專利名稱：一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法。
背景技術(shù)：
慢性乙型肝炎是全球面臨的一個(gè)嚴(yán)峻的健康問(wèn)題，中國(guó)、東南亞及非洲是HBV感染的高發(fā)區(qū)，同時(shí)這些地區(qū)HBV相關(guān)性肝病如原發(fā)性肝癌的發(fā)生率也明顯高于美洲中部和南部等HBV感染的低發(fā)區(qū)。慢性乙型肝炎治療主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化以及對(duì)癥治療，其中進(jìn)行有效抗病毒治療，持久抑制HBV DNA于PCR常規(guī)可檢測(cè)范圍以下是治療的關(guān)鍵。硫酸多糖無(wú)論在體內(nèi)還是在體外，都顯示了不同程度的抗病毒、抗腫瘤和對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。研究表明，硫酸多糖和其他聚陰離子物質(zhì)可干擾反轉(zhuǎn)錄病毒及其 他病毒的吸附和侵入，有些表現(xiàn)出對(duì)各種反轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制活性。硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚陰離子特性，聚陰離子特性則主要源于其分子中的硫酸基。海洋是一個(gè)巨大的天然產(chǎn)物寶庫(kù)，豐富的海洋生物和海洋活性物質(zhì)為我們提供一個(gè)巨大的海洋藥物資源庫(kù)。特殊的海洋生態(tài)環(huán)境與生物鏈之間的密切相關(guān)性使得海洋生物次生代謝產(chǎn)物具有與陸生生物所不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特異高效的生物活性，因此對(duì)海洋生物多糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重大意義。從海洋活性多糖中尋找治療慢性乙型肝炎的有效藥物，已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的密切關(guān)注?，F(xiàn)在的梅花參糖胺聚糖的提取方法主要包括堿裂解法、酶消化法以及乙醇沉淀法。但上述制備方法不能獲得純度高的梅花參糖胺聚糖，其主要原因是糖胺聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)有著顯著的重疊性，如分子量差異法、硫酸化程度不一致、構(gòu)想復(fù)雜、顯微結(jié)構(gòu)不均勻以及殘基數(shù)量變化等，尤其在一個(gè)特定蛋白質(zhì)聚糖分子上，其含有的糖胺聚糖鏈的種類(lèi)、數(shù)量存在差異，使得現(xiàn)有的梅花參糖胺聚糖的制備方法很難獲得純度高的梅花參糖胺聚糖。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法，將梅花參糖胺聚糖用纖維素離子交換柱層析法純化，得到純度較高的梅花參糖胺聚糖。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一梅花參預(yù)處理；步驟二 堿解梅花參體壁；步驟三雙酶酶解梅花參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟六干燥梅花參糖胺聚糖粗糖；步驟七雙氧水脫色；步驟八用纖維素離子交換柱層析法純化梅花參糖胺聚糖；步驟九用乙酸鉀沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟十干燥梅花參糖胺聚糖精糖。優(yōu)化的，所述步驟八的具體步驟為將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。優(yōu)化的，所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH為6. O 6. 5。本發(fā)明中所述DEAE-52纖維素為二乙氨基乙基纖維素，本發(fā)明對(duì)采用的試劑、材料和儀器沒(méi)有特殊要求，其均為市售產(chǎn)品，可通過(guò)多種商業(yè)渠道購(gòu)得。本發(fā)明的有益效果在于建立了一種有效地制備高純度的梅花參糖胺聚糖的方法，在堿法提取的同時(shí)，結(jié)合胰蛋白酶和胃蛋白酶的雙酶消化處理，即首先采用堿處理梅花參組織，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增強(qiáng)梅花參體壁組織匯總糖胺聚糖的釋放。為提高糖胺聚糖的純度，本發(fā)明采用纖維素離子交換柱層析法純化梅花參糖胺聚糖粗糖。本發(fā)明的方法能夠平衡梅花參糖胺聚糖的得率與純度的關(guān)系，提高了梅花參糖胺聚糖的純度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1
本實(shí)施例的從梅花參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一梅花參預(yù)處理；步驟二 堿解梅花參體壁；步驟三雙酶酶解梅花參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟六干燥梅花參糖胺聚糖粗糖；步驟七雙氧水脫色；步驟八用纖維素離子交換柱層析法純化梅花參糖胺聚糖；步驟九用乙酸鉀沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟十干燥梅花參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為
步驟一梅花參預(yù)處理；迅速用蒸餾水沖洗梅花參，去除梅花參體表粘附的異物，用長(zhǎng)形小刀自腹部?jī)H肛門(mén)向前解剖鮮參，立即剔除內(nèi)臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱量后將梅花參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎梅花參體壁；
