穩(wěn)定的NAD/NADH衍生物本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00680027359.1的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，要求2005年7月28日的優(yōu)先權(quán)。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及穩(wěn)定的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)衍生物、這些衍生物的酶配合物和它們?cè)谏锘瘜W(xué)檢測(cè)方法和試劑盒方面的用途。

背景技術(shù)：
生物化學(xué)分析學(xué)的測(cè)量系統(tǒng)是臨床相關(guān)分析方法的重要部分。這主要涉及直接或者間接在酶的輔助下進(jìn)行測(cè)定的分析物的測(cè)定，例如代謝物或者底物。該分析物在酶-輔酶配合物的輔助下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，和隨后進(jìn)行定量測(cè)定。在該方法中，預(yù)測(cè)定的分析物與適宜的酶和輔酶接觸，其中酶主要以催化量使用。通過(guò)酶反應(yīng)，輔酶得到改變，例如被氧化或者還原。該方法可以直接或者通過(guò)介體得到電化學(xué)或者光度檢測(cè)。標(biāo)定提供了意欲進(jìn)行測(cè)定的分析物的測(cè)量值和濃度之間的直接相關(guān)性。輔酶是共價(jià)或者非共價(jià)與酶連接的有機(jī)分子，并且通過(guò)分析物的轉(zhuǎn)化得到改變。輔酶的突出實(shí)例為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，通過(guò)還原它們分別形成NADH或NADPH?，F(xiàn)有技術(shù)已知的測(cè)量系統(tǒng)的特征在于在時(shí)間上有限的貯存期限，和為了獲得該儲(chǔ)存期限，對(duì)環(huán)境有特殊要求，比如，冷卻或者干燥儲(chǔ)存。由此，由不正確的、未注意的、不完善的存儲(chǔ)導(dǎo)致的錯(cuò)誤結(jié)果對(duì)于某些應(yīng)用形式可能存在，例如，在其中最終用戶自身進(jìn)行測(cè)試的情形中，比如葡萄糖自我監(jiān)控。特別是，由于開(kāi)放初始包裝過(guò)長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致干燥劑耗盡，會(huì)導(dǎo)致測(cè)量誤差，該測(cè)量誤差在一些系統(tǒng)中，消費(fèi)者幾乎不能辨認(rèn)。可以用于升高生物化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)穩(wěn)定性的已知測(cè)量是使用穩(wěn)定的酶，例如，使用得自于喜溫有機(jī)體的酶。還可以通過(guò)化學(xué)修飾使酶穩(wěn)定，例如交聯(lián)或者誘變。此外，還可以將酶穩(wěn)定劑(比如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白)加入或者將酶包裝入聚合物網(wǎng)絡(luò)中，例如通過(guò)光致聚合作用。還意圖通過(guò)使用穩(wěn)定的介體改良生物化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)的儲(chǔ)存期限。由此，通過(guò)使用具有最低可能氧化還原電勢(shì)的介體，測(cè)試的特異性會(huì)升高和反應(yīng)期間的干擾會(huì)被消除。然而，酶/輔酶配合物的氧化還原電勢(shì)構(gòu)成了介體的氧化還原電勢(shì)的下限。如果降低到該下限之下，與介體的該反應(yīng)將被延遲，或者甚至被阻止。另外地，還可以使用無(wú)介體的生物化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)，其中，對(duì)輔酶(比如輔酶NADH)直接進(jìn)行檢測(cè)。然而，所述測(cè)量系統(tǒng)的缺點(diǎn)是比如NAD和NADP的輔酶是不穩(wěn)定的。NAD和NADP是堿不穩(wěn)定(basenlabile)的分子，其降解途徑描述在文獻(xiàn)(N.J.OppenheimerinThePyridineNucleotideCoenzymsAcademicPress，NewYork，London1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter3，第56-65頁(yè))中。ADP-核糖基本上在NAD或者NADP通過(guò)裂解核糖和吡啶單元之間的糖基鍵接的降解期間形成。然而，還原形式的NADH和NADPH對(duì)酸不穩(wěn)定：例如，差向異構(gòu)化是已知的降解途徑。在上述兩種情形中，NAD/NADP和NADH/NADPH的不穩(wěn)定性是由于核糖和吡啶單元之間的糖基鍵的不穩(wěn)定性。但是，即使在并不劇烈的條件下(比如在含水溶液中)，輔酶NAD或NADP僅僅通過(guò)環(huán)境濕度進(jìn)行水解。當(dāng)測(cè)量分析物時(shí)，該不穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致不精確。一系列NAD/NADP衍生物描述在，例如，B.M.AndersoninthePyridineNucleotideCoenzymes，AcademicPressNewYork，London1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter4中。然而，酶對(duì)這些衍生物中的大多數(shù)接受并不良好。為此，先前用于診斷性測(cè)試的唯一衍生物是3-乙?；拎は汆堰识塑账?乙?；鵑AD)，其最早描述在1956年(N.O.Kaplan，J.Biol.Chem.(1956)，221，823)。還表明酶對(duì)該輔酶的接受低，并且該輔酶在氧化還原電勢(shì)上表現(xiàn)出變化。其它具有修飾吡啶基團(tuán)的NAD衍生物的使用描述在WO01/94370中。然而，煙酰胺基團(tuán)的修飾通常對(duì)催化反應(yīng)具有直接影響。在大多數(shù)情形中，該影響是負(fù)的。在另一穩(wěn)定性構(gòu)思中，為了影響糖基鍵的穩(wěn)定性，對(duì)核糖單元進(jìn)行變化。該方法不直接干擾煙酰胺基團(tuán)的催化反應(yīng)。然而，當(dāng)酶強(qiáng)烈和專一性結(jié)合至核糖單元時(shí)，可能存在間接作用。就此而論，Kaufmann等人在WO98/33936和US5,801,006或WO01/49247中公開(kāi)了一系列硫代核糖(Thioribose)-NAD衍生物。然而，煙酰胺核糖單元的修飾和衍生物在酶反應(yīng)中的活性之間的相關(guān)性先前并未得到證明。CarbaNAD，不具有糖基(Glycosyl)鍵的衍生物在1988年進(jìn)行了首次描述(J.T.Slama，Biochemistry1989，27，183和Biochemistry1989，28，7688)。在該衍生物中，核糖被carbacyclic糖單元取代。雖然carbaNAD被描述為脫氫酶的底物，但是，其活性迄今在臨床中在生物化學(xué)檢測(cè)方法中并未得到證實(shí)。類似方法后來(lái)由G.M.Blackburn，Chem.Comm.，1996，2765進(jìn)行了描述，以制備具有亞甲基雙膦酸酯連接物而不是天然焦磷酸酯的carbaNAD。亞甲基雙膦酸酯對(duì)磷酸酶表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性，被用作ADP核糖基環(huán)化酶的抑制劑。其目的并不是使其對(duì)水解的穩(wěn)定性升高(J.T.Slama，G.M.Blackburn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
