本發(fā)明主要涉及一種靶向egfr和her2的雙特異性抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥嚴(yán)重危害人類身體健康，尤其是惡性腫瘤患者病情發(fā)展迅速，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且死亡率高。目前在各種疾病所致死亡統(tǒng)計(jì)中高居第二位。近年來隨著環(huán)境污染加劇等因素造成腫瘤的發(fā)病率顯著上升。而臨床采用的常規(guī)療法如放療、化療和手術(shù)治療在一定程度上緩解了病情，提高了生存時(shí)間，但也存在很多的弊端，如副作用大、易復(fù)發(fā)等。治療效果難以進(jìn)一步得到提高。

在各種癌癥中，肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤。其中80％-85％屬于非小細(xì)胞肺癌(nsclc)。肺癌在男性患者中死亡率和發(fā)病率占第一位，而在女性中也占第二位。對(duì)肺癌的發(fā)病機(jī)制和治療手段的研究和開發(fā)一直在進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)egfr是一類在肺癌等癌癥中高表達(dá)的細(xì)胞表面抗原，其屬于her家族(包括egfr/her1、her2、her3和her4)，該家族成員通過配體(如egf)激活后形成同源或異源二聚體后激活下游pi3k-akt信號(hào)通路來介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、生長和分化等，是非小細(xì)胞肺癌依賴的重要受體和通路。通過靶向抑制egfr可以達(dá)到良好的臨床效果。靶向抑制egfr的藥物主要有兩大類：egfr-tki和單克隆抗體。目前egfr-tki小分子藥物(如吉非替尼)可以很好地靶向治療肺癌；德國merck公司研制的人/鼠嵌合單克隆抗體——西妥昔單抗(cetuximab，商品名erbitux)也主要應(yīng)用于egfr高表達(dá)的癌癥治療當(dāng)中。然而肺癌具有高度的突變潛力，往往通過發(fā)生二次突變(如t790m、l858r)等對(duì)egfr-tki和抗體產(chǎn)生耐受。因此，進(jìn)一步了解耐受機(jī)制，挖掘新的作用靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。

大量研究表明egfr和同家族成員her2之間的異源二聚體對(duì)下游信號(hào)通路的作用在her家族中是最強(qiáng)的，而且her2的擴(kuò)增和激活成為肺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐受的重要機(jī)制。20％的非小細(xì)胞肺癌患者中被檢測出her2的過表達(dá)，同時(shí)egfr和her2的共表達(dá)達(dá)到10％-50％。在20％-30％的乳腺癌患者中也存在her2過表達(dá)。1998年美國genentech公司研制的針對(duì)her2受體的人源化單抗——曲妥珠單抗(trastuzumab，商品名herceptin)獲得了美國fda批準(zhǔn)用于her2高表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療。因此，同時(shí)靶向egfr和her2成為重要的治療策略。同時(shí)靶向egfr和her2的拉帕替尼(lapatinib，商品名tykerb)在臨床治療非小細(xì)胞肺癌時(shí)也表現(xiàn)出良好的潛力。但小分子抑制劑藥物容易引起耐受，無法長期發(fā)揮治療效果。而近年來雙特異性抗體的出現(xiàn)帶來了新的希望，雙特異性抗體可以同時(shí)靶向兩種不同的抗原，從而發(fā)揮雙重或協(xié)同效應(yīng)，用量少而且特異性強(qiáng)。具有十分突出的治療優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服非小細(xì)胞肺癌耐藥問題，本發(fā)明的發(fā)明人結(jié)合egfr和her2的關(guān)聯(lián)和工作積累，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種同時(shí)靶向egfr和her2的雙特異性抗體，這種抗體同時(shí)含有人源化西妥昔單抗和赫賽汀單抗的抗原表位結(jié)合區(qū)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種靶向egfr和her2的雙特異性抗體，包含了人源化cetuximab和商業(yè)herceptin的抗原結(jié)合區(qū)的全長igg1型抗體蛋白。具有人源化cetuximab和商業(yè)herceptin的重鏈和輕鏈各一條，所述的重鏈氨基酸序列為seqidno:2和no:6；所述的輕鏈氨基酸序列為seqidno:4和no:8。

