引物。類似地，在另一個實(shí)施方案中，第一引物可以是反向引物等(即它可以結(jié)合到第一條鏈(即正鏈/5’到3’鏈)等)。

102、引物的熔解溫度是一半引物與核酸鏈結(jié)合的溫度。換句話說，它是結(jié)合和未結(jié)合引物之間達(dá)到平衡的溫度。取決于引物設(shè)計的各種因素，引物可能具有不同的tm。這可能尤其包括引物的核苷酸組成和長度。因此，引物可以被設(shè)計成具有序列錯配，或者它可以包含修飾的核苷酸，例如鎖dna(locked?dna,lna)堿基，或者它可以通過添加小溝結(jié)合物而被修飾。

103、所述方法中使用的引物組包括第一引物，其tm比第二引物高，具體地比第二引物高至少10℃?；蛘?，第一引物具有第一tm，第二引物具有比第一tm低至少10℃的第二tm。在一個實(shí)施方案中，第二tm比第一tm低至少11、12、13、14、15、20、25或30℃。第一引物可具有60-72℃的第一tm，例如65-70℃，例如65、66、67、68、69或70℃。在一個實(shí)施方案中，第一引物可具有67℃的第一tm。第二引物可具有50-62℃的第二tm，例如54-60℃，例如54、55、56、57、58、59或60℃。在一個實(shí)施方案中，第二引物可具有50℃或55℃的第二tm。

104、由于引物tm的不同，可以使用不同的退火溫度來控制靶序列的擴(kuò)增。pcr反應(yīng)的退火溫度是使得引物與核酸鏈結(jié)合或退火的溫度。具體地，考慮到第二較低的tm，可以使用第一退火溫度，以使兩個引物在指數(shù)pcr階段退火，從而導(dǎo)致兩個引物在其各自鏈上延伸并產(chǎn)生雙鏈擴(kuò)增子。換句話說，靶核酸分子的兩條鏈都被擴(kuò)增。或者說，第一鏈及其互補(bǔ)體和第二條鏈及其互補(bǔ)體被擴(kuò)增。第二退火溫度可用于僅使具有較高第一tm的引物(第一引物)退火至所需鏈，例如模板(或反義)鏈，以產(chǎn)生所需核酸序列的單鏈擴(kuò)增子。因此，例如在不對稱pcr方法的線性擴(kuò)增階段，具有較高第一tm的第一引物與模板(第二)鏈退火以擴(kuò)增所需(第一)鏈。換句話說，在線性擴(kuò)增階段，只有第一鏈被擴(kuò)增。

105、一種或多種引物的退火溫度可以與待退火的引物或具有最低tm的引物的tm相同。然而，如本領(lǐng)域所理解的，其可以是不同的。例如，退火溫度可以比引物tm高或低4-10℃，例如高4-10℃，或高4-8℃，例如高4、5、6、7或8℃。例如，第一退火溫度可以比第二引物的第二tm高5-7℃，例如高6℃，第二退火溫度可以比第一引物的第一tm高6-8℃，例如高7℃。

106、為了使引物在每個pcr循環(huán)中退火，任何雙鏈核酸分子必須首先變性。因此，當(dāng)靶核酸分子在每個循環(huán)開始時以雙鏈形式出現(xiàn)或提供時，則溫度升高到至少90℃，例如90-100℃，或94-98℃，例如98℃，不過合適的變性溫度可以根據(jù)雙鏈核酸分子的tm而變化。所述分子的tm受諸如大小、復(fù)雜程度和gc含量等因素的影響，合適的變性溫度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。雙鏈核酸分子的變性將鏈分離成引物可以與之退火的單鏈核酸分子。變性步驟可以進(jìn)行至少10秒至3分鐘，例如10秒至1分鐘，如15秒至30秒。在一個實(shí)施方案中，分離雙鏈靶核酸分子的初始變性步驟進(jìn)行30秒，并且使延伸產(chǎn)物與原始鏈分離或使擴(kuò)增子變性的后續(xù)變性步驟進(jìn)行15秒。

107、在pcr循環(huán)的變性步驟之后，可以如上所述充分降低溫度以使用于指數(shù)反應(yīng)的第一和第二引物退火，或者使僅用于線性擴(kuò)增反應(yīng)的第一引物退火。一旦引物退火，可以保持溫度以使引物在pcr循環(huán)的引物延伸步驟中被pcr聚合酶延伸?；蛘?，延伸溫度可以不同于退火溫度，例如，高于退火溫度。在一個實(shí)施方案中，延伸溫度與退火溫度相同。在另一個實(shí)施方案中，延伸溫度與退火溫度不同。pcr循環(huán)的退火和延伸步驟總共可持續(xù)至少60-180秒，例如100-140秒，例如120秒。在一個實(shí)施例中，每個循環(huán)中的總退火和延伸時間為120秒。

108、因此，步驟(a)的不對稱pcr反應(yīng)可包括使樣本(或更具體地說是靶核酸分子)與第一和第二pcr引物和pcr試劑(其將至少包括聚合酶和dntp)接觸，并且在一個實(shí)施方案中，步驟(a)(i)的指數(shù)反應(yīng)可包括：如果靶核酸分子是雙鏈的，則使其變性；在第一退火溫度下孵育pcr反應(yīng)混合物以使兩個引物退火；在可以與第一退火溫度相同或不同的第一延伸溫度下孵育pcr反應(yīng)，以使引物延伸；和任選地重復(fù)變性、引物退火和延伸步驟。隨后，步驟(a)(ii)的線性反應(yīng)可包括：使步驟(a)(i)的雙鏈擴(kuò)增子變性；在第二退火溫度下孵育pcr反應(yīng)混合物以使第一引物退火；在可以與第二退火溫度相同或不同的第二延伸溫度下孵育pcr反應(yīng)，以使引物延伸；和任選地重復(fù)變性、引物退火和延伸步驟。

109、在另一個實(shí)施方案中，首先進(jìn)行線性擴(kuò)增，步驟(a)(ii)的線性反應(yīng)可包括：如果靶核酸分子是雙鏈的，使其變性；在第二退火溫度下孵育pcr反應(yīng)混合物以僅使第一引物退火；在可以與第二退火溫度相同或不同的第二延伸溫度下孵育pcr反應(yīng)，以使第一引物延伸；和任選地重復(fù)變性、引物退火和延伸步驟。隨后，步驟(a)(i)的指數(shù)反應(yīng)可包括：將步驟(a)(ii)的反應(yīng)混合物進(jìn)行變性步驟；在第一退火溫度下孵育pcr反應(yīng)混合物以使第一和第二引物均退火；在可以與第一退火溫度相同或不同的第一延伸溫度下孵育pcr反應(yīng)，以使兩個引物延伸；和任選地重復(fù)變性、引物退火和延伸步驟。

110、第一引物可定義為“高”或“高溫”引物，第二引物可定義為“低”或“低溫”引物。因此，兩個引物均退火的第一退火溫度可以相應(yīng)地定義為“低”，只有第一(高)引物結(jié)合的第二退火溫度可以相應(yīng)地定義為“高”。因此，第一退火溫度低于第二退火溫度。

111、一般來說，第二退火溫度(“高”退火溫度)通常比第一退火溫度(“低”退火溫度)高至少約8-12℃。在一個實(shí)施方案中，其比第一退火溫度至少高10℃。理想地，第一(低)和第二(高)退火溫度之間的差異約為10℃。

112、如上所述，本方法的優(yōu)點(diǎn)為減少指數(shù)pcr循環(huán)的次數(shù)，以減少聚合酶錯誤的積累。有利地，為了最小化聚合酶錯誤，進(jìn)行不超過12、11或10個循環(huán)(即12、11或10或更少)。在一個實(shí)施方案中，進(jìn)行不超過5-8個循環(huán)，例如進(jìn)行不超過8、7、6或5個循環(huán)。在另一個實(shí)施方案中，進(jìn)行6個循環(huán)。

113、在本方法中，基于所進(jìn)行的指數(shù)循環(huán)的次數(shù)和靶序列的單鏈擴(kuò)增子的期望產(chǎn)量，選擇所進(jìn)行的線性擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)。通常，進(jìn)行不超過40、39、35、30、25或20個循環(huán)。在一個實(shí)施方案中，至少進(jìn)行6-12個循環(huán)，例如至少進(jìn)行6、7、8、9、10、11或12個循環(huán)。在另一個實(shí)施方案中，進(jìn)行8個循環(huán)。

114、根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的原理，pcr引物被設(shè)計用于擴(kuò)增靶序列，并因此在靶序列內(nèi)或在靶序列側(cè)翼的位點(diǎn)退火這可以取決于靶序列的性質(zhì)，例如是否檢測到不同的靶序列，或是否檢測到基因的不同變體(例如突變體或等位基因)。一般來說，正向引物可在接近或位于互補(bǔ)靶序列的3’端退火。反向引物可在接近或位于靶序列的3’端退火。

115、在多重反應(yīng)的情況下，其中有一個以上的靶分子或一個以上的靶序列，每個靶的擴(kuò)增可以分別平行進(jìn)行，即可以進(jìn)行單獨(dú)的擴(kuò)增反應(yīng)，每個反應(yīng)使用一組pcr引物。在這種情況下，可以將得到的各個不對稱pcr反應(yīng)混合物，或者更具體地說，其中的部分或等分試樣可被池化以提供步驟(a)的反應(yīng)混合物。因此，在一個實(shí)施方案中，進(jìn)行多個單獨(dú)的不對稱pcr反應(yīng)，并且在步驟(b)之前將來自其中的擴(kuò)增子池化。

116、或者，不同靶序列/分子的擴(kuò)增可以在同一反應(yīng)混合物中多重進(jìn)行。因此，不對稱pcr反應(yīng)可使用多個(或多重)引物組(或換句話說，引物池)來進(jìn)行。在這方面應(yīng)該理解的是，當(dāng)研究靶序列的不同變體時，可以使用相同的pcr引物組產(chǎn)生其擴(kuò)增子(換句話說，擴(kuò)增子可以包含許多不同變體中的一種或多種，其可以使用相同的引物組擴(kuò)增；引物可以設(shè)計成結(jié)合在變異位點(diǎn)側(cè)翼的位點(diǎn)上)。在同一反應(yīng)混合物中進(jìn)行多重擴(kuò)增的情況下，擴(kuò)增的序列數(shù)可以為2至10,000或更多。

117、因此，為了檢測兩種或多種不同靶分子中的靶序列，可以使用多個pcr引物組(例如引物對)，每個引物組對不同的靶序列具有特異性，即具有與靶分子中位于不同靶序列內(nèi)或不同靶序列側(cè)翼的引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的靶結(jié)合區(qū)。在這方面應(yīng)當(dāng)理解，不同靶分子中的側(cè)翼結(jié)合位點(diǎn)對于不同的靶序列將是不同的，以使得掛鎖探針的特異性結(jié)合?？蛇x地或附加地，可以檢測同一靶分子中不同且不相關(guān)的靶序列，例如，染色體上不同基因中的不同序列，同樣使用多個不同的pcr引物組，每個引物組對不同的靶序列特異。然而，如上所述，在一個具體實(shí)施方案中，所述方法可用于檢測給定靶分子中存在多種可能的不同變體序列中的哪一種，例如，是否存在野生型或突變序列、或多種可能的突變體中的哪一種、或不同的等位基因變體或多態(tài)性等。在這種實(shí)驗方案中，使用通用的引物組來產(chǎn)生擴(kuò)增子，然后通過使用多種不同的掛鎖探針來確定存在哪種變體，每種探針對靶序列的不同變體具有特異性。