步驟二 堿解梅花參體壁往梅花參體壁中加2倍重量的雙蒸水，然后加入2mol/L的NaOH,邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為O. 5mol/L, 4°C過(guò)夜消化；
步驟三梅花參體壁的雙酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸調(diào)解PH值至8. 2，加入梅花參體壁質(zhì)量O. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢瑁⒌渭? mmol/L的NaOH溶液，維持pH在8. 2 ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下，保持30min后終止反應(yīng)；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調(diào)解pH值至2之間，再添加梅花參體壁質(zhì)量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續(xù)酶解4h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢?；酶解終止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)溶液呈微混濁時(shí)，將酶解液迅速冷卻至300C以下，保持30min終止酶解反應(yīng)；然后以5000r/min離心15min收集上清夜；
步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min收集上清夜；
步驟五乙醇沉淀梅花參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調(diào)解上清液的pH值至
6.8，7000r/min離心lOmin，收集上清加入無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C過(guò)夜沉淀；
步驟六干燥梅花參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗滌3次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到粗制梅花參糖胺聚糖；
步驟七梅花參糖胺聚糖脫色將沉淀物再次充分溶解于雙蒸水中，用2mol/L NaOH調(diào)解PH至9. O, 50°C保溫，逐步加入30%的雙氧水進(jìn)行多糖的脫色處理，溶液接近白色時(shí)終止脫色；將溶液冷卻至室溫，然后于4°C靜置2h ；3600r/min離心15min去沉淀，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中冷卻至0°C，回調(diào)上清液pH為2. 0，再次3600r/min離心15min，去除少量沉淀，上層清液經(jīng)80%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥；
步驟八將50g DEAE-52纖維素用緩沖液浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg沉淀物用IOmL緩沖液在40°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖 胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。所述緩沖液采用O. 5mol/L 的 NaAC，其 pH 為 6. O。步驟九用乙酸鉀沉淀梅花參糖胺聚糖；將梅花參糖胺聚糖按1:90的質(zhì)量比充分溶解于雙蒸水，以3600r/min離心15min去沉淀；轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，加入乙酸鉀至其終濃度為2mol/L，充分混勻，4°C過(guò)夜沉淀，然后7000r/min離心lOmin，收集沉淀；
步驟十干燥梅花參糖胺聚糖精糖
將沉淀物分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到的白色干燥無(wú)定型粉末即為精制多糖。實(shí)施例2
本實(shí)施例的從梅花參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一梅花參預(yù)處理；步驟二 堿解梅花參體壁；步驟三雙酶酶解梅花參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟六干燥梅花參糖胺聚糖粗糖；步驟七雙氧水脫色；步驟八用纖維素離子交換柱層析法純化梅花參糖胺聚糖；步驟九用乙酸鉀沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟十干燥梅花參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為
步驟一梅花參預(yù)處理；迅速用蒸餾水沖洗梅花參，去除梅花參體表粘附的異物，用長(zhǎng)形小刀自腹部?jī)H肛門(mén)向前解剖鮮參，立即剔除內(nèi)臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱量后將梅花參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎梅花參體壁；
步驟二 堿解梅花參體壁往梅花參體壁中加2倍重量的雙蒸水，然后加入2mol/L的NaOH,邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為O. 5mol/L, 4°C過(guò)夜消化；