本發(fā)明還保護(hù)編碼上述靶向egfr和her2的雙特異性抗體的基因，其特征在于，編碼所述重鏈的核苷酸序列為seqidno:1和no:5；編碼所述輕鏈的核苷酸序列為seqidno:3和no:7。

本發(fā)明還保護(hù)涉及包含本發(fā)明核酸分子的載體和包含所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的載體，具體表達(dá)載體可為pzjc或pcdna3.1。

本發(fā)明涉及一種靶向egfr和her2的雙特異性抗體的制備方法，包括以下步驟：

a)將人源化cetuximab的重鏈恒定區(qū)和赫賽汀抗體的重鏈恒定區(qū)相應(yīng)位置堿基進(jìn)行突變，從而構(gòu)成隆突-入-穴結(jié)構(gòu)，形成異源重鏈結(jié)合，并交換人源化cetuximab的重鏈ch1和輕鏈cl區(qū)域，最終形成靶向her2與egfr的雙特異性抗體的重輕鏈基因；

b)將靶向her2與egfr的雙特異性抗體的重輕鏈基因分別克隆到真核表達(dá)載體pzjc或pcdna3.1載體上，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；

c)在搖瓶培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)并收集上清；

d)純化所述的雙特異性抗體。

所述的宿主細(xì)胞用于載體轉(zhuǎn)染表達(dá)，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具體可為hek293f細(xì)胞。

本發(fā)明還保護(hù)一種組合物，該組合物含有靶向egfr和her2的雙特異性抗體和藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明還保護(hù)一種靶向egfr和her2的雙特異性抗體及其組合物在制備抗非小細(xì)胞肺癌及其獲得性耐受細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。

所述的非小細(xì)胞肺癌及其獲得性耐受細(xì)胞分別為高表達(dá)egfr和過表達(dá)her2的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，具體可為pc-9和pc-9/gr細(xì)胞。

本發(fā)明還保護(hù)一種靶向egfr和her2的雙特異性抗體及其組合物和其他的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：該雙特異性抗體可以同時(shí)靶向egfr和her2，保留了兩個(gè)親本抗體與egfr和her2的親和力，同時(shí)提高了抗體的靶向特異性，減少了抗體用量，而且對(duì)非小細(xì)胞肺癌pc-9/gr(gefitinib-resistance)細(xì)胞的殺傷作用十分顯著，效果優(yōu)于兩個(gè)親本抗體的組合，與其他藥物聯(lián)用的效果也十分顯著。為臨床治療非小細(xì)胞肺癌及其耐受提供了重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例3中的抗體鑒定圖。

圖2為實(shí)施例5流式檢測抗體與非小細(xì)胞肺癌的親和力圖。其中pbs：磷酸鹽緩沖液；herb：人源化cetuximab抗體；her：赫賽汀抗體；hecrossmab：靶向egfr和her2的雙特異性抗體。

圖3為實(shí)施例6中pc-9和pc-9/gr細(xì)胞生長抑制功能檢測圖。圖中a為pc-9細(xì)胞生長抑制功能檢測圖；b為pc-9/gr細(xì)胞生長抑制功能檢測圖。其中nc：陰性對(duì)照；herb：人源化cetuximab抗體；her：赫賽汀抗體；hecrossmab：靶向egfr和her2的雙特異性抗體；egf：表皮生長因子；pc-9：人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞；pc-9/gr：人非小細(xì)胞肺癌pc-9/gr細(xì)胞。

圖4為實(shí)施例6中pc-9和pc-9/gr細(xì)胞中增加吉非替尼進(jìn)行處理所得生長抑制功能檢測圖。圖中a為pc-9細(xì)胞中增加吉非替尼進(jìn)行處理所得生長抑制功能檢測圖；b為pc-9/gr中增加吉非替尼進(jìn)行處理所得生長抑制功能檢測圖。其中egf：表皮生長因子；herb：人源化cetuximab抗體；her：赫賽汀抗體；hecrossmab：靶向egfr和her2的雙特異性抗體；pc-9：人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞；pc-9/gr：人非小細(xì)胞肺癌pc-9/gr細(xì)胞；gef：吉非替尼。

