專利名稱：一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法
一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法。
背景技術(shù)：
慢性乙型肝炎是全球面臨的一個(gè)嚴(yán)峻的健康問題，中國、東南亞及非洲是HBV感染的高發(fā)區(qū)，同時(shí)這些地區(qū)HBV相關(guān)性肝病如原發(fā)性肝癌的發(fā)生率也明顯高于美洲中部和南部等HBV感染的低發(fā)區(qū)。慢性乙型肝炎治療主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化以及對癥治療，其中進(jìn)行有效抗病毒治療，持久抑制HBV DNA于PCR常規(guī)可檢測范圍以下是治療的關(guān)鍵。硫酸多糖無論在體內(nèi)還是在體外，都顯示了不同程度的抗病毒、抗腫瘤和對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。研究表明，硫酸多糖和其他聚陰離子物質(zhì)可干擾反轉(zhuǎn)錄病毒及其他病毒的吸附和侵入，有些表現(xiàn)出對各種反轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制活性。硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚陰離子特性，聚陰離子特性則主要源于其分子中的硫酸基。
海洋是一個(gè)巨大的天然產(chǎn)物寶庫，豐富的海洋生物和海洋活性物質(zhì)為我們提供一個(gè)巨大的海洋藥物資源庫。特殊的海洋生態(tài)環(huán)境與生物鏈之間的密切相關(guān)性使得海洋生物次生代謝產(chǎn)物具有與陸生生物所不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特異高效的生物活性，因此對海洋·生物多糖的開發(fā)應(yīng)用具有重大意義。從海洋活性多糖中尋找治療慢性乙型肝炎的有效藥物，已引起國內(nèi)外醫(yī)藥界的密切關(guān)注。
刺參糖胺聚糖(StichopusJapomicus selenka GlycosaminoGlycans, SJ-GAG), 舊稱刺參酸性粘多糖或刺參粘多糖，是從刺參體壁中提取的一種硫酸多糖，系由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-巖藻糖和硫酸基組成，相對分子質(zhì)量在4至5萬道爾頓左右，。刺參糖胺聚糖在溶液中以離子形式存在，具有與帶正電的離子或成分相互作用的能力，屬于聚陰離子。刺參唐胺聚糖聚陰離子性質(zhì)以及在溶液終的不同構(gòu)想構(gòu)成了其多種生物學(xué)作用的基礎(chǔ)?，F(xiàn)在的刺參糖胺聚糖的提取方法主要包括堿裂解法、酶消化法以及乙醇沉淀法。但上述制備方法不能獲得純度高的刺參糖胺聚糖，其主要原因是唐胺聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)有著顯著的重疊性，如分子量差異法、硫酸化程度不一致、構(gòu)想復(fù)雜、顯微結(jié)構(gòu)不均勻以及殘基數(shù)量變化等，尤其在一個(gè)特定蛋白質(zhì)聚糖分子上，其含有的唐胺聚糖鏈的種類、數(shù)量存在差異，使得現(xiàn)有的刺參糖胺聚糖的制備方法很難獲得純度高的刺參糖胺聚糖。發(fā)明內(nèi)容
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法，將刺參糖胺聚糖依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化，得到純度較高的刺參糖胺聚糖。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法，包括下列步驟 步驟一鮮刺參預(yù)處理；步驟二 堿解刺參體壁；步驟三雙酶酶解刺參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀刺參糖胺聚糖；步驟六干燥刺參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化刺參糖胺聚糖；步驟八干燥刺參糖胺聚糖精糖。
優(yōu)化的，所述步驟七中凝膠柱純化的具體步驟為將40g葡聚糖凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用 IOmL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。
優(yōu)化的，所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH為6. O 6. 5。
本發(fā)明中所述sephadex g_100為葡聚糖凝膠,本發(fā)明對采用的試劑、材料和儀器沒有特殊要求，其均為市售產(chǎn)品，可通過多種商業(yè)渠道購得。
本發(fā)明的有益效果在于建立了一種有效地制備高純度的刺參糖胺聚糖的方法， 在堿法提取的同時(shí)，結(jié)合胰蛋白酶和胃蛋白酶的雙酶消化處理，即首先采用堿處理刺參組織，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增強(qiáng)刺參體壁組織匯總糖胺聚糖的釋放。為提高糖胺聚糖的純度，本發(fā)明依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化純化刺參糖胺聚糖粗糖。本發(fā)明的方法能夠平衡刺參糖胺聚糖的得率與純度的關(guān)系，提高了刺參糖胺聚糖的純度。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1本實(shí)施例的從刺參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一鮮刺參預(yù)處理；步驟二 堿解刺參體壁；步驟三雙酶酶解刺參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀刺參糖胺聚糖；步驟六干燥刺參糖胺聚 糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化刺參糖胺聚糖；步驟八干燥刺參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為步驟一鮮刺參預(yù)處理；迅速用蒸餾水沖洗刺參，去除刺參體表粘附的異物，用長形小刀自腹部僅肛門向前解剖鮮參，立即剔除內(nèi)臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱量后將刺參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎刺參體壁；步驟二 堿解刺參體壁往刺參體壁中加2倍重量的雙蒸水，然后加入2mol/L的 NaOH,邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為O. 5mol/L, 4°C過夜消化；步驟三刺參體壁的雙酶酶解胰蛋白酶酶解用冰醋酸調(diào)解PH值至8. 2，加入刺參體壁質(zhì)量O. 45%的胰蛋白酶，520C 水浴5h，水浴過程中充分?jǐn)嚢瑁⒌渭? mmol/L的NaOH溶液，維持pH在8. 2 ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下,保持30min后終止反應(yīng)；胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調(diào)解pH值至2之間，再添加刺參體壁質(zhì)量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續(xù)酶解4h，水浴過程中充分?jǐn)嚢瑁幻附饨K止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進(jìn)行檢測，當(dāng)溶液呈微混濁時(shí)，將酶解液迅速冷卻至30°C 以下，保持30min終止酶解反應(yīng)；然后以5000r/min離心15min收集上清夜；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min收集上清夜；步驟五乙醇沉淀刺參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調(diào)解上清液的pH值至6.8，7000r/min離心lOmin，收集上清加入無水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C 過夜沉淀；步驟六干燥刺參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗漆 3次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發(fā)， 沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到粗制刺參糖胺聚糖；步驟七首先將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。