由此，本發(fā)明的目的是提供特別是用于測(cè)定葡萄糖的穩(wěn)定生物分析測(cè)量系統(tǒng)，其避免了NAD/NADP水解的敏感性，并且同時(shí)在酶反應(yīng)中具有作為輔酶的活性。該目的通過(guò)測(cè)定分析物的測(cè)試元件得到實(shí)現(xiàn)的，其包含(i)輔酶依賴的酶或者所述酶的底物，和(ii)作為輔酶的以下通式(I)的化合物：其中A＝腺嘌呤或者其類似物，T＝在各種情況下獨(dú)立地表示O，S，U＝在各種情況下獨(dú)立地表示OH、SH、BH3-、BCNH2-，V＝在各種情況下獨(dú)立地表示OH或者磷酸酯基，W＝COOR、CON(R)2、COR、CSN(R)2，其中R在各種情況下獨(dú)立地表示H或者C1-C2-烷基，X1，X2＝在各種情況下獨(dú)立地表示O、CH2、CHCH3、C(CH3)2、NH、NCH3，Y＝NH、S、O、CH2，Z＝含有5個(gè)C原子的環(huán)狀基團(tuán)的殘基，所述環(huán)狀基團(tuán)任選含有選自O(shè)、S和N的雜原子并且任選具有一個(gè)或者多個(gè)取代基，和殘基CR42，其中CR42鍵接在環(huán)狀基團(tuán)和X2上，其中R4＝在各種情況下獨(dú)立地表示H、F、Cl、CH3，條件是Z和吡啶殘基不通過(guò)糖苷鍵連接，或者其鹽或者任選的還原形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，W＝CONH2或者COCH3。優(yōu)選在Z上的取代基選自O(shè)H、F、Cl和任選氟化或者氯化或/和OH-取代的C1-C2烷基，O-C1-C2-烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一殘基V為OH和第二殘基V為磷酸酯基。任選一個(gè)OH基團(tuán)和一個(gè)磷酸酯基可以與它們鍵接的碳原子形成環(huán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供用于測(cè)定葡萄糖的測(cè)試元件，其包括葡萄糖脫氫酶和如上所述的通式(I)化合物或者其鹽。令人驚訝地，根據(jù)本發(fā)明的化合物對(duì)水解穩(wěn)定，在酶檢測(cè)方法中是良好的底物，并且可以用于生物化學(xué)診斷。該發(fā)現(xiàn)與絕大多數(shù)迄今已知的NAD/NADP衍生物形成了對(duì)比，因?yàn)檫@些衍生物通常在酶檢測(cè)方法中僅僅穩(wěn)定非常短的時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明的化合物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為：-高穩(wěn)定性，-高酶活性，-簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)節(jié)約地合成，-它們可以用于所有迄今已知的生物化學(xué)檢測(cè)方法中。迄今已知的生物化學(xué)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)可以通過(guò)利用本發(fā)明提供穩(wěn)定的NAD/NADP衍生物得到基本避免，優(yōu)選本發(fā)明結(jié)合穩(wěn)定制劑(Rezeptur)使用，比如，例如通過(guò)將酶包裝入聚合物網(wǎng)絡(luò)中。此外，它不需要使用穩(wěn)定添加劑。這是特別有利的，因?yàn)槠渌婕暗姆磻?yīng)活性物質(zhì)的數(shù)目越低，所獲得的用于分析物測(cè)定的穩(wěn)定制劑的可能性就更大。本發(fā)明提供了包括一系列穩(wěn)定的NAD/NADP衍生物的測(cè)試元件，所述NAD/NADP衍生物具有在測(cè)試元件上用作輔酶的充分酶活性。穩(wěn)定的NAD/NADP衍生物可以通過(guò)一般已知的合成方法制備。對(duì)此，通過(guò)Zincke化學(xué)過(guò)程將環(huán)狀氨基醇的氨基轉(zhuǎn)化為吡啶鹽衍生物。隨后，使伯OH基團(tuán)進(jìn)行磷酸化和使其偶聯(lián)在活化的AMP衍生物上，從而形成NAD衍生物。另外地，還可以首先使伯OH基團(tuán)進(jìn)行磷酸化，然后可以通過(guò)Zincke反應(yīng)將氨基轉(zhuǎn)化為吡啶。另一合成路線是活化伯醇，從而形成甲苯磺酸鹽或者碘化物，隨后烷基化ADP。根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試元件的優(yōu)選實(shí)施方案包括例如具有以下通式(I’)的化合物：其中A＝腺嘌呤或者其類似物，T＝在各種情況下獨(dú)立地表示O，S，U＝在各種情況下獨(dú)立地表示OH、SH、BH3-、BCNH2-，V＝在各種情況下獨(dú)立地表示OH或者磷酸酯基，W＝COOR、CON(R)2、COR、CSN(R)2，其中R在各種情況下獨(dú)立地表示H或者C1-C2-烷基，X1，X2＝在各種情況下獨(dú)立地表示O、CH2、CHCH3、C(CH3)2、NH、NCH3，Y＝NH、S、O、CH2，Z＝飽和或者不飽和的碳環(huán)或者雜環(huán)五元環(huán)，特別是通式(II)化合物其中單鍵或者雙鍵可以存在于R5’和R5”之間，R4＝在各種情況下獨(dú)立地表示H、F、Cl、CH3，R5＝CR42，如果單鍵存在于R5’和R5”之間，那么R5′＝O，S，NH，NC1-C2-烷基，CR42，CHOH，CHOCH3，R5″＝CR42，CHOH，CHOCH3，如果雙鍵存在于R5’和R5”之間，那么R5’＝R5”＝CR4，R6，R6’＝在各種情況下獨(dú)立地表示CH、CCH3，或者其鹽或者任選的還原形式。