圖5為實(shí)施例7中流式檢測細(xì)胞凋亡圖。

圖6為實(shí)施例8中信號(hào)通路檢測圖，圖中nc：陰性對(duì)照；herb：人源化cetuximab抗體；her：赫賽汀抗體；hecrossmab：靶向egfr和her2的雙特異性抗體；egf：表皮生長因子；p-akt：磷酸化蛋白激酶b；akt:蛋白激酶b；aeg-1：星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1；c-myc和c-fos：為兩種原癌基因；gapdh甘油醛-3-磷酸脫氫酶，作為內(nèi)參蛋白。

序列說明

seqidno:1：herceptin的重鏈核苷酸序列。

seqidno:2：herceptin的重鏈氨基酸序列。

seqidno:3：herceptin的輕鏈核苷酸序列。

seqidno:4：herceptin的輕鏈氨基酸序列。

seqidno:5：人源化cetuximab的重鏈核苷酸序列。

seqidno:6：人源化cetuximab的重鏈氨基酸序列。

seqidno:7：人源化cetuximab的輕鏈核苷酸序列。

seqidno:8：人源化cetuximab的輕鏈氨基酸序列。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明內(nèi)容。其中涉及到的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，特殊的進(jìn)行說明。所用試驗(yàn)材料均采購自常規(guī)生化試劑商店。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果以平均值進(jìn)行表示。

本發(fā)明的發(fā)明人結(jié)合egfr和her2的關(guān)聯(lián)和工作積累，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種同時(shí)靶向egfr和her2的雙特異性抗體，這種抗體同時(shí)含有人源化西妥昔單抗(cn102153647b)和赫賽汀單抗的抗原表位結(jié)合區(qū)，具有人源化cetuximab和商業(yè)herceptin的重鏈和輕鏈各一條，其中重鏈氨基酸序列為seqidno:2和no:6；輕鏈氨基酸序列為seqidno:4和no:8。

實(shí)施例1、重組質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建中的所有實(shí)驗(yàn)操作均參考于《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版，科學(xué)出版社)。將序列表的序列1、3、5、7所示的dna分子分別插入到pzjc載體上，得到4種重組質(zhì)粒。分別以人源化cetuximab抗體和赫賽汀單抗的重輕鏈為模板，引入相應(yīng)的位點(diǎn)突變和片段互換，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。相應(yīng)的引物如下表1所示：

表1合成crossmab結(jié)構(gòu)基因引物序列

實(shí)施例2、制備雙特異性抗體

(1)、培養(yǎng)生長良好的hek293f細(xì)胞至125ml搖瓶中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×10⁵/ml，活力達(dá)到90％以上，培養(yǎng)基為30ml。37℃、125rpm培養(yǎng)。

(2)、轉(zhuǎn)染當(dāng)天測定細(xì)胞數(shù)目及活力，活力應(yīng)大于95％。離心后更換新鮮freestyle293f培養(yǎng)基。取30μg組合質(zhì)粒dna于opti-mem培養(yǎng)基中，總體積為1ml。

(3)、取60μl293f脂質(zhì)體加入opti-mem培養(yǎng)基中，總體積為1ml。

(4)、室溫孵育5min，將dna緩慢加入稀釋好的脂質(zhì)體中，用槍頭輕輕吹吸混勻，并室溫靜置20-30min，孵育結(jié)束后將2ml脂質(zhì)體和質(zhì)粒的混合液加入細(xì)胞懸液中。

(5)、繼續(xù)放入搖床中37℃、125rpm培養(yǎng)。12-14天后收集培養(yǎng)上清。

(6)、將收集到的培養(yǎng)上清進(jìn)行12000rpm離心10min，然后用0.22μm濾膜進(jìn)行過濾。

(7)、用真空泵過濾結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液。

(8)、打開蛋白純化儀(bio-rad，biologicduoflow)進(jìn)行rproteina親和層析，大體過程如下：開啟儀器，潤洗泵，先用5個(gè)柱體積的超純水(約10ml)將柱子中的乙醇洗凈，然后用10個(gè)柱體積的檸檬酸結(jié)合緩沖液(約20ml)平衡柱子。再用5個(gè)柱體積的檸檬酸洗脫緩沖液清洗柱子，洗去殘余蛋白；最后再用10個(gè)柱體積的檸檬酸結(jié)合緩沖液平衡柱子至電導(dǎo)、ph均穩(wěn)定且將od280值歸零。