118、本發(fā)明使用的術(shù)語“多重”或“多重性”是指兩個或更多，例如3、4、5、6、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100或更多。事實(shí)上，可以使用數(shù)千或數(shù)萬組引物(以及之后的連接模板或掛鎖探針)?？墒褂玫臄?shù)量不受限制，并且可以變化。這將取決于所述方法的目的、樣本的性質(zhì)、待檢測的靶核酸序列以及可能的變體的數(shù)量等。因此，為了檢測例如野生型和突變型變體，不同掛鎖的數(shù)量將取決于可能的不同突變體的數(shù)量，并且可以是例如2-6、2-5、2-4或2-3個不同的掛鎖。應(yīng)該理解的是，不同的方面可以組合，以增加檢測的整體多重性。例如，在給定的樣本中，所述方法可用于檢測不同靶序列的不同變體。

119、當(dāng)擴(kuò)增子由不同的引物產(chǎn)生時，例如由不同的靶分子產(chǎn)生，或者由相同分子的不同引物擴(kuò)增不同的靶序列，它們可能具有不同的末端序列。pcr引物可以引入不同的或經(jīng)選擇的末端序列。因此，用于擴(kuò)增不同靶序列的pcr引物可以具有與靶序列/分子不互補(bǔ)的5’端序列，并且可以用于為所有擴(kuò)增子提供共同的或通用的末端序列。通過這種方式，可以獲得均具有相同末端序列的擴(kuò)增子。這使得可以使用相同的連接模板來環(huán)化反應(yīng)混合物中的所有擴(kuò)增子(例如，或從相同的樣本中產(chǎn)生的擴(kuò)增子)。在某些情況下，如果需要，來自一群或一組的所有擴(kuò)增子可以具有相同的(即共同的)末端序列，并且不同的群或組可以具有不同的末端序列。例如，來自給定樣本的所有擴(kuò)增子可以具有相同的末端序列，但是來自不同樣本的擴(kuò)增子(它們池化在一起)可以具有不同的末端序列，從而可以區(qū)分來自不同樣本的相同靶序列。因此，在一個實(shí)施方案中，末端序列可被定義為連接模板的結(jié)合位點(diǎn)或包含連接模板的結(jié)合位點(diǎn)。

120、因此，在一個實(shí)施方案中，pcr引物(以及之后的連接模板)可被視為通用引物，或一群靶序列或一群變體靶序列的通用引物。因此，pcr引物可以具有與靶分子中不同靶序列共有的結(jié)合位點(diǎn)(例如側(cè)翼區(qū))互補(bǔ)的靶結(jié)合區(qū)(即，不同靶序列或靶序列的不同變體側(cè)翼的共有結(jié)合位點(diǎn))?；蛘?，擴(kuò)增引物可以具有靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)對于不同靶序列或不同變體是共同的或通用的，或者對于一群靶序列或一群變體是共同的。也就是說，擴(kuò)增引物可以具有靶結(jié)合區(qū)，其能夠與靶分子中不同靶序列或靶序列的不同變體共有的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)雜交。然而，掛鎖探針對靶序列或靶序列的不同變體是特異的，如下文進(jìn)一步所述。

121、在不同的實(shí)施方案中，pcr引物可以對特定的靶核酸序列是特異的。因此，例如，可以使用引物組，每個引物組對不同的靶序列是特異的。這可用于診斷檢測，例如nipt，其中可以檢測不同的序列，例如，檢測不同的染色體(并確定它們的拷貝數(shù)，例如，檢測三體型)，或用于需要檢測一個或多個特定靶序列的任何情況。

122、在一個實(shí)施方案中，pcr引物可以以有助于所述方法的后續(xù)連接步驟(b)的方式設(shè)計。因此，引物可包括一個或多個尿嘧啶堿基，以使引物被降解。特別地，可以用尿嘧啶-dna-糖基化酶(udg)對擴(kuò)增子進(jìn)行消化步驟，以消化擴(kuò)增子的引物部分(延伸產(chǎn)物)。這特別針對于第一引物(“高tm”引物)。這有助于連接效率；連接模板可以設(shè)計成與擴(kuò)增子序列延伸部分的5’端序列雜交。在不對稱pcr步驟之后，pcr引物將會過量存在于擴(kuò)增反應(yīng)混合物中，在許多情況下是非常過量的，因此，這種修飾有助于減少或最小化未延伸引物對連接模板的競爭。通過在引物中加入硫代磷酸酯鍵，結(jié)合5’單鏈核酸外切酶，可以實(shí)現(xiàn)類似的效果。

123、為了進(jìn)行不對稱pcr步驟，將靶核酸與pcr引物和進(jìn)行擴(kuò)增所需的其他試劑接觸。含有靶核酸分子或其部分或組分或等分試樣的樣本可與試劑接觸。例如，細(xì)胞或組織樣本，或任何含有細(xì)胞的樣本，或細(xì)胞提取物，可與試劑直接接觸。樣本可以在接觸前進(jìn)行預(yù)處理或加工。在其他實(shí)施方案中，可以首先從樣本中分離或去除靶核酸。從各種類型的樣本中提取或純化核酸例如dna的程序是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，核酸可以從細(xì)胞中分離，或者從無細(xì)胞樣本例如血漿中分離。在一些情況下，也可能需要將核酸分子片段化。用于此的程序是本領(lǐng)域已知的，并且包括特異性消化，例如使用核酸酶，包括限制性酶，或通過非特異性方法，例如剪切。

124、如上所述，為了便于操作和實(shí)現(xiàn)自動化，通常希望在一個容器中進(jìn)行多種檢測(即多重檢測)，特別是對于srca步驟。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，在已經(jīng)進(jìn)行了單獨(dú)的平行的不對稱pcr擴(kuò)增的情況下，在(a)的不對稱pcr反應(yīng)之后，可以將用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的不對稱pcr反應(yīng)的所得反應(yīng)混合物的一部分或多部分引入或加入到反應(yīng)容器中。例如，可向容器中加入1-5μl體積的一種或多種擴(kuò)增反應(yīng)混合物。然而，在另一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增可以在容器中進(jìn)行。

125、因此，本方法可以有利地實(shí)現(xiàn)自動化。因此，在一個實(shí)施方案中，本方法被設(shè)計成允許在單個反應(yīng)容器中對靶核酸序列的單鏈擴(kuò)增子進(jìn)行2階段(或更多階段)rca反應(yīng)(即srca),而無需任何人工輸入，并且可擴(kuò)展用于機(jī)器人工作流程中的商業(yè)應(yīng)用。

126、“單一反應(yīng)容器”是指單一的物理或結(jié)構(gòu)隔室，即容納反應(yīng)混合物體積的物理結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“隔室”不包括液滴或乳液等。同樣地，但這并不排除在所述方法的“單一容器實(shí)施方案”的任何步驟中使用液滴或乳液(即在步驟(i)至(x)的反應(yīng)容器內(nèi))。還應(yīng)當(dāng)理解，為了步驟(x)中的檢測目的，可以從反應(yīng)容器中取出第二(或更多)rca產(chǎn)物，例如，將其轉(zhuǎn)移到檢測儀器，例如流式細(xì)胞儀或顯微鏡載玻片等。因此，容器可以是適于進(jìn)行所述方法的步驟的任何容器。通常，這將是反應(yīng)管，但它可以是任何形式或構(gòu)造的容器，包括例如反應(yīng)孔或微流體回路的一部分。

127、如上所述，進(jìn)行有限次數(shù)的指數(shù)pcr循環(huán)，因此，所得混合物含有相對于擴(kuò)增子過量的pcr引物。雖然低循環(huán)數(shù)具有提高檢測的特異性的優(yōu)點(diǎn)，但結(jié)果是反應(yīng)混合物中存在過量的pcr引物。即使如此有限的循環(huán)次數(shù)也可能導(dǎo)致非常大的引物過量，例如1000倍的過量或更多。因此，引物過量可以是至少1000、2000、5000、7000或10，000倍。在一些情況下，它可以會更高，超過幾十或幾十萬倍。舉例來說，在一個有代表性的擴(kuò)增反應(yīng)中，所得的反應(yīng)混合物可能含有100fm數(shù)量級的擴(kuò)增子(例如全長pcr產(chǎn)物),而引物的數(shù)量級為500nm。這種過量的引物可能會干擾所述方法的下游步驟。

128、雖然在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增子可以從pcr擴(kuò)增反應(yīng)混合物中分離，但通過進(jìn)行清除步驟以去除過量的引物來解決這個問題可能是方便的。在所述方法的單容器形式中尤其如此。

129、因此，在一個實(shí)施方案中，包括清除步驟以去除或減少至少pcr引物以及任選的pcr聚合酶可能是方便的。這可以通過酶消化和/或稀釋來完成。

130、在一個實(shí)施方案中，過量的引物通過酶消化來減少。在另一個實(shí)施方案中，向反應(yīng)混合物中加入一定體積的稀釋劑以稀釋反應(yīng)混合物。

131、如果在隨后的步驟中反應(yīng)混合物中存在pcr聚合酶，則pcr聚合酶可能通過在連接模板(若使用)上延伸擴(kuò)增子的雜交3’端來抑制擴(kuò)增子的連接。因此，減少這種干擾的一種方式是進(jìn)行單鏈擴(kuò)增子的非模板連接步驟。然而，在另一個實(shí)施方案中，聚合酶可以通過酶消化失活。在另一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增子與連接模板的雜交可以通過溫度來控制，使得5’端首先雜交，然后是3’端。這些溶液也可用于阻止在第二連接步驟(步驟(e))中雜交的掛鎖探針3’端的延伸。

132、在對引物進(jìn)行酶消化的情況下，可以通過將(a)的反應(yīng)混合物與能夠降解引物的消化酶接觸來實(shí)現(xiàn)。方便地，其可以為具有核酸外切酶活性的酶，特別地為以核酸外切酶活性作為其主要催化活性的酶(與具有核酸外切酶活性的聚合酶或其具有核酸外切酶活性的部分相反)。因此，可以使用核酸外切酶(本術(shù)語在本發(fā)明中不包括聚合酶或其部分)。

133、術(shù)語“接觸”在本發(fā)明中廣泛使用，包括使所討論的試劑接觸。因此，一種可以加到另一種中，反之亦然，或者它們可以被引入彼此中等等。然而，在步驟(i)至(ix)中進(jìn)行的單一容器程序的情況下，接觸方便地包括將所討論的試劑添加到單一容器中存在的反應(yīng)混合物中，或者換句話說，將所討論的一種或多種試劑或試劑混合物添加到容器中。因此，在步驟(ii)的情況下，減少引物過量可以包括將含有消化酶的試劑或試劑混合物加入到(i)的反應(yīng)混合物中，特別是加入到含有(i)的反應(yīng)混合物的容器中。

134、核酸外切酶可以是任何合適的核酸外切酶。用于清除非所需的核酸的核酸外切酶是本領(lǐng)域已知的，包括例如核酸外切酶i、iii或λ或其混合物。所選擇的核酸外切酶應(yīng)具有嚴(yán)格的單鏈特異性活性，例如exoi或recjf。

135、也可以采用其他消化系統(tǒng)。例如，如果擴(kuò)增引物含有尿嘧啶，則如上所述，可以方便地用另一種眾所周知的消化系統(tǒng)尿嘧啶dna糖基化酶(udg)來消化它們。