以下通式(I”)化合物是本發(fā)明的另一主題：其中A＝腺嘌呤或者其類似物，T＝在各種情況下獨(dú)立地表示O，S，U＝在各種情況下獨(dú)立地表示OH、SH、BH3-、BCNH2-，V＝在各種情況下獨(dú)立地表示OH或者磷酸酯基，W＝COOR、CON(R)2、COR、CSN(R)2，其中R在各種情況下獨(dú)立地表示H或者C1-C2-烷基，X1，X2＝在各種情況下獨(dú)立地表示O、CH2、CHCH3、C(CH3)2、NH、NCH3，Y＝NH、S、O、CH2，Z＝飽和或者不飽和的碳環(huán)或者雜環(huán)五元環(huán)，特別是通式(II)化合物其中單鍵或者雙鍵可以存在于R5’和R5”之間，R4＝在各種情況下獨(dú)立地表示H、F、Cl、CH3，R5＝CR42，如果單鍵存在于R5’和R5”之間，那么R5′＝O，S，NH，NC1-C2-烷基，CR42，CHOH，CHOCH3，R5″＝CR42，CHOH，CHOCH3，如果雙鍵存在于R5’和R5”之間，那么R5’＝R5”＝CR4，R6，R6’＝在各種情況下獨(dú)立地表示CH、CCH3，條件是，如果R5＝CH2，T＝O，U＝在各種情況下OH，V＝OH，W＝CONH2，X＝O和Y＝O，那么R5’和R5”不同時(shí)是CHOH，或者其鹽或者任選的還原形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物含有腺嘌呤類似物(比如C8-取代和N6-取代的腺嘌呤)，去氮雜(Deaza)變體(比如7-去氮雜)，氮雜變體(比如8-氮雜)或者其組合(比如7-去氮雜或者8-氮雜)，或者碳環(huán)類似物，比如間型霉素，其中7-去氮雜變體可以在7位被鹵素、C1-C6-炔基、C1-C6-烯基或者C1-C6-烷基取代。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物含有腺苷類似物，所述腺苷類似物包括例如2-甲氧基去氧核糖、2’-氟去氧核糖、己糖醇、阿卓糖醇或者多環(huán)類似物(比如二環(huán)-、LNA-和三環(huán)-糖)而不是核糖。特別是，(二)磷酸鹽氧還可以被等電(isotronisch)取代，比如，例如O-被S-或BH3-，O被NH、NCH3或CH2和＝O被＝S取代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明化合物的至少一個(gè)殘基U不同于OH，和特別優(yōu)選至少一個(gè)殘基U＝BH3-。特別優(yōu)選的實(shí)施方案是衍生物硼烷并(Borano)carbaNAD、c-戊基NAD、吡咯基NAD、呋喃基NAD、carbaNAD環(huán)磷酸鹽、carbaNADP、吡咯烷基NAD以及含有它們的測(cè)試元件：硼烷并carbaNAD環(huán)戊基NAD吡咯基NAD呋喃基NADcarbaNAD環(huán)磷酸鹽carbaNADP吡咯烷基NAD分析物的生物化學(xué)檢測(cè)，例如在體液比如血液、血清、血漿或者尿中或者在廢水或食品的樣品中的參數(shù)在診斷學(xué)上是至關(guān)重要的。在這項(xiàng)測(cè)試中，意欲進(jìn)行測(cè)定的分析物與適宜的酶和輔酶接觸。由此，本發(fā)明的另一主題是由根據(jù)本發(fā)明的化合物聯(lián)合適宜的酶組成的酶-輔酶配合物。任何可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)檢測(cè)的生物學(xué)或者化學(xué)物質(zhì)都可以作為分析物進(jìn)行測(cè)定，例如為輔酶依賴的酶的底物或者輔酶依賴的酶自身的物質(zhì)。分析物的優(yōu)選實(shí)例為葡萄糖、乳酸、蘋果酸、甘油、醇、膽固醇、甘油三酸酯、抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、肽、脲、銨、水楊酸鹽、丙酮酸鹽、5’-核苷酸酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、二氧化碳等等。對(duì)于酶底物的檢測(cè)，優(yōu)選測(cè)試元件除了輔酶之外，還含有適于檢測(cè)底物的酶。適宜的酶為例如脫氫酶，選自葡萄糖脫氫酶(E.C.1.1.1.47)、乳酸脫氫酶(E.C.1.1.1.27，1.1.1.28)、蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)、甘油脫氫酶(E.C.1.1.1.6)、乙醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1)、α-羥基丁酸酯脫氫酶、山梨醇脫氫酶或者氨基酸脫氫酶(例如L-氨基酸脫氫酶(E.C.1.4.1.5)。其它適宜的酶為氧化酶(比如葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)或者膽固醇氧化酶(E.C.1.1.3.6)或者轉(zhuǎn)氨酶(比如天冬氨酸鹽或者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、5’-核苷酸酶或者肌酸激酶。對(duì)于酶的檢測(cè)，優(yōu)選測(cè)試元件除了輔酶之外，還含有適于檢測(cè)酶的酶底物。本發(fā)明的另一主題是根據(jù)本發(fā)明的化合物或者根據(jù)本發(fā)明的酶-輔酶配合物用于通過(guò)酶反應(yīng)檢測(cè)樣品中的分析物的用途。就此而論，特別優(yōu)選在葡萄糖脫氫酶(GlucDH)輔助下進(jìn)行的葡萄糖的檢測(cè)。輔酶(即根據(jù)本發(fā)明的化合物)通過(guò)與分析物反應(yīng)(如果分析物為酶底物)或者通過(guò)分析物-催化的反應(yīng)(如果分析物為酶)所產(chǎn)生的變化原則上可以以任何種類和方式進(jìn)行檢測(cè)?；旧纤鞋F(xiàn)有技術(shù)中已知的用于檢測(cè)酶反應(yīng)的方法都可以使用。然而，輔酶的變化優(yōu)選通過(guò)光學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。光學(xué)檢測(cè)方法包括例如，吸收、熒光、圓二色性(CD)、光學(xué)旋光性色散(ORD)、折射等等的測(cè)定。輔酶的變化特別優(yōu)選通過(guò)測(cè)量熒光進(jìn)行檢測(cè)。熒光測(cè)量是高度靈敏的，并且甚至能夠檢測(cè)小型系統(tǒng)中本身低濃度的分析物。液體測(cè)試可用于檢測(cè)分析物，其中試劑例如在含水或者非水液體中以溶液或者懸浮液的形式存在的試劑或者存在為粉末或者凍干劑的試劑。然而，還可以應(yīng)用干燥測(cè)試，在這種情形中，將試劑應(yīng)用于載體、試驗(yàn)條上。所述載體可以例如為含有被意欲進(jìn)行測(cè)定的樣品液體潤(rùn)濕的吸收或/和可膨脹材料的試驗(yàn)條。然而，其中含有酶-輔酶配合物的凝膠基質(zhì)還可以用作檢測(cè)試劑(參見(jiàn)DE10221845A1)。在這種情況下，酶可以與根據(jù)本發(fā)明的化合物一起聚合入基質(zhì)內(nèi)，或者在聚合反應(yīng)之后，基質(zhì)可以在酶存在下與輔酶溶液接觸，從而形成相應(yīng)的酶-輔酶配合物。本發(fā)明的另一主題涉及試劑盒和它用于檢測(cè)分析物的應(yīng)用。所述試劑盒可以含有根據(jù)本發(fā)明的化合物、適宜的酶和適宜的反應(yīng)緩沖液。適宜的酶已經(jīng)進(jìn)行了描述。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以以多種方式使用，并且可以用于檢測(cè)分析物，比如葡萄糖、乳酸、蘋果酸、甘油、醇、膽固醇、甘油三酸酯、抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、肽、脲、銨、水楊酸鹽、丙酮酸鹽、5’-核苷酸酶、CK、LDH和二氧化碳等等。優(yōu)選的是含有根據(jù)本發(fā)明的化合物和葡萄糖脫氫酶(E.C.1.1.1.47)的試劑盒，以檢測(cè)血液中的葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可用于檢測(cè)在無(wú)水或者液體測(cè)試中的分析物。