本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種調(diào)整Ⅱ型膠原等電點(diǎn)的方法。

技術(shù)背景

膠原是一種由動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的天然生物高分子，由3條鏈以右手螺旋形式纏繞成超螺旋結(jié)構(gòu)，每條肽鏈約1000個(gè)氨基酸殘基。膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要蛋白成分幾乎存在于所有組織，約占哺乳動(dòng)物體內(nèi)總蛋白的33％。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，膠原與蛋白和多糖等生物大分子相互作用構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，起到細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的支架作用，對(duì)細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、新陳代謝、生長和分化等均有重要的影響。膠原根據(jù)其每條鏈的氨基酸組成差異分為多種類型，目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)27種不同類型的膠原。膠原具有良好的生物相容性、弱抗原性、生物可降解和生物可吸收性等特點(diǎn)，膠原作為一種理想的生物材料，可用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)、以及醫(yī)療器械、藥物控釋和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域，如可用于制造人工器官、止血材料、組織修復(fù)與再生材料、組織填充材料、支架材料、神經(jīng)缺損修復(fù)材料等。不同類型膠原的功能、機(jī)械強(qiáng)度及其熱穩(wěn)定性存在一定差異，與其它生物分子、細(xì)胞或材料界面之間的相互作用也存在一定差異。因此，制備不同類型的生物材料，使用膠原的類型存在一定差異。在特殊情況下，即便使用相同類型的膠原，其化學(xué)性質(zhì)調(diào)整也十分必要，尤其是在骨缺損修復(fù)方面。

Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，而且能夠維持軟骨細(xì)胞的表型及促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化，為軟骨細(xì)胞的黏附提供基礎(chǔ)并促進(jìn)細(xì)胞快速增殖等。蔣萍等人的研究表明Ⅱ型膠原包被培養(yǎng)板中軟骨細(xì)胞增速為Ⅰ型膠原包被培養(yǎng)板增速的2倍，是普通培養(yǎng)板的5倍。Ⅱ型膠原包被培養(yǎng)板中軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原、糖胺多糖最多，與其它兩種培養(yǎng)板檢測(cè)結(jié)果差異有顯著性意義，表明膠原包被培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)軟骨細(xì)胞優(yōu)于普通培養(yǎng)板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞時(shí)能更好地維持細(xì)胞形態(tài)，延長去分化現(xiàn)象出現(xiàn)的時(shí)間，更有利于細(xì)胞再分化(《川北醫(yī)學(xué)院》，2012(30):4845-4850)。

骨缺損是因創(chuàng)傷、骨腫瘤、感染、先天性骨病等所致的臨床常見病癥，目前常用治療方法包括自體或異體骨移植、人工骨移植以及各種骨誘導(dǎo)劑與人工骨的結(jié)合應(yīng)用，自體或異體骨移植存在給患者帶來新的創(chuàng)傷等缺陷且數(shù)量有限，并存在疾病傳染和免疫排斥等問題，國際上關(guān)于骨替代材料研究主要集中在有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料方面，其中無機(jī)材料常用的是陶瓷、納米羥基磷灰石以及人工煅燒骨等材料，而有機(jī)材料主要是膠原，更為常用的是Ⅱ型膠原，主要是利用Ⅱ型膠原具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖這一特殊性質(zhì)，因此在骨缺損修復(fù)等方面的應(yīng)用前景廣闊。但是，由于Ⅱ型膠原的等電點(diǎn)接近中性，制備有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料過程中溶液環(huán)境常處于中性環(huán)境，導(dǎo)致Ⅱ型膠原易形成等電點(diǎn)聚集，提高分散難度，并使制備的復(fù)合材料結(jié)構(gòu)難以控制。因此，有必要通過合適的方法調(diào)整Ⅱ型膠原的等電點(diǎn)，提高其在制備有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料過程中的分散性，并使材料的孔隙率、孔徑以及密度等指標(biāo)可控可調(diào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)Ⅱ型膠原用于制備骨修復(fù)生物材料過程中存在的問題，本發(fā)明目的在于提供一種調(diào)整Ⅱ型膠原等電點(diǎn)的方法，使其在一定范圍內(nèi)等電點(diǎn)可控可調(diào)。本發(fā)明的一種調(diào)整Ⅱ型膠原等電點(diǎn)的方法，該方法包括以下步驟：