136、在另一個實(shí)施方案中，可以使用對外切核酸酶消化有抗性的核苷酸(例如，包含可以抑制外切核酸酶活性的修飾堿基)和由對外切核酸酶消化敏感的核苷酸(例如，正常或常規(guī)核苷酸)組成的引物來產(chǎn)生擴(kuò)增子。以這種方式，擴(kuò)增子的引物部分可以被消化，同時保留擴(kuò)增子中新合成的序列。

137、該清除步驟可以進(jìn)一步包括擴(kuò)增聚合酶的酶消化。然而，這并不是絕對必要的，因為來自聚合酶的干擾可以通過其他方式解決。盡管如此，在一個實(shí)施方案中，除了具有核酸外切酶活性的酶之外，清除試劑混合物還可以包括具有蛋白酶活性的酶。這可以是任何合適的蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬酰胺肽裂解酶，但通常這將是蛋白酶k。有利地，使用不耐熱或非嗜熱的蛋白酶，因為其可以隨后被加熱失活。因此，可以包括加熱步驟以在使用后失活蛋白酶，如下文進(jìn)一步討論。在所述步驟中使用蛋白酶是有利的，因為蛋白酶也會降解核酸外切酶。就此而言，在核酸外切酶的酶促作用與蛋白酶的消化之間會出現(xiàn)平衡。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增引物的充分降解可能發(fā)生在核酸外切酶失活之前，并且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員尋找和優(yōu)化反應(yīng)條件的常規(guī)技能范圍內(nèi)。

138、清除試劑，例如酶，可以在任何合適的緩沖液或稀釋劑中提供。有利地，這可以是適用于隨后的連接和rca反應(yīng)的緩沖液。反應(yīng)混合物(例如單一容器形式的反應(yīng)容器)可以在適合于發(fā)生清除反應(yīng)的條件下孵育。作為代表性的實(shí)施例，可以在37℃下溫育10分鐘，但這當(dāng)然可以根據(jù)所用酶的確切性質(zhì)等進(jìn)行變化或優(yōu)化，并且可以包括將反應(yīng)混合物在室溫下放置一段時間。

139、如果該方法用于檢測變體，例如突變，則一般而言，通過引物的酶消化進(jìn)行清除步驟是最佳的。優(yōu)選地，還包括擴(kuò)增聚合酶的蛋白酶消化。

140、然而，作為酶消化的替代方法，可以使用擴(kuò)增反應(yīng)混合物的稀釋物來稀釋引物。這可能足以將它們的干擾降低到可接受的水平。一般來說，這可能需要很大的稀釋系數(shù)，其可通過常規(guī)實(shí)驗來確定。例如，可以采用至少為×200的稀釋系數(shù)。這可以通過使反應(yīng)混合物與稀釋劑接觸來實(shí)現(xiàn)，例如，向反應(yīng)混合物中加入稀釋劑，或者通過向稀釋劑中加入部分或等分試樣的擴(kuò)增反應(yīng)混合物來實(shí)現(xiàn)。稀釋劑可以方便地為合適的緩沖液，例如，適用于該方法后續(xù)步驟的緩沖液。在另一個實(shí)施方案中，稀釋劑可以為用于連接步驟的試劑混合物。在稀釋步驟的情況下，單個擴(kuò)增反應(yīng)混合物或其混合物池中較小等分式樣可與稀釋劑接觸，例如0.1-0.2l等分試樣。

141、因此，在一個實(shí)施方案中，單一容器實(shí)驗方案的步驟(i)和(ii)可以組合，并且可以通過將一種或多種擴(kuò)增反應(yīng)混合物的一部分或等分試樣添加到容器中存在的一定體積的清除試劑混合物中來進(jìn)行。所述清除試劑混合物可以為簡單的稀釋劑，例如緩沖液。

142、在不對稱pcr步驟之后，并且任選地在任何清除步驟(例如單一容器實(shí)驗方案的步驟(ii))之后，有將雙鏈擴(kuò)增子變性為單鏈的可選步驟。這不是必須的，因為擴(kuò)增子基本上是以單鏈的形式制備的，但在一些實(shí)施方案中包括這樣的步驟可能是有利的。如果包括，所述方法可以包括使擴(kuò)增子變性的加熱步驟，例如，加熱到95℃保持1-2分鐘，或類似的條件。這樣的加熱步驟也可以使清除反應(yīng)中包含的任何蛋白酶失活。然而一般來說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括單獨(dú)的、更溫和的加熱步驟是有益的，例如在50-60℃下孵育5-20分鐘，例如55℃下孵育10分鐘以失活蛋白酶(如果使用)。然后，所述方法可進(jìn)入連接步驟(b)，或進(jìn)入變性步驟，然后進(jìn)行連接步驟。

143、在這方面，如果包括變性步驟，在步驟(b)中，加入連接混合物，加熱至變性，然后降低溫度以進(jìn)行連接是方便的。因此，步驟(b)的變性和接觸可以同時進(jìn)行或以任何順序進(jìn)行。或者，如果此時沒有變性步驟，可加入連接混合物，然后可加熱反應(yīng)混合物以失活蛋白酶(如果使用)。

144、可通過控制反應(yīng)溫度來控制實(shí)際連接反應(yīng)的進(jìn)行(即連接反應(yīng)可以被啟動)?？梢园ㄟB接模板(如果使用)的退火和/或連接酶的活性。換句話說，如果包括變性，則連接反應(yīng)發(fā)生在變性之后，但用于連接的試劑、連接酶、以及在一些實(shí)施方案中連接模板可以在步驟(b)的變性之前或同時加入反應(yīng)混合物中。如上所述，通常會包括連接模板，因為這傾向于得到更好的結(jié)果，但這不是必需的，也可以選擇進(jìn)行非模板連接。這可能取決于所用的具體方法，以及所用的擴(kuò)增子和連接條件等。在一個實(shí)施方案中，連接反應(yīng)混合物中包含連接模板。

145、變性后，使用連接模板時，降低溫度以使擴(kuò)增子與連接模板雜交(或換句話說退火)，并使連接酶催化連接反應(yīng)。如果沒有變性步驟，這種溫度降低可能是不必要的，并且所述方法可改為包括提高連接步驟的溫度(例如，用于連接模板的退火和/或用于連接酶活性)。

146、連接模板包含與優(yōu)先擴(kuò)增的單鏈擴(kuò)增子末端序列互補(bǔ)的序列或區(qū)域。擴(kuò)增子鏈的末端與連接模板雜交，從而使雜交的擴(kuò)增子的末端并置以連接(即彼此相鄰以便它們可以連接)。如上所述，連接模板可被設(shè)計成與特定的單個擴(kuò)增子互補(bǔ)(換句話說，包含特定靶序列的擴(kuò)增子可以具有同源連接模板，其被設(shè)計成與其雜交，但不與其他擴(kuò)增子雜交)。在其他實(shí)施方案中，連接模板可以與擴(kuò)增子的群或子集雜交，或與反應(yīng)混合物中的所有擴(kuò)增子雜交，這取決于提供給擴(kuò)增子的末端序列。

147、在這方面，通常情況是所有擴(kuò)增子(存在于反應(yīng)混合物中)都被連接。因此，在含有多種不同擴(kuò)增子(代表多個不同靶序列)的反應(yīng)混合物的情況下，所有可能存在的或待檢測的不同類型的擴(kuò)增子被連接成環(huán)。因此，通過連接使擴(kuò)增子環(huán)化的步驟可被視為樣本準(zhǔn)備的步驟，或者準(zhǔn)備待擴(kuò)增的分子文庫并通過掛鎖探針進(jìn)行探測的步驟。

148、連接通過連接酶進(jìn)行。其可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的連接酶著眼的代表性連接酶包括但不限于溫度敏感性連接酶，例如噬菌體t4?dna連接酶、噬菌體t7連接酶、大腸桿菌連接酶，以及熱穩(wěn)定連接酶例如taq連接酶、tth連接酶、pfu連接酶和9°ntmdna連接酶。有利地，使用熱穩(wěn)定或嗜熱的連接酶，因為其可以在反應(yīng)混合物中保持活性形式，用于隨后的步驟(e)(單一容器方法的步驟(vii))中掛鎖探針的連接。用于連接的合適條件是本領(lǐng)域已知的，并且任何必需和/或期望的試劑可以與反應(yīng)混合物組合并保持在足以進(jìn)行連接的條件下。顯然，連接條件可以取決于本發(fā)明方法中使用的連接酶。因此，例如，可以使用ampligase，其使得連接反應(yīng)在例如50-60℃(例如，55-60℃，例如58℃)進(jìn)行。

149、在沒有連接模板的情況下進(jìn)行連接時，可使用circligasetmssdna連接酶。這是一種熱穩(wěn)定的atp依賴性連接酶，其催化具有5’-磷酸和3’-羥基的ssdna模板的分子內(nèi)連接(即環(huán)化)。在一個實(shí)施方案中，需要以不對稱連接結(jié)構(gòu)的方式設(shè)計連接反應(yīng)使得擴(kuò)增子(延伸引物產(chǎn)物)與連接模板之間比未延伸引物與連接模板之間存在更強(qiáng)的雜交。如上所述，這可以通過引物設(shè)計來實(shí)現(xiàn)。

150、同樣如上所述，在一些實(shí)施方案中，可能需要在擴(kuò)增聚合酶延伸與連接模板雜交的擴(kuò)增子鏈3’端的能力被抑制的條件下進(jìn)行連接反應(yīng)。應(yīng)該理解的是，如果擴(kuò)增聚合酶在之前的清除步驟中已經(jīng)被蛋白酶消化，則將達(dá)到這樣的條件。然而，這也可以通過其他方式實(shí)現(xiàn)，最顯著的是通過控制擴(kuò)增子與連接模板的雜交，使得擴(kuò)增子的5’端首先被雜交。這使得連接反應(yīng)能夠在雜交的3’端發(fā)生任何顯著的延伸之前進(jìn)行。因此，可以進(jìn)行2步雜交，在第一溫度下將擴(kuò)增子的5’端退火到連接模板上，然后降低溫度使擴(kuò)增子的3’端退火到連接模板上。

151、例如，可以選擇第一退火溫度來促進(jìn)或優(yōu)化擴(kuò)增子5’端的退火。例如，可使用50-75℃的退火溫度，例如53-60℃，或者更特別地55-60℃。

152、可以降低退火溫度以用于3'端的退火。同樣，可以根據(jù)本領(lǐng)域的已知知識和特定試劑(例如使用的酶)來選擇合適的條件。例如，在第一退火步驟之后，溫度可以降低到28-40℃,例如28-35、30-35、28-33、30-33、28-32或30-32℃等，用于第二退火步驟。

153、可以選擇合適的連接酶來實(shí)現(xiàn)這種2步退火。在這方面，嗜熱atp依賴性連接酶是可用的，其在37-95℃的溫度范圍內(nèi)具有活性。因此，這使得可以使用約37-45℃的第二/退火溫度，其比第一退火溫度低10℃。