本發(fā)明的另一主題涉及用于分析物的熒光光度(fluorometrischen)或者光度檢測(cè)的試驗(yàn)條。所述試驗(yàn)條含有如上所述的作為輔酶的化合物和適宜的酶或者固定在吸收或/和可膨脹材料上的酶底物。適宜的物質(zhì)可以，例如選自纖維素、塑料等等。本發(fā)明的另一主題包含用于檢測(cè)分析物的方法，該方法包括以下步驟：(a)使樣品和包含輔酶的根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試元件或者試劑盒接觸，和(b)檢測(cè)分析物，例如基于輔酶的變化的分析物。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是輔酶的熒光發(fā)射顯示出深色移動(dòng)，由此存在低的測(cè)試元件的其它物質(zhì)或/和樣品的熒光發(fā)射干擾。所述的本發(fā)明主題的所有優(yōu)選實(shí)施方案還意圖用于本發(fā)明的其它主題中，比如，例如，根據(jù)本發(fā)明化合物的優(yōu)選實(shí)施方案中。本發(fā)明將通過(guò)以下附圖和實(shí)施例進(jìn)行更詳盡地闡明。附圖說(shuō)明附圖圖1carbaNAD(cNAD)的合成方法的圖。圖2在8℃和37℃下壓制NAD的結(jié)果的圖。圖3在8℃和37℃下壓制carbaNAD的結(jié)果的圖。圖4通過(guò)烷基化ADP合成硼烷并NAD的方法的圖，其中在Y＝BH3的情形中，僅僅ADP的β磷酸鹽得到烷基化。圖5合成吡咯烷基NAD(pNAD)的方法的圖。相應(yīng)反應(yīng)步驟的化合物編號(hào)和產(chǎn)率緊挨結(jié)構(gòu)式進(jìn)行了描述。圖6A/6BNAD和pNAD(圖6A)和NADH或pNADH(圖6B)的吸收光譜。圖7作為GlucDH配合物的NADH和pNADH的熒光光譜(發(fā)射光譜)。圖8作為GlucDH配合物的NADH和pNADH的熒光光譜(激發(fā)光譜)。圖9NAD和pNAD穩(wěn)定性的對(duì)比。圖10A/10B/10CNAD和cNAD(圖10A)或NADH和cNADH(圖10B和10C)的吸收光譜。圖11作為GlucDH配合物的NADH和cNADH的熒光光譜。具體實(shí)施方式實(shí)施例穩(wěn)定的NAD/NADH衍生物的試驗(yàn)制備穩(wěn)定的NAD/NADH衍生物的制備基于作為實(shí)施例的carbaNAD(化合物9，圖1)和吡咯烷NAD(化合物18，圖5)的制備進(jìn)行了表明。其它衍生物可以利用適當(dāng)?shù)暮铣煞椒ㄟM(jìn)行制備。作為原料試劑使用的相應(yīng)氨基醇已知于文獻(xiàn)中：2-氨基-1，4-脫水-2，3-雙脫氧-L-蘇式-戊糖醇：Huryn，DonnaM.；Sluboski，BarbaraC.；Tam，SteveY.；Todaro，LouisJ.；Weigele，Manfred.TetrahedronLetters(1989)，30(46)，6259-62。3-氨基-(1R，3S)-環(huán)戊烷甲醇，Beres，J.；Sagi，G.；Tomoskozi，I.；Gruber，L.；Gulacsi，E.；Otvos，L.；TetrahedronLetters(1988)，29(22)，2681-4。A)carbaNAD的制備I.1R-(-)-外-順式-5，6-二羥基-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-3-酮(1)在11圓底燒瓶中，將16.4g(147mmol)1R-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的400ml丙酮溶液加入到22.5g(167mmol)N-甲基-嗎啉-N-氧化物的80ml去離子水溶液中。在冰上冷卻下，在15分鐘內(nèi)，將15ml(1.2mmol)2.5％的四氧化鋨的叔丁醇溶液加入其中。隨后，在室溫下將上述混合物攪拌過(guò)夜。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，通過(guò)蒸餾除去溶劑。將其與100ml一起攪拌，并且再次在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進(jìn)行蒸餾。然后，將其溶于600ml去離子水中，并且將35g活性碳加入其中。在所得混合物劇烈攪拌1小時(shí)，然后將其濾過(guò)Seitz深床過(guò)濾器K250。通過(guò)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行蒸餾，將水從濾液中除去。產(chǎn)品不經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。DC(Merck硅膠60F-254)：乙酸乙酯/甲醇/冰醋酸7∶2∶1Rf0.75(原料)，0.53(1)。用TDM著色/在氯氣室中展開(kāi)。*TDM試劑：溶液1∶10gN，N，N’，N’-四甲基-4，4’-二氨基-二苯甲烷的40ml冰醋酸和200ml去離子水溶液。溶液2：20g氯化鉀在400ml去離子水中。溶液3：將0.3g茚三酮溶解在10ml冰醋酸中，并且加入90ml去離子水。終止試劑：溶液1和2的混合物，并且加入6ml溶液3。II.1R-(-)-外-順式-5，6-二甲基亞甲基二氧基-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-3-酮(2)在200ml絕對(duì)乙醇中，將粗產(chǎn)品1在回流下加熱到沸騰1小時(shí)。加入400ml(3.26mol)二甲氧基丙烷和250mg(2.2mmol)鹽酸吡啶之后，將混合物進(jìn)一步加熱沸騰回流15分鐘。在加入10ml飽和碳酸氫鈉溶液之后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在真空下將溶液蒸發(fā)至干燥。將500ml氯仿、150ml飽和氯化鈉溶液和75ml飽和碳酸氫鈉溶液加入到所得殘余物中，并且將其轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。通過(guò)振搖進(jìn)行提取之后，將其放置過(guò)夜，在此期間進(jìn)行相分離。將有機(jī)相分離，和所得水相各自用200ml氯仿進(jìn)一步提取兩次。用硫酸鎂對(duì)合并的有機(jī)相進(jìn)行干燥。在通過(guò)過(guò)濾除去干燥劑之后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)減壓蒸餾將溶劑除去。所得粗產(chǎn)品(24.9g＝92％)不需要進(jìn)一步純化即可使用。DC(Merck硅膠60F-254)：乙酸乙酯/甲醇/冰醋酸7∶2∶1Rf0.84。用TDM著色/在氯氣室中展開(kāi)。III.1R-(-)-4-N-叔丁氧羰基-外-順式-5，6-二甲基亞甲基二氧基-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-3-酮(3)在氬氣下，將41.5g(190mmol)連二碳酸二叔丁酯和0.83g(6.8mmol)4-二甲基氨基吡啶加入到24.9g(135.7mmol)粗產(chǎn)品2的450ml絕對(duì)氯仿溶液中。在攪拌下對(duì)上述混合物進(jìn)行加熱沸騰回流，直至氣體產(chǎn)生停止為止。