本發(fā)明涉及能夠中和與人細(xì)胞上的膜受體結(jié)合的制瘤素M產(chǎn)生的生物活性的人抗體和用途。

背景技術(shù)：
制瘤素M(OSM)是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和激活的T-淋巴細(xì)胞分泌的IL-6家族細(xì)胞因子的28kDa多功能成員(Tanaka&Miyajima，RevPhysiolBiochemPharmacol(《生理學(xué)、生物化學(xué)和藥理學(xué)綜述》)149：39-53，2003)。分泌的OSM的羧基末端附近的蛋白水解裂解產(chǎn)生完全活性形式的OSM，其長度為209個氨基酸，具有兩個N-連接的糖基化位點。OSM屬于IL-6家族細(xì)胞因子，IL-6家族細(xì)胞因子包括(IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、心肌營養(yǎng)素-1、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和心肌營養(yǎng)素樣細(xì)胞因子(CLC))，它們共享共同受體亞基gp130蛋白質(zhì)。在人體中，OSM通過由gp130和LIFRα亞基或gp130和OSMRβ亞基組成的受體異源二聚體傳遞信號。與其他IL-6家族的其他細(xì)胞因子相比，OSM在不存在任何附加膜結(jié)合輔助受體的情況下直接結(jié)合gp130(Gearing等人，Science(《科學(xué)》)255：1434-1437，1992)。在OSM結(jié)合到gp130之后，OSMRβ或LIFRα被募集從而形成高親和力的信號傳導(dǎo)復(fù)合物(Mosley等人，JBiolChem(《生物化學(xué)雜志》)271：32635-32643，1996)。任一受體的激活導(dǎo)致通過JAK/STAT通路的信號傳導(dǎo)(Auguste等人，JBiolChem(《生物化學(xué)雜志》)272：15760-15764，1997)。OSM主要由免疫系統(tǒng)來源的細(xì)胞產(chǎn)生，并且由于其信號傳導(dǎo)受體分布廣泛，其已與多種生物活性相關(guān)，包括細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、神經(jīng)發(fā)育和細(xì)胞外基質(zhì)組成的調(diào)節(jié)。如其名稱所暗示，制瘤素M與致癌過程相關(guān)。然而，OSM也參與炎癥中早期事件和導(dǎo)致有害病癥例如肺纖維化的肥厚性通路。因此，需要提供能夠阻斷受體信號傳導(dǎo)(gp130信號傳導(dǎo))事件的對人OSM特異的人抗體，該信號阻斷抗體可對gp130表達(dá)細(xì)胞施加臨床可用的毒害細(xì)胞、抑制細(xì)胞或免疫調(diào)節(jié)效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供能夠阻斷與一種或多種生物活性相關(guān)的活性的OSM結(jié)合單克隆抗體，所述生物活性與宿主受試者的細(xì)胞、組織或器官上的OSM與OSM結(jié)合受體相互作用相關(guān)。提供了示例性O(shè)SM結(jié)合單克隆抗體的氨基酸序列，其可由用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸編碼。本發(fā)明的一種或多種OSM單克隆抗體限定OSM表面上的表位，當(dāng)OSM被本發(fā)明的抗體緊密結(jié)合時，其被阻止與信號傳導(dǎo)復(fù)合物的受體組分即gp130和LIFRα或gp130和OSMRβ相互作用，從而阻止配體連接驅(qū)動的信號傳導(dǎo)和下游生物活性。本發(fā)明的一個方面是與人OSM蛋白反應(yīng)的分離的抗體，所述抗體具有如下所述單克隆抗體的抗原結(jié)合能力，該單克隆抗體包含具有如SEQIDNO：13-18單獨示出的氨基酸序列或在如SEQIDNO：1-3示出的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的指定位置處的抗原結(jié)合域，如SEQIDNO：27-29和47表示的CDR3；或包含具有如SEQIDNO：23-26單獨示出的氨基酸序列或在如SEQIDNO：5-8及其變體示出的指定位置處的抗原結(jié)合域和如SEQIDNO：19-22表示的CDR3。在一個具體實施例中，人OSM結(jié)合抗體包含選自SEQIDNO：49-55的可變域。在本發(fā)明的另一個實施例中，用作全長IgG結(jié)構(gòu)的單克隆抗體結(jié)合域具有衍生自人IgG恒定域或其特定變體的恒定域，并且用作藥物制劑中的治療分子以阻止OSM與展示OSM受體組分的細(xì)胞結(jié)合。在另一個實施例中，結(jié)合域被構(gòu)造為抗體片段，該抗體片段用作能夠阻止OSM與展示OSM受體組分的細(xì)胞結(jié)合的治療分子。在本發(fā)明的一個方面，提供了治療制瘤素M相關(guān)的病癥的藥學(xué)上可接受的制劑、遞送體系、或試劑盒或方法，其包含本發(fā)明的一個或多個OSM結(jié)合域，諸如但不限于如SEQIDNO：29和47提供的13-28和30-46及變體。