154、本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何設(shè)計連接模板和/或擴(kuò)增子末端以實(shí)現(xiàn)5’和3’擴(kuò)增子末端的差異退火，例如實(shí)現(xiàn)各末端退火的不同tm。因此，通過適當(dāng)?shù)脑O(shè)計和選擇適當(dāng)?shù)臈l件，包括溫度，可以獲得平衡，這使得5’端的穩(wěn)定雜交，隨后是3’端的雜交。例如，與連接模板雜交的擴(kuò)增子3’端的序列可能比5’端序列短。作為代表性的實(shí)施例，3’端序列可以至少6個核苷酸長，例如至少7或8個核苷酸長，例如6-20、6-18、6-15或6-12個核苷酸長。5’端序列可以至少12個核苷酸長，例如至少13、14或15個核苷酸長，例如12-30、12-25、12-20、12-18或12-15個核苷酸長。

155、一旦擴(kuò)增子通過連接環(huán)化，它們在步驟(c)中進(jìn)行rca。rca反應(yīng)是本領(lǐng)域眾所周知的，因此這一步驟的條件可以根據(jù)文獻(xiàn)中已知和描述的實(shí)驗方案和原理來設(shè)計或選擇。使用鏈置換聚合酶例如phi29或其衍生物。方便地，連接模板充當(dāng)該第一rca反應(yīng)的引物(即作為“rca引物”)。然而，這不是必需的，可以使用單獨(dú)的rca引物。此外，如果不使用連接模板，則需要提供rca引物。

156、為了確保不發(fā)生不需要的聚合酶催化的延伸反應(yīng)，rca所需的試劑可以在連接步驟后方便地加入到反應(yīng)混合物中。在單一容器方法中，其將在連接步驟后加入。因此，要加入至少含有rca聚合酶的rca混合物。在此之前可以加入其它rca試劑，例如dntp，但一般來說，加入包含rca聚合酶和dntp的rca試劑混合物是方便的。rca實(shí)際混合物通常包括合適的緩沖液和其他成分以幫助rca反應(yīng)，這在本領(lǐng)域是眾所周知的。作為代表性的實(shí)施例，使用phi29聚合酶，rca反應(yīng)可在37℃下進(jìn)行，例如20-40分鐘。

157、在第一rca反應(yīng)之后，在隨后的步驟之前(例如，在加入掛鎖探針之前，或在其連接之前)，可以存在一個步驟來失活所用的rca聚合酶，例如通過加熱。這種熱失活步驟可以例如包括在55-65℃下加熱一段時間，例如5-15分鐘，例如10分鐘。這樣的實(shí)驗方案包括在上述單一容器方案中。

158、因此，在這一熱失活步驟后，如果需要，可以降低溫度使后續(xù)步驟的第一rcp與掛鎖探針接觸并使其雜交。

159、rca反應(yīng)產(chǎn)生串聯(lián)的第一rca產(chǎn)物(rcp)，其包含連接的擴(kuò)增子的互補(bǔ)體的多個重復(fù)拷貝。因此，其包含擴(kuò)增子中存在的靶序列的多個重復(fù)互補(bǔ)拷貝。以這樣的方式，靶序列被擴(kuò)增。靶序列為掛鎖探針提供了結(jié)合位點(diǎn)。因此，第一rcp為掛鎖探針提供了多個結(jié)合位點(diǎn)。因此，更具體地，給定的掛鎖探針的多個拷貝可以與第一rcp雜交。然而，應(yīng)當(dāng)理解，并非第一rcp中的每個可用結(jié)合位點(diǎn)都需要被掛鎖探針占據(jù)或結(jié)合——第一rcp中的一些或多個結(jié)合位點(diǎn)被掛鎖探針結(jié)合就足夠了。更具體地，串聯(lián)的第一rcp的至少一個單體中的靶序列被掛鎖探針結(jié)合，但更具體地，至少2、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、80、100、150、200、300、400、500、700、1000或更多單體。

160、所述方法依賴于能夠與第一rca產(chǎn)物雜交的多種探針。因此，應(yīng)當(dāng)理解，第一rca產(chǎn)物需要可用于探針雜交。這一要求是所有基于rca的檢測方法的特征，其中rca產(chǎn)物是通過探針(例如檢測探針)與產(chǎn)物雜交來檢測，這在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因此，第一rca產(chǎn)物具有低二級結(jié)構(gòu)可能是有利的。然而，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的原理，該特征可以通過在有利于雜交的條件下進(jìn)行來補(bǔ)償。

161、掛鎖探針對靶序列是特異的，因此可用于鑒定或檢測靶序列或其變體。因此，掛鎖探針包含對特定靶序列或特定變體特異的靶特異性結(jié)合區(qū)。因此，靶結(jié)合區(qū)被設(shè)計成與靶序列中的特定序列互補(bǔ)，或區(qū)分或區(qū)別不同的靶序列或變體。在這方面應(yīng)當(dāng)理解，掛鎖探針結(jié)合靶序列的互補(bǔ)體，因為其出現(xiàn)在進(jìn)行rca的擴(kuò)增子中。因此，術(shù)語“靶特異性”在本發(fā)明中廣泛用于指出現(xiàn)在靶分子及其互補(bǔ)體中的靶序列，其中它們中的哪一個實(shí)際上被掛鎖探針結(jié)合將取決于所述方法的精確性以及哪條鏈被擴(kuò)增等。變體特異性或等位基因特異性探針的設(shè)計是本領(lǐng)域已知的，因此掛鎖探針的結(jié)合區(qū)可以容易地設(shè)計以檢測或鑒定所需的靶序列或變體。在檢測變體序列的情況下，掛鎖探針相應(yīng)地對第一個rcp中的靶序列進(jìn)行基因分型，并且可以被稱為基因分型掛鎖探針。

162、如上所述，在檢測變體靶序列的情況下，可以使用兩種或多種掛鎖探針，每種探針特異于不同的變體序列，并且其可以檢測它們中的哪種產(chǎn)生第二rcp，以檢測或鑒定存在哪種變體。

163、掛鎖探針也可以定義為可環(huán)化探針。掛鎖或可環(huán)化探針的用途在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括在rca反應(yīng)中?？森h(huán)化探針包含一個或多個線性寡核苷酸，它們可以連接在一起形成一個環(huán)。掛鎖探針是眾所周知和廣泛使用的，并且在文獻(xiàn)中有廣泛的報道和描述。因此，掛鎖探測的原理是眾所周知的，并且掛鎖探針的設(shè)計和應(yīng)用在本領(lǐng)域中是已知和已被描述的。掛鎖探針通常是線性可環(huán)化的寡核苷酸，其與靶核酸序列或分子雜交的方式使得探針的5’和3’可連接末端并置以直接或間接連接在一起，中間有一個間隙。通過連接探針的雜交的5’和3’端，探針被環(huán)化。應(yīng)當(dāng)理解，為了發(fā)生環(huán)化(連接)，掛鎖探針的可連接5’端具有游離的5’磷酸基團(tuán)。

164、為了使得掛鎖探針的末端的并置用于連接，掛鎖探針被設(shè)計成在其5’和3’端或附近具有靶結(jié)合位點(diǎn)。也就是說，使得掛鎖探針與其靶結(jié)合的互補(bǔ)區(qū)位于或靠近掛鎖探針的末端。

165、為了實(shí)現(xiàn)連接，將待連接的3’和5’端(“可連接的”3’和5’端)與第一rcp中的靶序列雜交，其作為連接模板。根據(jù)探針設(shè)計，掛鎖探針的可連接末端可以以多種方式并置以用于連接。當(dāng)靶結(jié)合位點(diǎn)位于掛鎖探針的末端時，掛鎖探針的結(jié)合可使末端變?yōu)樗龅牟⒅?。在靶分子或序列中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)彼此直接相鄰(或鄰接)時，掛鎖探針的末端將彼此直接相鄰雜交(即沒有間隙)并且可以彼此直接連接。因此，在這種情況下，探針的可連接末端由探針的實(shí)際末端提供。然而，在另一種構(gòu)型中，掛鎖探針是一種間隙填充掛鎖探針，因此掛鎖探針末端的結(jié)合位點(diǎn)不與相鄰結(jié)合位點(diǎn)雜交，而是與靶序列中的非相鄰(非連續(xù))結(jié)合位點(diǎn)雜交。在這種排列下，探針的5’可連接端由探針的實(shí)際5’端提供。然而，探針的可連接3’端是通過探針雜交的3’端的延伸產(chǎn)生的，使用靶序列作為延伸模板來填充探針雜交端之間的間隙。延伸反應(yīng)使探針延伸的3’端并置以便連接。在這種情況下，探針的可連接3’端因此是探針的延伸3’端。

166、在其他實(shí)施方案中，可連接的3’和/或5’端可以通過切割制造或產(chǎn)生。因此，當(dāng)靶結(jié)合位點(diǎn)不位于掛鎖探針的末端，而是位于末端的內(nèi)部，靠近(而不是在)探針的末端時，探針將以探針末端存在未雜交核苷酸的方式與靶雜交。換句話說，在探針雜交之后，在探針的一端或兩端存在突出端(overhang)、瓣(flap)或未雜交的附加序列。如果未雜交的序列在3’端，這將阻止雜交探針的連接，或者實(shí)際上阻止延伸。當(dāng)探針與其靶雜交時(即通過雜交探針的切割)，這些未雜交的區(qū)域或核苷酸可以通過切割，特別是通過酶切割來去除。

167、掛鎖探針與內(nèi)部5’靶結(jié)合位點(diǎn)的雜交將產(chǎn)生具有所謂的5’瓣的結(jié)構(gòu)。以這種方式設(shè)計的掛鎖探針以及用于切割這些探針的程序和酶都是本領(lǐng)域已知的。任何能夠進(jìn)行去除5’瓣的反應(yīng)的酶都可以用于這一步驟，即任何能夠切割、降解或消化不與靶核酸分子雜交的5’單鏈序列的酶，但通常這是具有5’核酸酶和/或結(jié)構(gòu)特異性切割活性的酶。

168、結(jié)構(gòu)特異性切割酶是能夠識別單鏈5’突出端和dna雙鏈體之間的連接并切割單鏈突出端的酶。這類酶是本領(lǐng)域已知的，包括瓣狀核酸內(nèi)切酶(fens)，其是一類具有核酸內(nèi)切活性的酶，能夠催化單鏈和雙鏈dna連接處磷酸二酯鍵的水解裂解。例如，所述酶可以是來自激烈火球菌(p.furiosus,pfu)、閃爍古生球菌(a.fulgidus,afu)、詹氏甲烷球菌(m.jannaschii,mja)或嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌(m.thermoautotrophicum,mth)的天然或重組古細(xì)菌fen1酶。

169、具有5’核酸酶活性的酶包括具有5’核酸外切酶和/或5’核酸內(nèi)切酶活性的酶，同樣，這類酶是本領(lǐng)域已知的，例如taq?dna聚合酶及其5’核酸酶結(jié)構(gòu)域，或核酸外切酶viii。其他例子是recjf和t5核酸外切酶。

170、為了切割未雜交的3’端(或3’瓣)，可以使用具有3’核酸酶活性的酶。這可以是3’核酸外切酶或3’核酸內(nèi)切酶活性?？梢酝ㄟ^具有3’核酸外切酶活性的聚合酶或其3’核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，或通過單獨(dú)的核酸外切酶，例如核酸外切酶i，或通過核酸內(nèi)切酶提供。作為代表性實(shí)施例，所述酶可以是t4?dna聚合酶、t7?dna聚合酶、dna聚合酶i、dna聚合酶i的klenow片段、激烈火球菌(pfu)dna聚合酶和/或沃氏熱球菌(pyrococcus?woesei,pwo)dna聚合酶。