將所得混合物濾過(guò)填充有40g硅膠60和用氯仿平衡的柱。用100ml氯仿洗滌。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在減壓下進(jìn)行蒸餾，將溶劑從濾液中除去。在10mbar和40℃下，將所得粗產(chǎn)品干燥60分鐘。其不經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。DC(Merck硅膠60F-254)：乙酸乙酯/己烷3∶2Rf＝0.85。用TDM著色/在氯氣室中展開(kāi)。IV.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-(N-叔丁氧羰基)氨基-2，3-二甲基-亞甲基二氧基-1-(羥甲基)環(huán)戊烷(4)在室溫下，在攪拌下將粗產(chǎn)品3溶于400ml四氫呋喃中，并且將80ml去離子水加入其中。冷卻至4℃之后，將5.3g硼氫化鈉一次加入其中并且將其攪拌過(guò)夜，在此期間使混合物緩慢升溫至室溫。將100ml乙醇加入其中，并且在室溫下將其攪拌6小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在減壓下進(jìn)行蒸餾將溶劑除去。將300ml飽和氯化鈉溶液和650ml乙酸乙酯加入其中，并且將其轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。將有機(jī)相分離，和所得水相再次用350ml乙酸乙酯洗滌。用硫酸鎂對(duì)合并的有機(jī)相進(jìn)行干燥。在通過(guò)過(guò)濾除去干燥劑之后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)減壓蒸餾將溶劑蒸餾除去。通過(guò)柱色譜法和硅膠60(柱h＝93cm，d＝10cm，洗脫液THF/己烷1∶3，然后THF/己烷2∶3，流速3l/h)對(duì)所得粗產(chǎn)品(42.2g)進(jìn)行純化。收集得到40ml級(jí)份。通過(guò)DC(Merck硅膠60F-254：乙酸乙酯/己烷3∶2Rf＝0.45.用TDM著色/在氯氣室中展開(kāi))對(duì)所得級(jí)分進(jìn)行監(jiān)控。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在真空中進(jìn)行蒸餾將溶劑從合并的產(chǎn)品級(jí)分中除去，產(chǎn)率：24.9g。V.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-氨基-2，3-二羥基-1-(羥甲基)環(huán)戊烷(5)將8ml去離子水加入到11.0g(38.6mmol)產(chǎn)品4中，然后將80ml三氟乙酸加入其中。在室溫下將其劇烈攪拌6小時(shí)，在此期間形成澄清的淺黃色溶液。將200ml去離子水加入其中，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在真空下對(duì)其進(jìn)行蒸發(fā)。再次將200ml去離子水加入其中，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在真空下再次對(duì)其進(jìn)行蒸發(fā)。將所得粗產(chǎn)品溶于在超聲波浴中的100ml去離子水中并且進(jìn)行過(guò)濾。將所得濾液應(yīng)用到Dowex1X8(100-200網(wǎng)目，OH形式)離子交換劑柱(15x4.9cm)和用水洗脫，在此期間，在300ml體積中，約150ml之后產(chǎn)品得到洗脫(pH10.4)。通過(guò)DC(Merck硅膠60F-254：丁醇/冰醋酸/水5∶2∶3Rf＝0.42，用TDM著色/在氯氣室中展開(kāi))對(duì)所得級(jí)分進(jìn)行監(jiān)控。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在真空中進(jìn)行蒸餾將溶劑從合并的產(chǎn)品級(jí)分中除去，產(chǎn)率：5.2g無(wú)色油。VI.煙酰胺的Zincke鹽(6)在氮?dú)庀聦?8.6g二硝基氯苯熔化，然后將29.32g煙酰胺加入到所得熔化物中。在110℃下將其加熱2.5小時(shí)。通過(guò)回流冷凝器將500ml3∶2(v/v)乙醇/水混合物加入其中，并且對(duì)其進(jìn)行加熱沸騰回流，直至溶液得到形成為止。在室溫下攪拌過(guò)夜之后，將150ml50％乙醇/水和100ml水加入其中，將其轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并且每次用500ml氯仿洗滌三次。將300ml和50g活性炭加入到分離的水相中，在室溫下攪拌1小時(shí)，然后將其濾過(guò)Seitz深床過(guò)濾器K700。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在真空中將濾液濃縮至約100ml，期間浴溫必須不能超過(guò)20℃。用300ml水對(duì)其進(jìn)行稀釋，并且在攪拌下，在室溫下將70g四氟硼化鈉加入其中。在甲醇/水中對(duì)所得沉淀進(jìn)行重結(jié)晶。通過(guò)過(guò)濾將結(jié)晶物除去，用少量丙酮洗滌，然后用乙醚洗滌，在40℃下在高真空下將其干燥24小時(shí)(產(chǎn)率21.1g，23％)。通過(guò)DC(Merck硅膠60F-254：丁醇/冰醋酸/水5∶2∶3，Rf＝0.56)對(duì)所得級(jí)分進(jìn)行監(jiān)控。VII.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-(3-甲酰氨基(Carboxamido)吡啶-1-基)-2，3-二羥基-1-(羥甲基)環(huán)戊烷(6)＝carba煙酰胺單核苷＝carbaNMN在室溫下在攪拌下，在90分鐘內(nèi)，將4.5g(31mmol)環(huán)戊基胺5的110ml無(wú)水甲醇溶液滴加加入到15.3g(40.7mmol)Zincke鹽6的110ml無(wú)水甲醇溶液中。將1ml二異丙基乙胺加入其中，然后在室溫下將其攪拌兩天。將500ml水加入其中，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，每次用200ml二氯甲烷洗滌，洗滌兩次。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在真空下進(jìn)行蒸餾，將水從分離的水相中除去。將所得殘余物吸收在100ml水中，并且借助于柱色譜法在SephadexC25(Na+形式)上進(jìn)行純化：柱70x7.5cm，緩沖液A(去離子水)至緩沖液B(0.35MNaCl水溶液，流速200ml/h)洗脫。收集得到15ml級(jí)分，并且通過(guò)DC(Merck硅膠60F-254：丁醇/冰醋酸/水5∶2∶3，Rf＝0.22)對(duì)所得級(jí)分進(jìn)行監(jiān)控。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在真空中進(jìn)行蒸餾將溶劑從合并的產(chǎn)品級(jí)分中除去。將含鹽殘余物與500ml熱乙醇一起煮沸。