將過濾后的細(xì)胞收集液進(jìn)行上樣，緩慢流過柱子。上樣后用10個(gè)柱體積的檸檬酸結(jié)合緩沖液再次平衡柱子同時(shí)洗去未結(jié)合的雜蛋白。

洗脫：用5個(gè)柱體積的ph＝3.0的檸檬酸洗脫緩沖液將結(jié)合在柱子上的目的蛋白洗脫下來，在出現(xiàn)蛋白峰時(shí)用收集管進(jìn)行收集，收集管中事先加入200μl的tris-hcl(ph＝9.0)防止ph過低導(dǎo)致收集到的抗體變性。

洗脫結(jié)束后再次用10個(gè)柱體積的檸檬酸結(jié)合緩沖液平衡柱子，最后用超純水清洗柱子，用乙醇封柱，柱子保存在4℃。將收集管中洗脫的液體合并后用超濾管進(jìn)行濃縮并置換buffer為pbs，抗體經(jīng)過bca和elisa方法定量后分裝在小管中保存在-20℃。

實(shí)施例3、sds-page檢測

(1)樣品處理：三倍體積的樣品加入一倍體積的4×loadingbuffer(loadingbuffer分變性還原和變性非還原兩種)，混勻后煮沸10min，12000rpm離心10min，備用。

(2)配膠：先配分離膠，，在分離膠上方加入異丙醇，室溫靜置30min左右至膠凝固后倒掉異丙醇。再配制濃縮膠，加入濃縮膠后迅速插入梳子模具，室溫靜置30min至膠凝固，拔掉梳子模具。

(3)上樣：用小槍頭吸取樣品上樣，marker上樣5μl，最兩側(cè)膠孔用1×loadingbuffer補(bǔ)充。

(4)電泳：蛋白電泳緩沖液沒過膠孔，先用80v電壓將溴酚藍(lán)指示帶電泳至濃縮膠和分離膠分界線處，再將電壓調(diào)至120v至電泳結(jié)束。

(5)電泳結(jié)束后如需進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色則撬開配膠板，取出蛋白膠，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30min，再用考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色過夜。

結(jié)果見圖1，表明抗體組裝完整，純度較高。

實(shí)施例4、elisa檢測親和力

(1)將合成的egfr和her2抗原(委托由北京義翹神州生物技術(shù)有限公司合成，egfr抗原：10004-hcch，her2抗原：10001-h02h-50)分別包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100μl，4℃包被過夜。

(2)清洗：倒掉包被液，在紗布上扣干液體，每孔加入175μl1×pbst，潤洗后甩干液體。再每孔加入350μl1×pbst，靜置3min，倒掉液體并在紗布上扣干液體，再次用同樣的方法用pbst洗兩遍。

(3)封閉：用10％的小牛血清(pbs配制)進(jìn)行封閉，每孔加入200μl，37℃封閉2h。

(4)清洗、加樣：每孔加入175μl1×pbst，潤洗后甩干液體。將陽性對(duì)照曲妥珠單抗與待測樣品(純化的抗her2人源化抗體)一起進(jìn)行一定濃度的稀釋，然后加入酶標(biāo)板的對(duì)應(yīng)孔中，每孔100μl樣品，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1.5h。

(5)清洗加二抗：清洗步驟同(2)中的清洗步驟。清洗后每孔加入100μl二抗，即hrp-羊抗人igg(1:2000稀釋，用10％小牛血清稀釋)，37℃孵育1.5h。

(6)顯色：棄二抗，同(2)中的清洗步驟進(jìn)行清洗。清洗后每孔加入100μltmb底物溶液，37℃孵育14min進(jìn)行顯色。

(7)終止并檢測：顯色后直接每孔加入50μl終止液(2mh2so4)終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取450nm波長處的光吸收值。

(8)根據(jù)吸光值的高低比較待測樣品與抗原結(jié)合的親和力的大小。

最終，測定雙特異性抗體hecrossmab與egfr和her2的親和力(kd)如下表2所示。從結(jié)果中可以看出來hecrossmab保留了親本抗體與egfr和her2的親和力。