171、特別地，具有3’核酸外切酶活性的聚合酶可用于延伸缺口填充掛鎖探針的雜交3’端的步驟——這類酶將在延伸反應(yīng)發(fā)生之前除去未雜交的3’核苷酸，留下雜交的3’端。具有3’核酸外切酶活性但沒有鏈置換活性的聚合酶是理想的。在循環(huán)實(shí)驗方案的情況下，應(yīng)使用嗜熱聚合酶。其中包括：q5/q5u?dna聚合酶、phusion/phusion?u?dna聚合酶、taq?dna聚合酶、stoffel?dna聚合酶、pwo?dna聚合酶、kappa?dna聚合酶和superfi?dna聚合酶。

172、靶結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離掛鎖探針3’或5’端的位置將決定3’或5’瓣的長度。一般而言，優(yōu)選3’靶結(jié)合位點(diǎn)合理地靠近3’端，例如在3’端的7或6個或更少核苷酸內(nèi)，例如末端的5、4、3、2或1個核苷酸。對于5'靶結(jié)合位點(diǎn)，可以是更長的距離。在一個實(shí)施方案中，“靠近”探針的5’或3’端是指在該末端的12個核苷酸或更少的核苷酸內(nèi)，例如在該末端的10、9、8、7或6個核苷酸內(nèi)。在3’端的情況下，可以例如在末端的8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸內(nèi)或更少，例如在6個核苷酸內(nèi)或更少。

173、在另一個實(shí)施方案中，第一個掛鎖探針的3’端可以包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其包含3’靶結(jié)合區(qū)。換句話說，3’靶結(jié)合區(qū)可以至少部分包含在掛鎖探針3’端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。當(dāng)探針與靶分子雜交時，鏈置換將導(dǎo)致發(fā)夾打開，并使探針的3’端與靶分子雜交。

174、掛鎖探針可以在連接在一起的2個或更多個部分中提供。這可能涉及提供額外的連接模板，例如，在2部分探針的情況下，其中每個部分僅包含一個靶結(jié)合區(qū)，并且每個部分的另一端與共同的連接模板雜交。在另一個實(shí)施方案中，2部分掛鎖可以采取“接頭”寡核苷酸的形式，在5’和3’端或其附近分別具有兩個靶結(jié)合區(qū)，它們與靶雜交，在它們之間有一個間隙，以及在末端之間的間隙中雜交的間隙寡核苷酸。間隙寡核苷酸可以部分或完全填補(bǔ)缺口。

175、然而，在一個典型的實(shí)施方案中，掛鎖以單個可環(huán)化寡核苷酸的形式提供，無論是否為間隙填充掛鎖。

176、在具體實(shí)施方案中，掛鎖探針不具有二級結(jié)構(gòu)，更具體地說，不包含分子內(nèi)雙鏈區(qū)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)。然而，具有二級結(jié)構(gòu)的啞鈴探針是掛鎖探針的一個特殊亞型。啞鈴探針包含兩個莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，莖與莖相連，其中一個“環(huán)”不是閉合的而是開放的，具有可用于彼此連接的自由5’和3’端。這個“開放的環(huán)”作為探針的靶結(jié)合域。閉合的環(huán)的功能只是作為連接雙鏈體末端(莖)的間隔物。換句話說，它可以被視為一種掛鎖探針，在掛鎖的互補(bǔ)序列(區(qū)域)之間形成一個雙鏈體區(qū)域。雙鏈體的區(qū)域作為嵌入劑可以結(jié)合的信號結(jié)構(gòu)域。因此，啞鈴探針的“開放的環(huán)”可以包含互補(bǔ)的靶結(jié)合區(qū)。

177、在另一個實(shí)施方案中，如上所述，掛鎖探針可以包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括探針的3’端。

178、雖然掛鎖探針可以設(shè)計成具有對特定靶序列特異的靶特異性結(jié)合區(qū)域，但是應(yīng)當(dāng)理解非特異性雜交可能發(fā)生，特別是在序列相似的變體靶序列的情況下(例如，當(dāng)變體是單核苷酸變體，如snps等)。然而，掛鎖探針的高特異性源于這種非特異性雜交的掛鎖探針不能被連接(因此任何這樣未連接的掛鎖探針不會被隨后的rca步驟擴(kuò)增)。因此，在本文方法的第二個連接步驟中，已與其靶序列的互補(bǔ)體雜交的掛鎖探針被連接(即，已經(jīng)正確地與它們想要檢測的靶序列的互補(bǔ)體雜交的掛鎖探針，或者換句話說，它們相應(yīng)的或同源的，或各自的靶序列)。

179、(掛鎖探針的)第二次連接可以在與第一次類似的條件下進(jìn)行。一般來說，掛鎖探針可以加入到反應(yīng)混合物的連接混合物中，即加入到包含連接試劑的試劑混合物中。這可能與前面連接步驟中使用的連接混合物/試劑相似或相同。在一個實(shí)施例中，可以包括添加連接酶。然而，如果熱穩(wěn)定的連接酶用于第一次連接，則可能不需要進(jìn)一步加入連接酶。顯然，在該步驟中不需要單獨(dú)的連接模板，因為連接是由掛鎖探針結(jié)合的第一rcp作為模板。因此，第二次連接是模板連接。

180、對于步驟(b)中的前述擴(kuò)增子連接，在某些實(shí)施方案中，步驟(e)中的連接可以在聚合酶延伸雜交的掛鎖探針3’端的能力被抑制的條件下進(jìn)行。這包括來自原始反應(yīng)混合物的擴(kuò)增聚合酶和rca聚合酶。rca聚合酶可以在之前的加熱步驟中失活。特別地，這可以確保任何已雜交但未連接的掛鎖探針不會進(jìn)行其雜交的3’端的任何不需要的延伸。應(yīng)當(dāng)理解，這適用于掛鎖探針的預(yù)期可連接的3’端。因此，如果可連接的3’端是通過間隙填充延伸反應(yīng)產(chǎn)生的，則連接反應(yīng)的條件使得可連接的3’端不再進(jìn)一步延伸。確保這些條件的策略如上所述。因此，這可能涉及在間隙填充延伸已經(jīng)發(fā)生之后對為間隙填充延伸步驟添加的任何聚合酶的酶促降解?；蛘?，可以通過加熱使延伸聚合酶失活。在需要將所需序列摻入第二rca模板的情況下，例如為了進(jìn)一步擴(kuò)增，間隙填充掛鎖可能是有用的。在一個實(shí)施方案中，這可以用于例如ngs菌落的產(chǎn)生。

181、在不需要間隙填充延伸的掛鎖探針的情況下，任何擴(kuò)增聚合酶可以在之前的第一個清除步驟中通過酶消化而失活，如果所述步驟包括在所述方法中的話。如果這樣的酶消化不包括在第一次清除步驟中，或者不進(jìn)行第一次清除步驟，那么類似地可以通過如上所述控制掛鎖探針的雜交，即使用不同的退火溫度，用掛鎖探針的2步雜交，可以避免不需要的延伸。

182、在連接步驟后，將反應(yīng)混合物中任何未連接的探針除去或使其呈惰性可能是理想的或有利的。呈惰性是指掛鎖探針不能參與任何不需要的雜交或連接反應(yīng)。特別地，探針的3’端不能與混合物中存在的任何核酸雜交并引發(fā)延伸反應(yīng)。在這方面，可能特別需要確保在連接反應(yīng)后保留在混合物中的未連接的掛鎖探針在第二rcp產(chǎn)生時不能與第二rcp雜交。因此，實(shí)際上可以在這一階段執(zhí)行清除步驟(這可以是第一次或第二次清除，取決于是否執(zhí)行了第一次清除)。在單一容器方法的情況下，將包括兩個清除步驟?？梢约尤肭宄噭┗旌衔飦韺?shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

183、清除試劑可以是降解未反應(yīng)探針的消化酶，例如如上所述具有核酸外切酶活性的酶。使用這種酶時，在隨后的第二rca步驟(步驟(f))之前，通過加熱使其失活。例如，如果使用λ核酸外切酶，反應(yīng)混合物可以在30-37℃下孵育10-20分鐘，然后在約70-75℃下熱失活10-30分鐘?？梢愿鶕?jù)所使用的具體試劑而適當(dāng)變化，并且確定和優(yōu)化消化和失活條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技能范圍以內(nèi)。

184、可替代地或另外地，可以進(jìn)行稀釋步驟以進(jìn)行所述清除。因此，可以向反應(yīng)混合物中加入一定體積的稀釋劑。特別地，反應(yīng)混合物可以被稀釋至少4×。如上所述，當(dāng)所述方法用于檢測序列變異體時，通常優(yōu)選通過酶消化進(jìn)行清除。

185、可替代地或另外地，可以使用形成發(fā)夾的掛鎖探針。這類探針包含自互補(bǔ)序列，其可以相互雜交形成包含探針3’端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾的莖可以被設(shè)計成具有熱穩(wěn)定性，其不阻止發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)和第一rcp中的靶序列之間的雜合體的形成，也不抑制rca。然而，莖對于引發(fā)延伸是足夠穩(wěn)定的，并且因此將未連接的掛鎖探針轉(zhuǎn)化為完整的發(fā)夾，其不能和第二rca產(chǎn)物雜交或使用第二rca產(chǎn)物作為延伸模板引發(fā)延伸。這種可以失活的掛鎖探針被稱為自殺掛鎖探針。在us?6,573,051中也描述了自殺掛鎖探針。

186、使用連接的掛鎖探針作為第二rca模板進(jìn)行第二rca反應(yīng)。為了引發(fā)第二rca，將第二rca試劑混合物與含有連接的掛鎖的反應(yīng)混合物接觸(例如加入)。一般而言，這將涉及添加rca聚合酶，其可以如上所述，并且可以如上所述在試劑混合物中提供。雖然用于第二rca的所有試劑可以在一個試劑混合物中一起添加，但單獨(dú)或逐步添加它們可能是有利的。第二rca由單獨(dú)的rca引物引發(fā)。其可以與掛鎖探針預(yù)雜交，或可以單獨(dú)地加入到反應(yīng)混合物中，或包含在rca試劑混合物中。rca引物的結(jié)合位點(diǎn)可以在掛鎖探針的不同于靶結(jié)合區(qū)的區(qū)域(例如，在掛鎖的骨架區(qū)域中，在靶結(jié)合末端之間)中提供。

187、在一個實(shí)施方案中，用于第二rca的rca引物可以包括在清除試劑混合物中。在另一個實(shí)施方案中，其可以與清除試劑混合物同時單獨(dú)地加入。在另一個實(shí)施方案中，可以在待清除的核酸外切酶失活后將其加入到反應(yīng)混合物中。第二rca可以此時由加入包含rca聚合酶和dntp的rca試劑混合物來引發(fā)。在另一個實(shí)施方案中，在第一步中加入rca聚合酶，然后dntp和rca引物被單獨(dú)地加入。

188、當(dāng)rca引物包含在清除混合物中時，硫代磷酸酯鍵的存在可以保護(hù)其不被消化?；颍怂嵬馇忻缚捎糜诮到怆p鏈dna和具有5’磷酸基團(tuán)的單鏈dna的清除；掛鎖探針具有5’磷酸基團(tuán)并因此被這種核酸外切酶降解，并且rca引物可以不具有5’磷酸基團(tuán)并因此可以免于被核酸外切酶消化。所述核酸外切酶的一個例子是λ核酸外切酶。