對(duì)其進(jìn)行熱過(guò)濾，在室溫下將其放置12小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾將沉淀除去，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在真空下進(jìn)行蒸餾，將溶劑從濾液中除去。產(chǎn)量7g。VIII.(-)-(1R，2R，3S，4R)-4-(3-甲酰氨基吡啶-1-基)-2，3-二羥基-1-(phosphatoyl甲基1)環(huán)戊烷(6)＝carbaNMN-單磷酸鹽在0℃下，將20ml磷酰氯(phosphoroxychlorid)和50ml磷酸三甲酯的混合物加入到7g(27.7mmol)carbaNMN的80ml無(wú)水磷酸三甲酯懸浮液中。在0℃下將其攪拌2小時(shí)，然后在室溫下攪拌2小時(shí)。在冰上冷卻下，將300ml水加入其中，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在真空下將混合物蒸發(fā)至10ml。將其吸收在100ml水中、進(jìn)行過(guò)濾并且借助于柱色譜法在SephadexC25(NEt3H+形式)上進(jìn)行純化：柱66x9cm，緩沖液A(去離子水)至緩沖液B(0.60M乙酸銨)洗脫，流速200ml/h。收集得到15ml級(jí)分，并且通過(guò)DC(Merck硅膠60F-254板：異丁酸/氨/水66∶1∶33，Rf＝0.25)對(duì)所得級(jí)分進(jìn)行監(jiān)控。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在真空中進(jìn)行蒸餾將溶劑從合并的產(chǎn)品級(jí)分中除去。將所得殘余物溶于100ml水中，并且進(jìn)行冷凍干燥。將該過(guò)程重復(fù)三次。產(chǎn)量4.0g。IX.carbaNAD(9)在室溫下，在1小時(shí)內(nèi)，將1.25g(30mmol)AMP嗎啉鹽的40ml絕對(duì)DMF溶液滴加加入到3.31g(10mmol)carbaNMN單磷酸鹽的40ml絕對(duì)DMF溶液和78ml(39mmol)3.5％四唑的絕對(duì)乙腈溶液的混合物中。在室溫下將上述混合物攪拌2天。使用10％KHCO3水溶液將pH值調(diào)節(jié)為6.5，同時(shí)在干冰/丙酮上進(jìn)行冷卻。用500ml水對(duì)其進(jìn)行稀釋，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將其小心地真空濃縮至干燥。將所得殘余物溶于150ml去離子水中，并且在SephadexQAE25(NEt3H+形式)上通過(guò)柱色譜法進(jìn)行純化：柱65x4.5cm，緩沖液A(去離子水)至緩沖液B(1M三乙基碳酸銨)洗脫，流速200ml/h：收集得到15ml級(jí)分并且通過(guò)DC(Merck硅膠60F-254板：異丁酸/氨/水66∶1∶33，Rf0.47)進(jìn)行監(jiān)控。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，通過(guò)在真空中進(jìn)行蒸餾將溶劑從合并的產(chǎn)品級(jí)分中蒸餾除去。將所得殘余物溶于100ml水中，并且進(jìn)行冷凍干燥。將該過(guò)程重復(fù)三次。產(chǎn)量1.1g。carbaNAD穩(wěn)定性的測(cè)試在pH8下，在0.1M磷酸鉀緩沖液中，對(duì)10mMcarbNAD或NAD溶液進(jìn)行壓制。在0.25、75和175小時(shí)之后，通過(guò)HPLC色譜法對(duì)含量進(jìn)行確定。緩沖液A：100mMKHPO4+10mM四丁基硫酸氫銨，pH6.9；緩沖液B：緩沖液A+乙腈1∶1，流速1.0ml/min；檢測(cè)：254nmRP18柱L125，直徑4.6mm，梯度：40分鐘內(nèi)35％緩沖液B，保持2分鐘，然后在3分鐘內(nèi)改變?yōu)?％緩沖液A。在壓制到各種時(shí)間之后的HPLC面積百分比示于圖2和3中。分解產(chǎn)物(煙酰胺，ADP-核糖，AMP，ADP和NAD的未知分解產(chǎn)物以及cNAD的未知分解產(chǎn)物Y1和Y2)的存在表明相對(duì)于NAD而言，cNAD非常穩(wěn)定。B)吡咯烷基-NAD的制備I.pNAD第一階段(化合物10)的合成將反式-N-叔丁氧羰基-O-甲磺?；?4-羥基-L-脯氨醇(prolinol)(35.4g，120mmol)溶于500mlDMF中，并且將溶于75ml水中的疊氮化鈉(15.6g，240mmol)加入其中，在70℃下加熱5小時(shí)。隨后在室溫下將其進(jìn)一步攪拌過(guò)夜，將混合物傾倒入1000ml飽和氯化鈉溶液中并且用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯溶液用Na2SO4進(jìn)行干燥并且隨后對(duì)其進(jìn)行蒸發(fā)。形成32.8g(＞100％)殘余物(理論值：29g)。在DC和MS監(jiān)控之后，對(duì)粗產(chǎn)品進(jìn)行直接處理。為了進(jìn)行監(jiān)控，在KG60F254板(流動(dòng)的溶劑：乙酸乙酯/用茚三酮噴霧)上進(jìn)行薄層色譜法：反式-N-叔丁氧羰基-O-甲磺酰基-4-羥基-L-脯氨醇，Rf：0.49產(chǎn)品Rf：0.78MSESIES+242產(chǎn)品的等同性還通過(guò)NMR分析得到了證實(shí)。*反式-N-叔丁氧羰基-O-甲磺?；?4-羥基-L-脯氨醇市場(chǎng)購(gòu)買自SanochemiaPharmazeutikaAG，Cat.No.P-719。II.pNAD第二階段(化合物11)的合成將化合物10(120mmol)與500ml甲醇和2.0gPd-碳(10％濃度)混合，并且在30mbar下氫化12小時(shí)。在該方法中，反應(yīng)燒瓶用H2充溢若干次，通過(guò)抽吸過(guò)濾將催化劑除去并且對(duì)其進(jìn)行濃縮。無(wú)色油得到形成(應(yīng)當(dāng)對(duì)該油立即進(jìn)行進(jìn)一步處理，因?yàn)樗鼘?duì)空氣具有高度敏感性)。MSESIES+217存在DC(異己烷/乙酸乙酯1/1/KG254F/茚三酮)：產(chǎn)品保持在開(kāi)始位置。產(chǎn)品的等同性還通過(guò)NMR分析得到了證實(shí)。III.pNAD第三階段(化合物12)的合成將120mmol化合物11(MW：216.28)混合在500ml含有NaHCO3(11.0g，130mmol)和Fmoc氯化物(33.8g，130mmol)的二烷中，并且在室溫下將其攪拌過(guò)夜。通過(guò)過(guò)濾將所得鹽除去，對(duì)溶液進(jìn)行蒸發(fā)和在硅膠柱(異己烷和異己烷/EE8/21/1)上對(duì)所得殘余物進(jìn)行純化。主要餾分得到39.0g＝74.1％*(理論值＝52.6g)。DC(KG60F254，流動(dòng)溶劑異己烷/乙酸乙酯2∶1)：Rf0.13MSESIES+439/+339產(chǎn)品的等同性還通過(guò)NMR分析得到了證實(shí)。*產(chǎn)量是指第一階段的洗脫物。IV.pNAD第四階段(化合物13)的合成將得自于階段3的化合物12(7.08g，16.1mmol)溶于80ml磷酸三甲酯中，并且隨后在冰浴中將其冷卻至0℃。