(1)膠原預(yù)處理：稱取一定量的具有三螺旋結(jié)構(gòu)且去除端肽的Ⅱ型膠原，加入100-1000倍重量的0.05-0.5mol/L有機(jī)酸溶液，攪拌法使其全部溶解，然后采用超濾法進(jìn)行溶液置換，在超濾過程中加入pH7.5-11的堿性溶液，連續(xù)超濾直至透過液pH與加入的堿性溶液pH差值低于0.2；

(2)反應(yīng)過程：將步驟(1)制備的Ⅱ型膠原堿性溶液導(dǎo)入恒溫反應(yīng)釜，控制反應(yīng)釜內(nèi)溶液溫度在10-40℃，向反應(yīng)釜中連續(xù)加入酸酐水溶液，控制酸酐的總加入量為II型膠原重量的0.01-1倍，在反應(yīng)過程中采用pH為12-14的堿性溶液控制反應(yīng)溶液的pH維持在pH7.5-11；

(3)等電點(diǎn)沉淀：向步驟(2)制備出的溶液中加入稀酸溶液，直至溶液中出現(xiàn)沉淀物，記錄出現(xiàn)沉淀時(shí)溶液的pH值，采用離心處理收集沉淀物；

(4)冷凍干燥：將步驟(3)制備的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，干燥后獲得的膠原即為調(diào)整等電點(diǎn)后的II型膠原。

優(yōu)選地，所述的Ⅱ型膠原在溶解后以單分子狀態(tài)存在于溶液中。

優(yōu)選地，所述制備步驟(1)中使用的超濾膜，其截留分子量范圍為1k-30kDa。

優(yōu)選地，所述制備步驟(2)中使用的酸酐可以是環(huán)丁烷四甲酸二酐、甲基順式丁烯二酐、己二酸酐、和戊二酸酐中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述制備步驟(4)中獲得的Ⅱ膠原，其等電點(diǎn)為步驟(3)出現(xiàn)沉淀時(shí)溶液的pH值。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：使用的Ⅱ型膠原具有三螺旋結(jié)構(gòu)，不含有端肽且分子溶解后在溶液中呈單分子狀態(tài)，可以提高反應(yīng)速率。制備過程中使用了超濾技術(shù)，工藝易于放大。制備出的Ⅱ型膠原其等電點(diǎn)在3-6.8范圍內(nèi)可調(diào)，通過加入酸酐量或反應(yīng)時(shí)間控制Ⅱ型膠原的等電點(diǎn)。

具體實(shí)施例

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，值得提出的是，本實(shí)施例只是用于對(duì)本發(fā)明的一種調(diào)整II型膠原等電點(diǎn)的方法的舉例說明，并不能代表本發(fā)明專利的全部，更不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的構(gòu)思的前提條件下，還可以做出若干調(diào)整或改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

(1)膠原預(yù)處理：稱取100g具有三螺旋結(jié)構(gòu)且去除端肽的牛II型膠原，置于50L攪拌反應(yīng)釜內(nèi)，加入10kg濃度為0.1mol/L的醋酸溶液，攪拌24小時(shí)使其全部溶解。采用截留分子量為1kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，超濾過程中向攪拌反應(yīng)釜內(nèi)加入pH7.5的NaOH溶液，連續(xù)超濾直至透過液pH達(dá)到7.5。

(2)反應(yīng)過程：將步驟(1)制備的II型膠原堿性溶液導(dǎo)入恒溫反應(yīng)釜，控制反應(yīng)釜內(nèi)溶液溫度在10℃，向反應(yīng)釜中連續(xù)加入酸酐水溶液，酸酐的總加入量為10g，在反應(yīng)過程中采用pH為12的氫氧化鈉溶液控制反應(yīng)溶液的pH維持在pH7.5，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。

(3)等電點(diǎn)沉淀：向步驟(2)制備出的溶液中緩慢加入0.05mol/L的醋酸溶液并進(jìn)行攪拌，在溶液的pH為4.3時(shí)，溶液中了出現(xiàn)沉淀物，停止加入醋酸溶液，靜置90min后，采用離心處理收集沉淀物。