189、在另一個實(shí)施方案中，未連接的掛鎖探針的清除可以通過rca聚合酶進(jìn)行。因此，phi29具有3’核酸外切酶活性，其可用于消化未連接的掛鎖。在這樣的實(shí)施方案中，可以添加具有3’核酸外切酶的rca聚合酶，并且可以使所述酶進(jìn)行消化(即，可以孵育反應(yīng)混合物)。隨后，可以進(jìn)行rca反應(yīng)。在這種情況下，可以通過添加引物和核苷酸使rca反應(yīng)得以進(jìn)行來實(shí)現(xiàn)。因此，在本實(shí)施方案中，可以在進(jìn)行第二rca反應(yīng)之前，出于清除目的，在第二rca步驟之前加入rca聚合酶。

190、如上所述，用于進(jìn)行rca反應(yīng)的試劑、程序和實(shí)驗方案是本領(lǐng)域已知的，并且可以在此使用。

191、本發(fā)明的方法需要一個以環(huán)化擴(kuò)增子為模板的第一rca步驟，和至少一個由環(huán)化掛鎖探針為模板的第二rca步驟。所述方法可包括另外的的rca步驟，以使用第二、第三或第四掛鎖探針等產(chǎn)生第三或另外的rca產(chǎn)物，每個rca產(chǎn)物靶向靶核酸序列。換句話說，如果需要，可以重復(fù)步驟(d)至(f)?？梢詸z測最終一代rca產(chǎn)物。

192、應(yīng)當(dāng)理解，這種rca的進(jìn)一步產(chǎn)生可以增加最終檢測到的信號。這可能會相應(yīng)地導(dǎo)致信號放大的增加。然而，還應(yīng)理解，當(dāng)?shù)谝缓土硗獾膾戽i探針是間隙填充掛鎖時，這將導(dǎo)致靶核苷酸序列或其一部分的拷貝的合成增加(取決于連續(xù)的間隙填充反應(yīng)是完全重疊地還是部分地重疊)。換句話說，所述方法可能導(dǎo)致大量填充序列的克隆產(chǎn)物。換句話說，填充序列(即靶核酸序列或其一部分)可以被擴(kuò)增。這對于制備反應(yīng)是有用的。如果多個連續(xù)的(即兩個或更多個)第一和另外的的掛鎖探針連接步驟涉及相同或重疊序列的間隙填充，則可以產(chǎn)生特定靶序列的更多拷貝。

193、檢測第二種或如上所述的另外的rcp產(chǎn)物以檢測靶核酸序列。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以使rcp呈可檢測。例如，其可以具有可檢測的標(biāo)記或可以使其被檢測到的方法。方便地，在一個實(shí)施方案中，檢測試劑可以用于實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。這將在下文被更詳細(xì)地描述。然而，簡而言之，用于檢測第二或另外的rcp的檢測試劑可以與添加到反應(yīng)混合物中的一種或多種rca試劑包括在一起，或者檢測試劑可以在第二或另外的rcp已經(jīng)產(chǎn)生之后添加到試劑混合物中?；蛘?，可以在rcp產(chǎn)生時將標(biāo)記摻入rcp中，例如，使用標(biāo)記的核苷酸。

194、在一個有利的實(shí)施方案中，檢測試劑是與rcp雜交的檢測寡核苷酸，如下文進(jìn)一步所述。通過檢測所述檢測寡核苷酸來檢測rcp。在這方面，檢測寡核苷酸可以具有標(biāo)記或一些其他可檢測部分。

195、為了進(jìn)行實(shí)際的檢測，反應(yīng)混合物或其一部分試樣可以從容器中取出并移動到檢測儀器中，或者在檢測之前進(jìn)行進(jìn)一步處理。因此，在一個實(shí)施方案中，與檢測試劑的接觸可以發(fā)生在進(jìn)行該方法的前述步驟的反應(yīng)容器的外部。

196、所述方法可以異質(zhì)或同質(zhì)形式進(jìn)行。也就是說，它可以在固相(或載體)上，或在溶液或懸浮液中(即沒有固相或載體)，或?qū)嶋H上在兩者上進(jìn)行，因為固相可以在后面的階段引入，例如，在檢測第二rcp的步驟，或在產(chǎn)生第二rcp的階段等。在這點(diǎn)上，在所述方法的單一容器實(shí)施方案中，直到產(chǎn)生第二rcp，應(yīng)該理解的是，任何固相將是可以添加到容器中的固相，例如顆粒固相如珠，或者固相將由容器本身提供(例如容器的壁和/或底部)。

197、所述方法的形式可以基于樣本或靶核酸分子的性質(zhì)，或所用的所需要的讀出或檢測技術(shù)來選擇。在一個實(shí)施方案中，所述方法是溶液內(nèi)的方法，即在容器中包含的液相中進(jìn)行的方法。

198、從以上描述將注意到，所述方法涉及不同步驟內(nèi)和步驟之間的溫度變化。事實(shí)上，所述方法的一個特征是其是在溫度控制下進(jìn)行的，至少對于不對稱pcr步驟是如此。方便地，所述方法可以在熱循環(huán)儀器中進(jìn)行。這使得可以對溫度變化的快速控制。

199、如上所述，所述方法包括試劑與靶核酸分子或隨后的反應(yīng)混合物接觸的多個步驟。方便地，它們可以加入到含有初始反應(yīng)混合物的容器中。試劑可以方便地加入到緩沖液中。換句話說，在上述方法的步驟中使用的各種試劑混合物通常包括緩沖液。特別是在單步方法的情況下，所述方法的步驟在同一反應(yīng)容器中進(jìn)行，沒有介于中間的洗滌步驟。在這種情況下，或者實(shí)際上即使不是在單一容器形式中，用于添加各種試劑的緩沖液也需要是相容的。在一個實(shí)施方案中，所有各種試劑或試劑混合物使用相同的緩沖液。

200、靶核酸分子可以存在于樣本內(nèi)，或從樣本獲得。樣本可以是任何樣本，其包含來自任何來源或任何起源的任何量的核酸的，需要在其中檢測靶核酸分子中的靶核酸序列。因此，樣本可以是任何臨床或非臨床樣本，并且可以是其中可能存在靶核酸分子的任何生物、臨床或環(huán)境樣本。

201、樣本可以是含有靶核酸分子的任何樣本，包括天然樣本和合成樣本，即天然存在的材料或已制備的制劑。天然發(fā)生的樣本可以在經(jīng)受本發(fā)明的方法之前進(jìn)行處理或加工。包括所有生物和臨床樣本，例如生物體的任何細(xì)胞或組織樣本，或任何體液或由其衍生的制劑，以及如細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞制劑、細(xì)胞裂解物等的樣本。還包括環(huán)境樣本，如土壤和水樣本或食物樣本。樣本可以是新鮮制備的，或可以以任何方便的方式進(jìn)行預(yù)處理，例如用于儲存。

202、因此，代表性的樣本包括可能含有靶核酸分子的任何材料，包括例如食品和相關(guān)產(chǎn)品、臨床和環(huán)境樣本。樣本可以含有任何病毒或細(xì)胞物質(zhì)，包括所有原核或真核細(xì)胞、病毒、噬菌體、支原體、原生質(zhì)體和細(xì)胞器。因此，這種生物材料可以包括所有類型的哺乳動物和非哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類(包括藍(lán)綠藻)、真菌、細(xì)菌、原生動物等或病毒。細(xì)胞可以是例如人類細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、爬行動物細(xì)胞等，沒有限制。

203、因此，代表性的樣本包括全血和血液衍生產(chǎn)品，例如血漿、血清和血沉棕黃層、血細(xì)胞、尿液、糞便、腦脊液或任何其他體液(例如呼吸道分泌物、唾液、乳汁等)、組織、活組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞懸浮液、條件培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)成分的其它樣本等?？梢砸匀魏畏奖慊蛩枰姆绞綄颖具M(jìn)行預(yù)處理以準(zhǔn)備用于所述方法，例如，通過細(xì)胞裂解或純化、核酸分離等。

204、在一個實(shí)施方案中，所述樣本包含從臨床樣本或臨床樣本培養(yǎng)物中分離的微生物細(xì)胞或病毒。在這樣的樣本中，靶核酸分子可以是存在于微生物細(xì)胞中的核苷酸序列，例如在任何水平上，例如在類(type)、群(group)、綱(class)、屬(genus)、種(species)或株系(strain)水平上，微生物細(xì)胞或病毒的特征性的、或區(qū)別性的或有識別性的核苷酸序列。

205、在另一個實(shí)施方案中，樣本可以包含無細(xì)胞dna。樣本可以是直接含有無細(xì)胞dna的樣本例如血漿或血清，或者可以是分離的無細(xì)胞dna。

206、在另一個實(shí)施方案中，樣本可以包含外泌體。

207、由于靶核酸分子本身不必是分析的靶分析物，但可以是例如在任何所需分析物的分析過程中使用或產(chǎn)生的報道分子，因此樣本不必是天然含有核酸的樣本，或核酸的來源(例如細(xì)胞或病毒，或生物或臨床材料等)。如上所述，樣本可以是合成的或人造的樣本。因此，其可以是已經(jīng)對其中已經(jīng)產(chǎn)生靶核酸或已經(jīng)添加靶核酸分子的分析物進(jìn)行檢測測定的樣本。其可以是反應(yīng)混合物或反應(yīng)產(chǎn)物，例如由檢測靶分析物的免疫分析產(chǎn)生的產(chǎn)物，例如免疫pcr、免疫rca或鄰位檢測(例如臨近連接檢測(pla)或鄰位延伸檢測(pea))。

208、靶分析物可以是所需要檢測的任何分析物。如上所述，在實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的靶核酸分子是靶分析物。在其他實(shí)施方案中，其中靶核酸分子是報告分子，靶分析物可以是所需要檢測的任何分析物。分析物可以是核酸、蛋白質(zhì)(該術(shù)語包括肽和多肽)、或任何其他化學(xué)或生物分子或部分，包括例如碳水化合物，例如可以作為蛋白質(zhì)上的糖基出現(xiàn)。因此，靶分析物可以是經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，例如，具有在分析物的檢測中檢測到的翻譯后修飾。

209、在一個實(shí)施方案中，靶分析物可以是在細(xì)胞或囊泡或其他細(xì)胞或亞細(xì)胞區(qū)室的表面上檢測到的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)分子的組分。例如，細(xì)胞外囊泡或外泌體可以通過其表面存在的不同蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測和區(qū)分。已經(jīng)提出以前列腺體作為前列腺癌的生物標(biāo)志物，并且可以通過檢測其上的一種或多種表面蛋白來檢測和區(qū)分特定的或選定的前列腺體或其他細(xì)胞外囊泡。

210、掛鎖探針可包含一個或多個另外的的序列，這些序列可用于將序列引入連接產(chǎn)物，從而引入rcp(作為互補(bǔ)拷貝)。這可以是例如標(biāo)簽或檢測序列，例如條形碼(barcode)或識別基序，或者檢測探針或引物的結(jié)合位點(diǎn)。對于掛鎖探頭來說尤其如此。這種另外的的序列可以在例如掛鎖探針的骨架區(qū)域的一部分中找到，即靶結(jié)合區(qū)之間的區(qū)域。在啞鈴探針中，它可以在探針的雙鏈體區(qū)。標(biāo)簽如條形碼或探針/引物結(jié)合位點(diǎn)可以根據(jù)不同的需要/目的進(jìn)行設(shè)計，例如，引入通用或共用序列，以使多重設(shè)置中的不同連接探針能夠一起被處理或檢測，例如樣本索引等，或者引入通用或共用擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)。這將使得不同的連接探針能夠一起擴(kuò)增，例如在通過pcr或rca的文庫擴(kuò)增中。