步驟三梅花參體壁的雙酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸調(diào)解PH值至9. O,加入梅花參體壁質(zhì)量O. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢瑁⒌渭? mmol/L的NaOH溶液，維持pH在9. O ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下，保持30min后終止反應(yīng)；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調(diào)解pH值至2. 5之間，再添加梅花參體壁質(zhì)量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續(xù)酶解4h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢?；酶解終止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)溶液呈微混濁時(shí)，將酶解液迅速冷卻至300C以下，保持30min終止酶解反應(yīng)；然后以5000r/min離心15min收集上清夜；
步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min 收集上清夜；
步驟五乙醇沉淀梅花參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調(diào)解上清液的pH值至
7.2，7000r/min離心lOmin，收集上清加入無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C過(guò)夜沉淀；
步驟六干燥梅花參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗滌3次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到粗制梅花參糖胺聚糖；
步驟七梅花參糖胺聚糖脫色將沉淀物再次充分溶解于雙蒸水中，用2mol/L NaOH調(diào)解PH至9. O, 50°C保溫，逐步加入30%的雙氧水進(jìn)行多糖的脫色處理，溶液接近白色時(shí)終止脫色；將溶液冷卻至室溫，然后于4°C靜置2h ；3600r/min離心15min去沉淀，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中冷卻至0°C，回調(diào)上清液pH為2. 0，再次3600r/min離心15min，去除少量沉淀，上層清液經(jīng)80%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥；
步驟八將50g DEAE-52纖維素用緩沖液浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg沉淀物用IOmL緩沖液在60°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。所述緩沖液采用O. 5mol/L 的 NaAC，其 pH 為 6. 5。步驟九用乙酸鉀沉淀梅花參糖胺聚糖；將梅花參糖胺聚糖按1:90的質(zhì)量比充分溶解于雙蒸水，以3600r/min離心15min去沉淀；轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，加入乙酸鉀至其終濃度為2mol/L，充分混勻，4°C過(guò)夜沉淀，然后7000r/min離心lOmin，收集沉淀；
步驟十干燥梅花參糖胺聚糖精糖
將沉淀物分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到的白色干燥無(wú)定型粉末即為精制多糖。本發(fā)明實(shí)施例中所實(shí)施的從梅花參中提取糖胺聚糖的方法，均能夠平衡梅花參糖胺聚糖得率與純度的關(guān)系，提高梅花參糖胺聚糖的純度。
權(quán)利要求
1.一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法，其特征在于包括下列步驟步驟一 梅花參預(yù)處理；步驟二 堿解梅花參體壁；步驟三雙酶酶解梅花參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟六干燥梅花參糖胺聚糖粗糖；步驟七雙氧水脫色；步驟八用纖維素離子交換柱層析法純化梅花參糖胺聚糖；步驟九用乙酸鉀沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟十干燥梅花參糖胺聚糖精糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法，其特征在于 所述步驟八的具體步驟為將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱， 用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集； 用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法，其特征在于 所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH為6. O 6. 5。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及一種從梅花參中提取并純化糖胺聚糖的方法。其包括下列步驟步驟一梅花參預(yù)處理；步驟二堿解梅花參體壁；步驟三雙酶酶解梅花參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟六干燥梅花參糖胺聚糖粗糖；步驟七雙氧水脫色；步驟八用纖維素離子交換柱層析法純化梅花參糖胺聚糖；步驟九用乙酸鉀沉淀梅花參糖胺聚糖；步驟十干燥梅花參糖胺聚糖精糖。本發(fā)明能夠平衡梅花參糖胺聚糖得率與純度的關(guān)系，提高梅花參糖胺聚糖的純度。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102993326SQ20121058541
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者宣世英, 李雪潔, 林中華, 姜曼, 姜相君, 辛永寧 申請(qǐng)人:青島市市立醫(yī)院