(4)冷凍干燥：將步驟(3)制備的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥。

干燥后獲得的膠原即為等電點(diǎn)為4.3的II型膠原。

實(shí)施例2

(1)膠原預(yù)處理：稱取100g具有三螺旋結(jié)構(gòu)且去除端肽的牛Ⅱ型膠原，置于50L攪拌反應(yīng)釜內(nèi)，加入50kg濃度為0.3mol/L的醋酸溶液，攪拌24小時(shí)使其全部溶解。采用截留分子量為20kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，超濾過程中向攪拌反應(yīng)釜內(nèi)加入pH7.8的KOH溶液，連續(xù)超濾直至透過液pH達(dá)到7.8。

(2)反應(yīng)過程：將步驟(1)制備的Ⅱ型膠原堿性溶液導(dǎo)入恒溫反應(yīng)釜，控制反應(yīng)釜內(nèi)溶液溫度在25℃，向反應(yīng)釜中連續(xù)加入酸酐水溶液，酸酐的總加入量為6g，在反應(yīng)過程中采用pH為13的氫氧化鉀溶液控制反應(yīng)溶液的pH維持在pH9.5，反應(yīng)進(jìn)行3小時(shí)。

(3)等電點(diǎn)沉淀：向步驟(2)制備出的溶液中緩慢加入0.1mol/L的鹽酸溶液并進(jìn)行連續(xù)攪拌，在溶液的pH為3.8時(shí)溶液中了出現(xiàn)沉淀物，停止加入鹽酸溶液，采用離心處理收集沉淀物。

(4)冷凍干燥：將步驟(3)制備的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥。

干燥后獲得的膠原即為等電點(diǎn)為3.8的Ⅱ型膠原。

實(shí)施例3

(1)膠原預(yù)處理：稱取80g具有三螺旋結(jié)構(gòu)且去除端肽的牛II型膠原，置于50L攪拌反應(yīng)釜內(nèi)，加入80kg濃度為0.5mol/L的醋酸溶液，攪拌24小時(shí)使其全部溶解。采用截留分子量為30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，超濾過程中向攪拌反應(yīng)釜內(nèi)加入pH11.0的NaOH溶液，連續(xù)超濾直至透過液pH達(dá)到11.0。

(2)反應(yīng)過程：將步驟(1)制備的II型膠原堿性溶液導(dǎo)入恒溫反應(yīng)釜，控制反應(yīng)釜內(nèi)溶液溫度在40℃，向反應(yīng)釜中連續(xù)加入酸酐水溶液，酸酐的總加入量為80g，在反應(yīng)過程中采用pH為14.0的氫氧化鈉溶液控制反應(yīng)溶液的pH維持在11.0，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。

(3)等電點(diǎn)沉淀：向步驟(2)制備出的溶液中緩慢加入0.2mol/L的醋酸溶液并進(jìn)行攪拌，在溶液的pH為4.5時(shí)，溶液中了出現(xiàn)沉淀物，停止加入醋酸溶液，靜置90min后，采用離心處理收集沉淀物。

(4)冷凍干燥：將步驟(3)制備的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥。

干燥后獲得的膠原即為等電點(diǎn)為4.5的II型膠原。

實(shí)施例4

(1)膠原預(yù)處理：稱取100g具有三螺旋結(jié)構(gòu)且去除端肽的牛II型膠原，置于50L攪拌反應(yīng)釜內(nèi)，加入20kg濃度為0.1mol/L的醋酸溶液，攪拌24小時(shí)使其全部溶解。采用截留分子量為28kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，超濾過程中向攪拌反應(yīng)釜內(nèi)加入pH7.5的NaOH溶液，連續(xù)超濾直至透過液pH達(dá)到7.5。

(2)反應(yīng)過程：將步驟(1)制備的II型膠原堿性溶液導(dǎo)入恒溫反應(yīng)釜，控制反應(yīng)釜內(nèi)溶液溫度在25℃，向反應(yīng)釜中連續(xù)加入酸酐水溶液，酸酐的總加入量為20g，在反應(yīng)過程中采用pH為12.0的氫氧化鈉溶液控制反應(yīng)溶液的pH維持在pH8.5，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。

(3)等電點(diǎn)沉淀：向步驟(2)制備出的溶液中緩慢加入0.1mol/L的醋酸溶液并進(jìn)行攪拌，在溶液的pH為4.0時(shí)，溶液中了出現(xiàn)沉淀物，停止加入醋酸溶液，靜置90min后，采用離心處理收集沉淀物。

(4)冷凍干燥：將步驟(3)制備的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥。

干燥后獲得的膠原即為等電點(diǎn)為4.0的II型膠原。