表2親和力常數(shù)(nm)

實(shí)施例5、流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的親和力

(1)取對(duì)數(shù)期生長的pc-9或pc-9/gr細(xì)胞(細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)egfr和her2)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁵-1.0×10⁶/ml，加入ep管中，每管1ml細(xì)胞懸液，每管對(duì)應(yīng)一個(gè)樣品。

(2)2000rpm、4℃離心5min，棄上清。

(3)加入1ml含1％fbs的pbs洗滌細(xì)胞一次，2000rpm、4℃離心5min，棄上清。

(4)加入稀釋好的相應(yīng)濃度的抗體樣品(hecrossmab)以及陽性對(duì)照樣品(herbitux、herceptin以及herbitux+herceptin)于ep管中，200μl每管，另外可設(shè)置加入200μlpbs的樣品為陰性對(duì)照組，冰浴60min。待測抗體可加入不同梯度的濃度，例如：1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。

(5)抗體孵育結(jié)束后離心棄上清，用500μl含1％fbs的pbs洗滌一次。

(6)每管樣品中加入fitc標(biāo)記的羊抗人igg100μl(用含1％fbs的pbs進(jìn)行1：64稀釋)，避光冰浴45min(此時(shí)可打開流式細(xì)胞儀提前預(yù)熱機(jī)器)。

(7)二抗孵育結(jié)束后再次離心棄上清，用500μl含1％fbs的pbs洗滌一次。

(8)細(xì)胞沉淀重懸于350μl含1％fbs的pbs中并轉(zhuǎn)移至流式管中進(jìn)行流式上機(jī)檢測。根據(jù)檢測到的fitc熒光值的大小來判斷抗體親和力的強(qiáng)弱。

結(jié)果見圖2。從結(jié)果中可以看出同兩個(gè)親本抗體的組合相比，hecrossmab與兩個(gè)親本抗體同pc-9和pc-9/gr細(xì)胞之間的親和力相當(dāng)。

實(shí)施例6、mtt檢測細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

(1)鋪板：分別收集對(duì)數(shù)期pc-9和pc-9/gr細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×10⁴/ml，鋪板在96孔板上，每孔加入200μl細(xì)胞懸液即每孔5000個(gè)細(xì)胞，無菌pbs填充邊緣，鋪2塊96孔板，用于72h后的檢測。37℃、5％co2培養(yǎng)24h。

(2)加藥：待鋪板細(xì)胞貼壁后，用培養(yǎng)基稀釋不同濃度的抗體，吸去96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入200μl含相應(yīng)濃度抗體的培養(yǎng)基，每個(gè)樣品濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。2小時(shí)后相應(yīng)孔中加入表皮生長因子(egf，10nmol/l)，同時(shí)設(shè)置不加藥的空白對(duì)照組。2塊96孔板同時(shí)加藥，72h后檢測。加藥后繼續(xù)37℃、5％co2培養(yǎng)。

(3)檢測：加相應(yīng)抗體處理72h后分別進(jìn)行檢測。處理時(shí)間結(jié)束后，保留培養(yǎng)基，直接每孔加入20μlmtt(mtt溶液濃度為5mg/ml)，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)。4h后吸去各孔中的液體，每孔加入150μldmso，搖床上快速振蕩15min充分溶解結(jié)晶，然后立即在酶標(biāo)儀上檢測490nm波長處的吸光值。

(4)細(xì)胞存活率＝(加藥孔o(hù)d490/空白對(duì)照孔o(hù)d490)×100％；抑制率＝100％–存活率。

最終結(jié)果見圖3和圖4。可以明顯看出：hecrossmab能夠很好地殺傷pc-9和pc-9/gr細(xì)胞，而且在egf刺激下的pc-9/gr細(xì)胞中作用更加顯著。同時(shí)還能夠增強(qiáng)pc-9/gr對(duì)吉非替尼(gefitinib)的敏感性，其中g(shù)ef(10nm)和gef(500nm)分別表示吉非替尼在pc-9和pc-9/gr細(xì)胞中的終濃度。

實(shí)施例7、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

(1)第一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板(pc-9/gr細(xì)胞)，調(diào)整細(xì)胞至5×10⁵/ml的密度，6孔板每孔加入1.5ml細(xì)胞懸液。鋪板后繼續(xù)37℃、5％co2培養(yǎng)24h。