211、特別地，掛鎖探針可以包含能被檢測到的檢測序列。檢測序列的互補(bǔ)體將被整合到第二(或進(jìn)一步的)rcp中，并且可以被檢測到，例如通過檢測探針與其結(jié)合，或者通過測序。檢測序列可以對掛鎖探針特異，并因此對所需要檢測的靶序列或序列變體特異。因此，每個掛鎖探針可以具有不同的檢測序列。檢測序列可被檢測以檢測或鑒定哪個掛鎖探針在rca中被擴(kuò)增，從而存在哪個靶序列。例如，所述實(shí)驗方案可以應(yīng)用于用于檢測靶序列變體的方法的情形中，其中每個掛鎖提供有對特定變體特異的檢測序列。因此，檢測序列可以被視為標(biāo)記或識別序列。本發(fā)明使用的術(shù)語“檢測序列”包括出現(xiàn)在掛鎖探針中的檢測序列和出現(xiàn)在rcp中的互補(bǔ)拷貝。

212、因此，標(biāo)簽/條形碼序列，特別包括檢測序列，可用于“標(biāo)記”不同的掛鎖探針，以便它們或它們的連接或擴(kuò)增產(chǎn)物可以容易地彼此區(qū)分。此外，這樣的序列可用于標(biāo)記不同的樣本等，例如，以便它們可以被池化(即“樣本”標(biāo)簽或標(biāo)記)。因此，在多重設(shè)置中，不同的探針(即用于不同靶核酸序列或不同變體的探針)可以具有不同的標(biāo)簽序列(例如不同的標(biāo)記或檢測序列)和/或它們可以具有相同的標(biāo)簽序列，例如用于引入共同或通用序列。這些方法可以與特定的檢測方法結(jié)合使用，包括使用檢測探針或測序方法，例如通過雜交測序、通過連接測序或其他下一代測序化學(xué)，例如在樣本中多重檢測多個靶核酸。

213、本發(fā)明所用的術(shù)語“雜交”是指在核苷酸序列之間形成雙鏈體，所述核苷酸序列充分互補(bǔ)以通過沃森-克里克堿基配對或任何類似的堿基對相互作用形成雙鏈體。當(dāng)兩個核苷酸序列共享堿基對組織同源性時，它們彼此“互補(bǔ)”。因此，分子、探針或序列中的互補(bǔ)區(qū)是指分子、探針或序列中能夠形成雙鏈體的部分。雜交不需要序列之間100％的互補(bǔ)，因此彼此互補(bǔ)的區(qū)域不需要序列間完全互補(bǔ)，盡管這并不被排除。因此，互補(bǔ)區(qū)可以包含一個或多個錯配。因此，本文所用的“互補(bǔ)的”是指“功能互補(bǔ)的”，即足以介導(dǎo)高產(chǎn)的雜交的互補(bǔ)程度，包括互補(bǔ)性程度小于100％?？赏ㄟ^適當(dāng)調(diào)節(jié)雜交條件來控制容許的錯配程度。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域提供的指導(dǎo)，根據(jù)經(jīng)驗確定雙鏈體穩(wěn)定性，考慮多個變量，包括例如各個分子或探針寡核苷酸的長度和堿基對組成、離子強(qiáng)度和錯配堿基對的發(fā)生率。因此，合適的探針、連接模板或引物及其結(jié)合區(qū)的設(shè)計，以及它們與其各自靶雜交的條件，完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技能范圍內(nèi)。

214、互補(bǔ)區(qū)，例如，與掛鎖探針中結(jié)合區(qū)的靶序列，或檢測序列和檢測探針之間的互補(bǔ)區(qū)，或環(huán)化掛鎖探針的rca引物，或靶核酸分子/序列的pcr引物，或擴(kuò)增子的連接模板等?？梢允侵辽?個核苷酸長，以確保結(jié)合的特異性，或者更具體地，至少有7、8、9或10個核苷酸長。該區(qū)域長度的上限并不重要，但可以是例如高達(dá)50、40、35、30、25、20或15個核苷酸?；パa(bǔ)區(qū)的長度可以因此在上述長度下限和長度上限中的任何一個范圍之間。在掛鎖探針的情況下，單個靶結(jié)合區(qū)的長度可以在較低范圍內(nèi)，因此當(dāng)與其靶雜交時，兩個結(jié)合區(qū)的總長度在上限的范圍內(nèi)。例如，單個靶結(jié)合區(qū)可以是8-15個，例如10-12個核苷酸，使得總雜交長度為16-30個核苷酸長，例如20-24。在探針的構(gòu)象、結(jié)構(gòu)域的間距以及所需要的或有利的雜交的限制下，這樣是可取的：最小化掛鎖探針的總長度以使受rca的環(huán)的尺寸最小化，從而最小化互補(bǔ)區(qū)的長度。

215、第二rcp(和/或任何進(jìn)一代rcp)可使用任何方便的實(shí)驗方案進(jìn)行檢測。根據(jù)待檢測的靶序列、方法的目的和/或方法中所用程序的具體細(xì)節(jié)，所采用的檢測實(shí)驗方案可以非特異性或特異性地檢測rcp。

216、例如，可以直接檢測rcp，例如可以切割多聯(lián)體以產(chǎn)生單體，這些單體可以使用凝膠電泳進(jìn)行檢測，或者更典型地通過與rcp中和檢測序列(其或者可以稱為檢測探針)雜交的經(jīng)標(biāo)記的檢測寡核苷酸雜交，如上所述。然而，檢測寡核苷酸不需要直接標(biāo)記。例如，檢測寡核苷酸可以是用作夾心探針的未標(biāo)記探針。夾心探針的概念在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且可以根據(jù)任何方便的實(shí)驗方案進(jìn)行應(yīng)用。夾心探針可以結(jié)合到rcp上，但本身不被直接標(biāo)記；相反，它們包含經(jīng)標(biāo)記的二級寡核苷酸可以結(jié)合的序列，從而在rcp和經(jīng)標(biāo)記的二級寡核苷酸之間形成“三明治”結(jié)構(gòu)。

217、可以使用非序列特異性核酸標(biāo)記方法，例如文獻(xiàn)中眾所周知的dna結(jié)合染色劑或染料，或者通過使用經(jīng)標(biāo)記的核苷酸摻入rcp?；蛘?，可以間接地檢測rcp，例如產(chǎn)物可以通過pcr擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物可以被檢測。

218、可以使用文獻(xiàn)中已知的任何一種成熟建立的核酸分子分析方法來檢測rcp，包括液相色譜法、電泳法、質(zhì)譜法，包括cytof、顯微術(shù)、實(shí)時pcr、熒光探針、芯片法、比色分析法例如elisa、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜法，或通過濁度、磁性、粒子計數(shù)、電、表面?zhèn)鞲谢蚧谥亓康臋z測技術(shù)。一般來說，這些技術(shù)與溶液內(nèi)分析相關(guān)。

219、經(jīng)標(biāo)記的檢測寡核苷酸可以用任何可以直接或間接發(fā)出信號的可檢測的標(biāo)簽來標(biāo)記。例如，標(biāo)簽可以是光譜或顯微術(shù)可檢測的，例如它可以是熒光或比色標(biāo)記、微?；蛎笜?biāo)簽?？梢允褂妹庖呓M織化學(xué)技術(shù)中使用的任何標(biāo)簽。

220、在用于檢測不同靶序列和/或變異靶序列的多重程序中，不同的第二或另外的rcp可以通過原位測序來檢測和區(qū)分，包括例如合成測序、雜交測序和連接測序、下一代測序和/或順序條形碼解碼技術(shù)，包括合成測序、連接或雜交，和/或通過使用檢測探針。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，根據(jù)多重化的水平，可以使用組合標(biāo)記方法。例如，srca產(chǎn)物中的大量重復(fù)序列可以通過使用熒光或其他分光光度可檢測探針的比率標(biāo)記來區(qū)分大量此類產(chǎn)物。這類比率標(biāo)記的檢測探針可用于流式細(xì)胞術(shù)或顯微檢測技術(shù)(如成像)以檢測大量序列，例如，至少兩種熒光團(tuán)以不同比率組合可產(chǎn)生多個熒光標(biāo)簽群。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用不同比例的兩種熒光團(tuán)的組合，可以產(chǎn)生7種不同的群體。這可以使用3或4色組合進(jìn)行擴(kuò)展。

221、在涉及使用檢測寡核苷酸的方法中，檢測寡核苷酸或任何二級標(biāo)記寡核苷酸可以用直接或間接可檢測的標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記?？芍苯訖z測的標(biāo)簽是不使用額外試劑即可直接檢測的標(biāo)簽，而可間接檢測的標(biāo)簽是通過使用一種或多種額外試劑可檢測的標(biāo)簽，例如，其中標(biāo)簽是由兩種或多種成分組成的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員。在許多實(shí)施例中，標(biāo)簽是可直接檢測的標(biāo)簽，其中感興趣的可直接檢測的標(biāo)簽包括但不限于：熒光標(biāo)簽、放射性同位素標(biāo)簽、化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽等。在許多實(shí)施方案中，標(biāo)簽是熒光標(biāo)簽，其中在這些實(shí)施方案中使用的標(biāo)記試劑是熒光標(biāo)記的核苷酸，例如熒光標(biāo)簽的ctp(如cy3-ctp、cy5-ctp)等?？捎糜跇?biāo)記核苷酸以產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的探針核酸(即檢測探針)的熒光部分包括但不限于：熒光素、花青染料，例如cy3、cy5、alexa?555、bodipy?630/650等。也可采用本領(lǐng)域已知的其他標(biāo)簽，如上述標(biāo)簽。

222、雖然可以采用各種檢測方式，但第二或另外的rcp可以通過顯微術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)檢測。在這兩種情況下，可以使用直接或間接標(biāo)記的檢測寡核苷酸，例如，帶有易于檢測的熒光標(biāo)簽。特別地，在基于顯微術(shù)的方法中，可以通過成像來檢測rcp。

223、這種檢測技術(shù)的使用有利地使得第二或進(jìn)一步的rcp被數(shù)字地記錄。實(shí)際上，由于由本方法提供的信號放大程度使得第二或進(jìn)一步的的rcp可視化，它們可以由相機(jī)或包括相機(jī)的任何設(shè)備(例如移動電話)檢測。

224、為了檢測以同質(zhì)形式產(chǎn)生的第二或進(jìn)一步的的rcp，可以將其捕獲或帶到固體支持物或表面上以便于成像或更廣泛的顯微檢測。第二rcp是第二代rca產(chǎn)品，更大且更重，因此易于通過離心作用將其帶到表面。因此，例如，可容易地旋轉(zhuǎn)試管或平板，使第二rcp降到試管或孔的底部，以便用顯微術(shù)進(jìn)行檢測，特別是成像。

225、所述方法中待檢測的變體序列可包含一個或多個變體堿基。因此，其可以是單核苷酸變體，例如單核苷酸多態(tài)性(snp)或突變，或者其可以包含兩個或多個堿基。因此，變體序列可以包含一段核苷酸，其中2個或更多個堿基可以是變體的。變體堿基可以是連續(xù)的或非連續(xù)的。