將與磷酸三甲酯混合的POCl3(在13ml磷酸三甲酯中的13ml新近蒸餾的POCl3)加入到滴液漏斗中，并且在氬氣下，在20分鐘內(nèi)將其分批加入。在放熱反應(yīng)中，溫度升高至最高達(dá)5℃。隨后將2.6ml吡啶加入其中，并且在0℃和氬氣下，將其進(jìn)一步攪拌40分鐘。將反應(yīng)溶液小心地滴加加入到800ml冰冷的1M三乙基碳酸氫銨溶液(pH＝8)中。在加入完成之后，將其進(jìn)一步攪拌1小時(shí)。隨后，將輕微渾濁的溶液滴加加入(迅速加入)到1l飽和NaCl溶液中。將其進(jìn)一步攪拌過(guò)夜，從而改良結(jié)晶。通過(guò)過(guò)濾將沉淀除去。通過(guò)Diaion柱對(duì)所得殘余物進(jìn)行脫鹽。為了實(shí)現(xiàn)該目的，將500gDiaion加入到異丙醇/水1/1中，并且使其溶脹過(guò)夜。將Diaion填充入柱中，并且用水進(jìn)行沖洗。在100mlpH3.5(乙酸)的水中形成殘余物的漿液，隨后將其施加到柱上并且用水(pH3.5)沖洗，直至不含氯化鈉為止。然后，用25％異丙醇(pH3.5)在柱上對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行洗脫。在室溫下，在高真空中對(duì)溶液進(jìn)行蒸發(fā)。殘余物＝2.6g＝31.3％DCRP8F254/MeOH/水9/1MSESIES-517.13產(chǎn)品的等同性還通過(guò)NMR分析得到了證實(shí)。V.pNAD第五階段(化合物14)的合成在室溫下，將得自于階段4的化合物13(4.10g，7.9mmol)的250ml甲醇和83ml25％氨水的混合物攪拌過(guò)夜，并且在室溫下在真空中進(jìn)行蒸發(fā)。將所得殘余物吸收在200ml水中，并且用100ml乙酸乙酯攪拌三次。通過(guò)過(guò)濾將不溶性組分除去；將澄清的水相分離并且在室溫下再次對(duì)其進(jìn)行蒸發(fā)。殘余物＝2.56g＝100％MSESIES-295為了除去NH3陽(yáng)離子，將殘余物溶于2xHünig’s堿中，并且每次都在高真空下對(duì)其進(jìn)行蒸發(fā)。VI.pNAD第六階段(化合物15)的合成使Zinke鹽(2.66g，8.99mmol)部分溶于50ml甲醇中，并且在攪拌的同時(shí)，將溶于50ml甲醇中的得自于階段5的化合物14(2.56g，8.31mmol)滴加加入其中。上述混合物變?yōu)榧t色，并且慢慢被溶解。在室溫下進(jìn)一步將其攪拌過(guò)夜，并且通過(guò)過(guò)濾將沉淀除去。在真空中對(duì)濾液進(jìn)行蒸發(fā)、吸收在100ml水中并且用乙酸乙酯提取三次。乙酸乙酯相含有副產(chǎn)品二硝基苯胺，水相含有產(chǎn)品和剩余的Zincke鹽。在室溫下，在真空中對(duì)水相進(jìn)行蒸發(fā)，并且將10ml水加入到獲得的殘余物中，在磁力攪拌器上將其攪拌10分鐘，并且通過(guò)過(guò)濾將不溶性組分除去。產(chǎn)品仍然為溶解形式。將所得溶液施加到已經(jīng)用水沖洗過(guò)的DiaionHP20柱(1000ml)上，并且用1000ml水沖洗兩次。隨后用水/5％異丙醇對(duì)其進(jìn)行沖洗，在室溫下對(duì)肯定的(positive)級(jí)分(通過(guò)DCRP8MeOH/W9/1檢測(cè))進(jìn)行蒸發(fā)。將所得殘余物與異丙醇一起研磨，并且在乙醚的輔助下進(jìn)行抽吸過(guò)濾。殘余物＝1.60g＝47.9％DCRP8254MeOH/W9/1MSES-400.1/ES+402.0還顯示出雙重質(zhì)量產(chǎn)品的等同性還通過(guò)NMR分析得到了證實(shí)。VIIa.pNAD階段7a(化合物16)的合成對(duì)AMP酸(一磷酸腺苷-游離酸)(10g，27.5mmol)的60ml甲醇(用鈉干燥的)和5.3ml(60mmol)嗎啉(新近蒸餾的)的混合物進(jìn)行攪拌，直至澄清溶液得到形成為止。隨后將17g(82.5mmol)N，N’-二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC)加入其中，并且在室溫下將其攪拌過(guò)夜，同時(shí)排除水份。對(duì)形成的沉淀(DCH)進(jìn)行抽吸過(guò)濾，并且在30℃下對(duì)濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。隨后，將其與150mlH2O/150ml乙醚一起進(jìn)行攪拌，并且再次進(jìn)行過(guò)濾。將各相分離之后，所得水相再次用每次75ml乙醚提取兩次。隨后，在室溫下對(duì)水相進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。將所得殘余物另外溶解在吡啶中兩次，每次都在高真空下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。VII.pNAD第七階段(化合物17)的合成在室溫下，將AMP嗎啉鹽(morpholidat)(得自于階段7a的化合物16)(2.53g，3.61mmol)、得自于階段6的化合物15(1.60g，3.98mmol)、0.2M*MnCl2的甲酰胺溶液(27.1ml，5.42mmol)和無(wú)水MgSO4(0.87g，7.95mmol)的混合物攪拌過(guò)夜，在此時(shí)間之后，通過(guò)DC(RP8MeOH/W9/1)確定其大部分上進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。用乙腈使反應(yīng)混合物沉淀并且進(jìn)行抽吸過(guò)濾。殘余物＝5.3g(理論值2.64g)**MS，ESIES-729.3＝產(chǎn)品，ES-415＝AMP嗎啉鹽的陽(yáng)離子，ES-400.2/ES+402.1殘余的化合物15(階段6)DCRP8F254Rf0.085*為了制備該溶液，將2516mg無(wú)水MnCl2溶于100ml99.99％甲酰胺中，同時(shí)進(jìn)行攪拌，隨后將4A分子篩加入其中。**將所得殘余物進(jìn)一步處理為粗產(chǎn)品。VIII.pNAD第八階段(化合物18，吡咯烷基-NAD)的合成將5.0ml三氟乙酸(TFA)加入到500mg得自于階段7的化合物17(粗產(chǎn)品，含有約50％鹽)中，并且在室溫下將其攪拌1小時(shí)，隨后通過(guò)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。500mg無(wú)色油以殘余物的形式得到形成。MSESIES-729.24(需要加入NH3)200mg和300mg的兩份各自以2步分離的步驟進(jìn)行純化：第一分離步驟：FraktogelEMDSO3-s柱：D(內(nèi)部)＝14mmL(填充)＝85mmI.條件(流速5ml/min)a)100mlH2Ob)200ml0.25MH2SO4c)100mlH2Od)200ml1M氨溶液e)100mlH2OII.分離：a)應(yīng)用200mg溶于5mlH2O中的物質(zhì)b)用H2O→0.2MNH4HCO3溶液的梯度洗脫。(流動(dòng)溶劑A＝250mlH2O，裝入Erlenmeyer燒瓶中，在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌，以5ml/min的速度泵到柱上流動(dòng)溶劑B＝0.2MNH4HCO3溶液，以2.5ml/min泵送到A)。