(2)待細(xì)胞貼壁后，用培養(yǎng)基配制10μg/ml濃度的不同抗體，將6孔板中培養(yǎng)基吸出換成含抗體的培養(yǎng)基進(jìn)行加藥處理，同時(shí)設(shè)置不加抗體的陰性對(duì)照組。

(3)加藥處理72h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷pbs清洗細(xì)胞2次。加入300μl的1×bindingbuffer重懸細(xì)胞，加入5μlfitc-annexinv避光染色15min，上機(jī)檢測前再加入5μlpi避光染色5min，補(bǔ)加200μl1×bindingbuffer后進(jìn)行流式上機(jī)檢測。染色處理時(shí)fitc-annexinv單染和pi單染的對(duì)照各設(shè)置一組。

(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡比例并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

結(jié)果見圖5?？梢钥闯觯簾o論是否存在egf刺激下，hecrossmab能夠介導(dǎo)更多的細(xì)胞凋亡，而且效果顯著強(qiáng)于兩個(gè)親本抗體的組合。

實(shí)施例8、egfr下游信號(hào)通路檢測

(1)同實(shí)施例7中處理一樣，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白收集，將待檢測蛋白樣品進(jìn)行sds-page。

(2)在sds-page蛋白電泳結(jié)束前30min將兩張轉(zhuǎn)膜濾紙用轉(zhuǎn)膜緩沖液進(jìn)行浸泡，pvdf膜用甲醇浸泡30s后放入轉(zhuǎn)膜濾紙上。

(3)轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后撬開配膠板取出蛋白膠，將蛋白膠置于pvdf膜上，將蛋白膠、pvdf膜、一張濾紙三者一起轉(zhuǎn)移至半干轉(zhuǎn)膜儀的電極板上，最后在蛋白膠的上面再覆蓋一張濾紙，用玻璃棒均勻地趕出氣泡，吸走多余的轉(zhuǎn)膜緩沖液。蓋上轉(zhuǎn)膜儀蓋子，18v轉(zhuǎn)膜1h。

(4)封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將pvdf膜轉(zhuǎn)移至5％的脫脂奶粉封閉液(用1×tbst配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)中，室溫封閉1h。

(5)孵育一抗：封閉結(jié)束后將pvdf膜用保鮮膜包裹后進(jìn)行裁膜，根據(jù)預(yù)染marker的條帶大小將目的條帶和內(nèi)參條帶處裁開分成兩部分。孵育相應(yīng)抗體，4℃過夜。

(6)次日用1×tbst清洗pvdf膜3次，每次在搖床上清洗10min。

(7)清洗后孵育二抗，目的條帶孵育hrp-山羊抗鼠抗體(1:1500稀釋)，內(nèi)參條帶孵育hrp-山羊抗兔抗體(1:5000稀釋)，室溫孵育1h。

(8)二抗孵育結(jié)束后按照(6)中的步驟清洗pvdf膜。

(9)在暗室中進(jìn)行顯影，將pvdf膜放在暗盒中的保鮮膜上，均勻涂抹ecl化學(xué)發(fā)光劑，然后用x膠片進(jìn)行壓片，經(jīng)過顯影、定影后獲得western結(jié)果。

結(jié)果見圖6?？梢钥闯觯篽ecrossmab能夠顯著抑制akt的磷酸化水平，以及下游效應(yīng)分子c-fos、c-jun和aeg-1的表達(dá)水平。

綜上所述，hecrossmab具有良好的抗pc-9及pc-9/gr細(xì)胞(同時(shí)表達(dá)egfr和her2)的生長作用，有望成為一種用于臨床治療非小細(xì)胞肺癌以及gefitinib獲得性耐受的抗體藥物。

<110>安徽大學(xué)

<120>一種靶向egfr和her2的雙特異性抗體

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1410

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<212>prt

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thrtyrargvalvalservalleuservalleuhisglnasptrpleu

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proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

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valserleutrpcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

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valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

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proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu

420425430

thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser

435440445

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

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leuserproglylys***

465

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合成crossmab結(jié)構(gòu)基因引物序列

引物名稱序列（5’-3’）

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