然后將40g sephadex g_100凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜,脫氣后裝柱,用 2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg上述濃縮物用IOmL緩沖液在40°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量， 收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮·，得到刺參糖胺聚糖精糖。所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH為6. O。
步驟八干燥刺參糖胺聚糖精糖將刺參糖胺聚糖精糖分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到的白色干燥無定型粉末即為精制多糖。
實(shí)施例2本實(shí)施例的從刺參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一鮮刺參預(yù)處理；步驟二 堿解刺參體壁；步驟三雙酶酶解刺參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀刺參糖胺聚糖；步驟六干燥刺參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化刺參糖胺聚糖；步驟八干燥刺參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為步驟一鮮刺參預(yù)處理；迅速用蒸餾水沖洗刺參，去除刺參體表粘附的異物，用長形小刀自腹部僅肛門向前解剖鮮參，立即剔除內(nèi)臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱量后將刺參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎刺參體壁；步驟二 堿解刺參體壁往刺參體壁中加2倍重量的雙蒸水，然后加入2mol/L的 NaOH,邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為O. 5mol/L, 4°C過夜消化；步驟三刺參體壁的雙酶酶解胰蛋白酶酶解用冰醋酸調(diào)解PH值至9. 0，加入刺參體壁質(zhì)量O. 45%的胰蛋白酶，520C 水浴5h，水浴過程中充分?jǐn)嚢?，并滴? mmol/L的NaOH溶液，維持pH在9. O ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下,保持30min后終止反應(yīng)；胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調(diào)解pH值至2. 5之間，再添加刺參體壁質(zhì)量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續(xù)酶解4h，水浴過程中充分?jǐn)嚢?；酶解終止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進(jìn)行檢測，當(dāng)溶液呈微混濁時(shí)，將酶解液迅速冷卻至300C以下，保持30min終止酶解反應(yīng)；然后以5000r/min離心15min收集上清夜；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min收集上清夜；步驟五乙醇沉淀刺參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調(diào)解上清液的pH值至7.2，7000r/min離心lOmin，收集上清加入無水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C 過夜沉淀；步驟六干燥刺參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗漆 3次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發(fā)， 沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到粗制刺參糖胺聚糖；步驟七首先將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在60°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。
然后將40g sephadex g_100凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜,脫氣后裝柱,用 2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg上述濃縮物用IOmL緩沖液在60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量， 收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得到刺參糖胺聚糖精糖。所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH為6. 5。
步驟八干燥刺參糖胺聚糖精糖 將刺參糖胺聚糖精糖分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到的白色干燥無定型粉末即為精制多糖。
本發(fā)明實(shí)施例中所實(shí)施的從刺參中提取糖胺聚糖的方法，均能夠平衡刺參糖胺聚糖得率與純度的關(guān)系，提高刺參糖胺聚糖的純度。
權(quán)利要求
1.一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法，其特征在于包括下列步驟步驟一鮮刺參預(yù)處理；步驟二 堿解刺參體壁；步驟三雙酶酶解刺參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀刺參糖胺聚糖；步驟六干燥刺參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化刺參糖胺聚糖； 步驟八干燥刺參糖胺聚糖精糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法，其特征在于所述步驟七中凝膠柱純化的具體步驟為將40g葡聚糖凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜， 脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法，其特征在于所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH為6. O 6. 5。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及一種從刺參中提取并純化糖胺聚糖的方法。其包括下列步驟步驟一鮮刺參預(yù)處理；步驟二堿解刺參體壁；步驟三雙酶酶解刺參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀刺參糖胺聚糖；步驟六干燥刺參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化刺參糖胺聚糖；步驟八干燥刺參糖胺聚糖精糖。本發(fā)明能夠平衡刺參糖胺聚糖得率與純度的關(guān)系，提高刺參糖胺聚糖的純度。
文檔編號C08B37/00GK102993323SQ20121058495
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者辛永寧, 林中華, 宣世英, 姜相君, 姜曼, 李雪潔 申請人:青島市市立醫(yī)院