III.分餾：a)各自3ml的級(jí)分b)第一峰雜質(zhì)c)在約70ml初步洗脫物質(zhì)之后的第二峰IV.重建條件：a)100ml1M銨溶液b)100mlH2O第二分離步驟：DiaionHP20，柱D(內(nèi)部)＝30mmL(填充)130mm，用100mlH2O和100mlH2O/5％異丙醇洗脫。物質(zhì)已經(jīng)由水相洗脫；僅僅雜質(zhì)存在于異丙醇部分中。根據(jù)分析HPLC，獲得3種級(jí)分：F1＝13.5mg，F(xiàn)2＝5.5mg，F(xiàn)3＝11.5mg，總共＝30.5mg＝12.2％。與吡咯烷基NAD(化合物18)的等同性通過(guò)NMR分析得到了證實(shí)。pNAD的葡萄糖脫氫酶測(cè)定為了測(cè)定pNAD作為葡萄糖脫氫酶(GlucDH)輔因子的作用，在0.1mTris/0.2MNaCl(pH8.5)緩沖液中進(jìn)行GlucoseDH活性測(cè)定。葡萄糖的濃度為80mM。使用的pNAD或作為NAD的濃度為0.05-0.5mM。向其中加入10mg/ml(pNAD)或者0.002mg/ml(NAD)[分別83或者0.017μm]GlucDH。所述測(cè)定在室溫下進(jìn)行，其中酶反應(yīng)通過(guò)記錄吸收光譜以定期時(shí)間間隔進(jìn)行監(jiān)控。示于表1中的值是指在4分鐘之后的吸收測(cè)量值。表1(p)NAD(mM)U/ml％活性使用的[GlucDH]0.05NAD5391000.002mg/ml0.4NAD15561000.002mg/ml0.05pNAD0.000170.0000310μl10mg/ml0.4pNAD0.00240.0001510μl10mg/mlpNAD和pNADH的吸收光譜NAD和pNAD或NADH和pNADH的吸收光譜示于圖6A和6B中。NAD和pNAD在260nm下顯示出最大吸收。同NADH相比，pNADH，即GlucDH活性測(cè)定之后的pNAD的最大吸收顯示出大約10nm的紅移(圖6B)。作為GlucDH配合物的NADH和pNADH的熒光光譜另外示于圖7和8中。在各種情形中，光譜在GlucDH活性測(cè)定之后進(jìn)行記錄。圖7顯示了在340和370nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，NADH/pNADH-GlucDH配合物的發(fā)射光譜。NADH和pNADH在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜是相似的。圖8顯示了NADH/pNADH-GlucDH配合物在460nm的發(fā)射波長(zhǎng)下的激發(fā)光譜。pNADH顯示出比NADH更寬的激發(fā)光譜。光譜同樣在GlucDH活性測(cè)定之后進(jìn)行記錄。pNAD穩(wěn)定性的研究為了測(cè)定與NAD相比pNAD的穩(wěn)定性，將相同量NAD和pNAD各自吸收在0.15MKPO4，1MNaCl緩沖液(pH7.0)中，并且在50℃下進(jìn)行溫育。NAD或pNAD的降解通過(guò)HPLC進(jìn)行監(jiān)控。圖9顯示了在零時(shí)間時(shí)，同(p)NAD量相比的(p)NAD量的百分比面積。該圖表明，同NAD相比，pNAD非常穩(wěn)定。C)carbaNAD環(huán)磷酸鹽(19)的制備將79mg(0.1mmol)O5’-(羥基-嗎啉代-磷?；?-O2’，O3’-羥基-磷?；?腺苷、N-環(huán)己基-嗎啉-4-碳亞胺酸carbonimid環(huán)己胺鹽二水合物(通過(guò)與吡啶共蒸發(fā)進(jìn)行干燥)(Morphat等人，J.Am.Chem.Soc.83；1961；663-675)、44mg(0.105mmol)carbaNMN單磷酸鹽和隨后的25mg無(wú)水硫酸鎂加入到0.74ml0.2M氯化錳的絕對(duì)甲酰胺溶液中。在氬氣下，在密閉的反應(yīng)容器中將混合物攪拌三天，隨后在攪拌的同時(shí)將其加入到10ml乙腈中。通過(guò)過(guò)濾將沉淀除去，在RP18HypersilODS上通過(guò)RP色譜法進(jìn)行純化，250x21.2mM，5μm柱，使用0％B～100％B梯度60分鐘：洗脫液A：0.1M三乙基乙酸銨，洗脫液B：0.1M三乙基乙酸銨和乙腈的1∶4混合物，流速：10ml/min。通過(guò)在260nm下進(jìn)行檢測(cè)對(duì)洗脫進(jìn)行監(jiān)控。為了除去三乙基乙酸銨，對(duì)主組分進(jìn)行收集和進(jìn)行冷凍干燥5次。用Dowex50WX2將三乙基銨鹽轉(zhuǎn)化為游離酸，隨后將其轉(zhuǎn)化為鋰鹽。產(chǎn)量：10mg。D)carbaNADP(20)的制備在37℃下，在6小時(shí)內(nèi)將三次四單位核糖核酸酶T2加入2.2mgcarbaNAD環(huán)磷酸鹽鋰鹽(19)的1ml二-三-丙烷緩沖液(0.02M，pH7.5)溶液中。在37℃下將混合物保持過(guò)夜。通過(guò)在65℃下加熱20分鐘使酶變性。在過(guò)濾之后，在RP18HypersilODS上通過(guò)RP色譜法進(jìn)行純化，250x21.2mm，5μm柱，使用0％B～100％B的梯度純化60分鐘。洗脫液A：0.1M三乙基乙酸銨；洗脫液B：0.1μ三乙基乙酸銨和乙腈的1∶4混合物；流速：10ml/min。通過(guò)在260nm下進(jìn)行檢測(cè)對(duì)洗脫進(jìn)行監(jiān)控。為了除去三乙基乙酸銨，對(duì)主級(jí)分進(jìn)行收集和進(jìn)行冷凍干燥5次。質(zhì)譜(MALDIAppliedBiosystemsVoyagerSystem6327：計(jì)算值742.45，實(shí)測(cè)值：743.17)。E)cNAD的葡萄糖脫氫酶活性測(cè)定如B)對(duì)pNAD所述，為了同NAD相比，進(jìn)行對(duì)cNAD進(jìn)行葡萄糖脫氫酶活性測(cè)定。為了實(shí)現(xiàn)該目的，使用0.1(cNAD)或0.002mg/ml(NAD)[分別0.83或0.017μm]的葡萄糖脫氫酶濃度。使用的量和結(jié)果示于表2中。表2(c)NAD(mM)U/ml％活性使用的[GlucDH]0.05NAD4301000.002mg/ml0.1NAD5561000.002mg/ml0.05cNAD2.70.630.1mg/ml0.1cNAD5.30.950.1mg/mlF)cNAD和cNADH的吸收光譜圖10A、10B或10C顯示了NAD和cNAD的吸收光譜。NAD以及cNAD在260nm下具有最大吸收。圖10B顯示了NADH和cNADH的吸收光譜，其中在各種情形下，在葡萄糖脫氫酶活性測(cè)定之后對(duì)光譜進(jìn)行記錄。cNADH的最大吸收表現(xiàn)出20nm的紅移。NADH和cNADH的其它吸收光譜示于圖10C中，其中將相關(guān)葡萄糖脫氫酶活性測(cè)定的不同條件如圖例中所述進(jìn)行選擇。圖11另外顯示了作為GlucDH配合物的NADH和cNADH的熒光光譜。在葡萄糖脫氫酶活性測(cè)定之后，在370nm的激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)光譜進(jìn)行記錄。當(dāng)用GlucDH處理時(shí)，NADH以及cNADH顯示出升高的熒光信號(hào)。