226、靶序列的長度并不重要，可根據(jù)環(huán)境、靶分子的性質(zhì)、靶序列或變體位置或位點(diǎn)而變化。因此，僅作為代表性實(shí)例，靶序列可以是1至10，例如1-15、1-12、1-10、1-8、1-7或1-6個核苷酸長。然而，在這樣的實(shí)施方案中，比單個核苷酸更長的靶序列可能有益于提高特異性，并且在這樣的實(shí)施方案中，靶序列可以是2、3、4、5或6個核苷酸中的任一個至6、7、8、9、10、12、15或20個核苷酸中的任一個長。因此，示例性靶序列可以是例如4-10、4-8、4-7、4-6、5-10、5-8、5-7或6-8個核苷酸長。

227、如上所述，本發(fā)明還提供了用于實(shí)施所述方法的試劑盒。試劑盒可包括如上所述的pcr引物和掛鎖探針，任選地連同一種或多種連接模板，和/或一種或多種試劑和/或試劑盒使用說明。此類試劑包括dntp、聚合酶和連接酶，以及用于第一和/或第二rca反應(yīng)的rca引物。此外，組分可以包括用于一個或多個不同反應(yīng)的緩沖液或其他反應(yīng)組分。另外的可選的組分可以包括用于檢測第二或進(jìn)一步的rcp的工具或試劑。這可以包括，例如，檢測寡核苷酸和任何必要的二級標(biāo)記試劑，包括，例如，如上所述的那些。其他任選的組分可以包括固體支持物和/或用于捕獲和/或固定靶核酸分子或反應(yīng)組分的工具。說明書可以為例如印刷形式，或在計算機(jī)可讀介質(zhì)上，或為網(wǎng)站地址。

228、上文討論了本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)在檢測復(fù)雜樣本中的靶序列或變體，或者在它們以低豐度存在的情況下特別有益。如上所述，本方法提供了高度的信號放大，使得所述方法非常靈敏。因此，所述方法特別適合于檢測或鑒定非常罕見的序列變體。例如，所述方法可用于發(fā)現(xiàn)和檢測患者樣本中腫瘤衍生的突變dna序列，尤其包括血漿中的無細(xì)胞dna，例如循環(huán)腫瘤dna。因此，所述方法可用于診斷或監(jiān)測癌癥，或例如揭示癌癥的復(fù)發(fā)。所述方法可用于任何無細(xì)胞dna，也可用于產(chǎn)前檢測，特別地包括nipt。該技術(shù)快速，對儀器要求低，并可對序列變體進(jìn)行多重分析以提高靈敏度。

229、低頻率或罕見序列變體或突變的檢測也需要檢測的高特異性，以及最小化引入可能被誤認(rèn)為變體序列的人工序列改變的風(fēng)險。本方法還將有限的pcr周期與rca擴(kuò)增相結(jié)合，并通過需要雙重靶識別的掛鎖探針鎖定靶序列。

230、在本方法中，第一rcp以高度特異性的方式產(chǎn)生，并且高擴(kuò)增的第二rcp的產(chǎn)生依賴于第一rcp的存在。

231、每個rca產(chǎn)物通常包含數(shù)百個，或者在某些情況下大約數(shù)千個，用于產(chǎn)生它的rca模板環(huán)(例如環(huán)化擴(kuò)增子或掛鎖探針)的互補(bǔ)體。第二rca產(chǎn)物是通過對第一rca產(chǎn)物上的環(huán)化掛鎖探針進(jìn)行rca而獲得的，因此可以包含例如1000×1000個單體序列，因此具有大尺寸，并且可以具有達(dá)到幾十千兆道爾頓的分子量。此外，如上所述，單體序列的進(jìn)一步的拷貝可以通過更進(jìn)一步的rca反應(yīng)的而產(chǎn)生。這種反應(yīng)產(chǎn)物容易被檢測到。第二rca產(chǎn)物的尺寸可以達(dá)到幾微米，并且可以容易地作為單獨(dú)的產(chǎn)物可視化，例如通過顯微鏡。每一秒或更進(jìn)一步，rca產(chǎn)物可以作為克隆產(chǎn)物被檢測，從單個靶核酸分子產(chǎn)生，而不需要rca反應(yīng)進(jìn)行區(qū)分。例如，當(dāng)用熒光檢測探針標(biāo)記時，突出的明亮熒光反應(yīng)產(chǎn)物使得在低放大倍數(shù)(例如20倍)下在寬視野中計數(shù)和區(qū)分單個分子的單獨(dú)擴(kuò)增產(chǎn)物。第二或進(jìn)一步的rca反應(yīng)產(chǎn)物足夠大和亮，可以用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀記錄。這使得使用常規(guī)可得到的儀器在幾分鐘內(nèi)迅速地進(jìn)行計數(shù)和數(shù)字評分，從而在寬動態(tài)范圍內(nèi)提供出色的定量精度。如上所述，串聯(lián)的第二或進(jìn)一步的rca產(chǎn)物中存在的重復(fù)序列使得可以通過比率標(biāo)記技術(shù)分析用不同的熒光團(tuán)組合標(biāo)記的產(chǎn)物，從而允許增加的多重性。由于srca產(chǎn)物體積大、分子量大，因此也可以通過在普通臺式離心機(jī)或類似設(shè)備中離心來富集。實(shí)際上，低速離心或單位重力可能就足夠了。因此，本發(fā)明的新方法實(shí)現(xiàn)了多個優(yōu)勢。

232、如上所述，由第二rca反應(yīng)提供的強(qiáng)信號放大使得信號迅速和容易的可視化，例如在低放大倍數(shù)下的顯微鏡下或在數(shù)字掃描的圖像上，因此使得在臨床情況下快速和容易地可視化檢查結(jié)果，例如在常規(guī)使用中檢查病理學(xué)結(jié)果。因此，本發(fā)明的方法特別適用于臨床分析程序。

233、所述方法有助于鑒定人類組織中病毒基因組的罕見整合拷貝，或檢測罕見的rca產(chǎn)物，例如在組織中的低效突變檢測中。當(dāng)容易識別罕見事件可能有幫助時，另一個例子是在占絕大多數(shù)的非ctc細(xì)胞中篩選循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)的存在。所述方法產(chǎn)生的強(qiáng)信號使得可以在低放大倍數(shù)下快速、容易地識別事件(檢測ctc)。

234、所述方法使得檢測化驗加速，這在醫(yī)療點(diǎn)如醫(yī)生辦公室等可能是有價值的。在這方面，第二rca可以在相對短的時間內(nèi)執(zhí)行。

235、能夠在單一反應(yīng)容器中執(zhí)行所述方法的一個顯著的優(yōu)勢是使得可以實(shí)現(xiàn)自動化。

236、此外，信號強(qiáng)度/速度的增加可以使得除傳統(tǒng)的基于熒光的方法之外的其他檢測手段，例如使用濁度法、磁性、粒子計數(shù)、電學(xué)、表面?zhèn)鞲泻突谥亓康臋z測技術(shù)。例如，來自第二rca的一個單獨(dú)的srca產(chǎn)物在1小時擴(kuò)增后具有幾飛克的潛在重量。這種重量增加可以通過本領(lǐng)域已知的方法和手段來檢測，例如懸臂、表面等離子體方法和微天平，例如石英晶體微天平等。此外，如上所述，第二rcp增加的大小和重量使得其能通過離心有效地定位于表面。方便的是，可以在15分鐘內(nèi)以3000×的速度進(jìn)行上述定位，這與第一rca產(chǎn)物相反，第一rca產(chǎn)物不能通過使用臺式離心機(jī)進(jìn)行離心來有效捕獲。

237、本方法能夠產(chǎn)生定位于第一rca產(chǎn)物的增強(qiáng)信號，并且其賦予使用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀或分布在平坦表面上對單個反應(yīng)產(chǎn)物(第二rca產(chǎn)物)進(jìn)行計數(shù)的能力等，以進(jìn)行高精度的數(shù)字檢測。特別地，第二rcp可以用顯色試劑例如hrp染色，并通過智能手機(jī)相機(jī)成像。因此，所述方法可以與數(shù)字pcr具有等效的反應(yīng)，但不需要乳劑、微構(gòu)結(jié)構(gòu)、或每個隔室中正好存在一個模板的條件。

238、由本發(fā)明方法得到的突出的擴(kuò)增產(chǎn)物將進(jìn)一步使克隆單個rcp成為可能，因為從單個第一rca模板獲得的產(chǎn)物是可視的。因此，可以鑒定和分離單獨(dú)的第二rca產(chǎn)物。例如，借助于本發(fā)明的擴(kuò)增方法，可以在低熔瓊脂糖中不需要放大而實(shí)現(xiàn)可視化分離，然后可以分離產(chǎn)物，例如用牙簽觀察，類似于細(xì)菌菌落的分離。

239、罕見突變的檢測在臨床診斷中非常重要。例如，某些基因中的突變(例如kras突變)在診斷上可能是重要的，并且可以用于識別對特定療法(例如抗egfr療法)的獲得性抗性的出現(xiàn)。近年來，許多努力都集中在開發(fā)檢測這類突變的方法上。本方法可以對此類方法提供有益的補(bǔ)充。

240、除了能夠檢測dna樣本中以低頻率存在的點(diǎn)突變之外，本發(fā)明的方法還提供了以單獨(dú)pcr或任何其他當(dāng)前方法不可能實(shí)現(xiàn)的方式篩選dna樣本中任何和所有非常大量不同靶序列的存在的有力手段。然而，與僅基于pcr的方法不同，掛鎖探針和rca的使用使得可以平行應(yīng)用幾十萬個探針而不會降低目標(biāo)選擇性。

241、此外，srca產(chǎn)物的離散性質(zhì)使得可以通過為每個檢測的靶序列產(chǎn)生一種反應(yīng)產(chǎn)物并收集這些顯著的反應(yīng)產(chǎn)物以進(jìn)行數(shù)字檢測，與反應(yīng)中任何其它材料混合的風(fēng)險最小。例如，可以為所有類型的細(xì)菌或所有種類的昆蟲或真菌產(chǎn)生探針混合物。然后，其可用于鑒定陽性反應(yīng)產(chǎn)物，例如，通過pcr擴(kuò)增掛鎖探針上的標(biāo)簽序列，并將產(chǎn)物與標(biāo)簽陣列或類似物雜交。

242、更進(jìn)一步地，如上所述，其中利用間隙填充掛鎖進(jìn)行第二步和任選地進(jìn)一步的連接和rca反應(yīng)，從而靶核酸序列拷貝的制備性生產(chǎn)成為可能。

243、本發(fā)明的srca方法還通過檢測單個rca產(chǎn)物的重復(fù)序列而不是單個靶序列來提高基因分型的精確度。因此，掛鎖探針偶爾的錯誤分型是可以容忍的，只要它們比單個rca產(chǎn)品中的正確結(jié)果少得多，就不會導(dǎo)致錯誤結(jié)果。這使得可以通過多數(shù)表決機(jī)制進(jìn)行基因分型。這也可能對如何進(jìn)行基于掛鎖探針的基因分型產(chǎn)生影響，在這種情況下，只要正確反應(yīng)和錯誤反應(yīng)之間的比率令人滿意，并且掛鎖探針檢測到足夠數(shù)量的重復(fù)，就有可能通過使用沒有100％效率檢測到任何變體的條件來增強(qiáng)序列的區(qū)分能力。

244、所述方法現(xiàn)在將參考下面的附圖和非限制性示例進(jìn)行更詳細(xì)地描述。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路