附圖說明圖1示出用于構(gòu)建展示在pIX外殼蛋白上的Fab文庫的種系基因序列，其中每個HV域由根據(jù)SEQIDNO：1-3(1＝IGHV1-69，2＝IGHV3-23，且3＝IGHV5-51)的差異化FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3接著可變長度的差異化H-CDR3區(qū)以及J區(qū)(FR4，SEQIDNO：4)組成；并且每個LV域由根據(jù)SEQIDNO：5-8(5＝IGKV1-39(O12)，6＝IGKV3-11(L6)，7-IGKV3-20(A27)，且8＝IGKV4-1(B3))的差異化FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3接著根據(jù)SEQIDNO：9的CDR3接著J區(qū)(FR4，SEQIDNO：10)組成。圖2A為CHO細(xì)胞來源的重組人和食蟹猴制瘤素M抑制A375-S2細(xì)胞增殖的劑量-反應(yīng)圖，其通過BrdU摻入而測量并歸一化成在僅媒介物存在的情況下的對照。圖2B為示出由L180(SEQIDNO：53)和H17(SEQIDNO：54)可變域組成的抗體M71減輕OSM對A375-S2增殖的抑制的能力的圖，其中OSM以2ng/ml的濃度存在。圖3為示出20μg/ml的M64、M71、M55和M69將35SO4-吸收(增加的蛋白聚糖合成的量度)增加至在不存在抗體的情況下觀察到的水平以上的效應(yīng)的柱形圖，其中非特異性同種型抗體是藻酸鹽珠中的人軟骨細(xì)胞和能夠分泌OSM的人巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)物中的對照。圖4A為示出在NHLF細(xì)胞中人OSM刺激的pSTAT3的劑量反應(yīng)的圖，其中發(fā)現(xiàn)EC50為大約1ng/ml。圖4B為示出在2ng/mlOSM存在的情況下抗體M71中和pSTAT3信號傳導(dǎo)的能力的圖。圖5A和5B為示出在用OSM刺激之后并且在用或未用指定濃度的M71抗體預(yù)處理的情況下在各個小鼠的血清中檢測的IP-10(A)和MCP-1(B)的量的散點圖。圖6A和6B為示出在靜脈內(nèi)(A)或皮下(B)施用3mg/KgM71或M71的Fc變體之后在食蟹猴中隨時間推移而變化的血清濃度的圖。具體實施方式本說明書中所引用的所有出版物(包括但不限于專利和專利申請)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整給出?？s寫B(tài)SA＝牛血清白蛋白；CDR＝互補(bǔ)決定區(qū)；Cyno＝食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))；DN＝糖尿病性腎?。籈CD＝細(xì)胞外域；FR＝框架；H＝重鏈；IPF＝間質(zhì)性肺關(guān)節(jié)炎；L＝輕鏈；Ig＝免疫球蛋白；Mab＝單克隆抗體；OSM＝制瘤素M；OA＝骨關(guān)節(jié)炎；PBS＝磷酸鹽緩沖鹽水；RA＝類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；VL＝可變輕鏈；VH＝可變重鏈。定義如本文所用，“抗體”包括全抗體和任何抗原結(jié)合片段或其單鏈。因此，抗體包括任何包含這樣的分子的蛋白或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，諸如但不限于重鏈或輕鏈的至少一個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架區(qū)(FR)、或其任何部分，或可整合進(jìn)本發(fā)明的抗體中的結(jié)合蛋白的至少一部分。術(shù)語“抗體”還旨在涵蓋抗體、其消化片段、指定部分或變體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其指定片段或部分的結(jié)構(gòu)和/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體和單域抗體及其片段。功能片段包括針對預(yù)選靶標(biāo)的抗原結(jié)合片段。涵蓋于抗體的“抗原結(jié)合部分”術(shù)語中的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH域組成的一價片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含通過鉸鏈區(qū)二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個支臂的VL和VH域組成的Fv片段，(v)由VH域組成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個域VL和VH由單獨的基因編碼，但它們可使用重組方法通過合成的連接肽連接，從而將它們制成單個蛋白質(zhì)鏈，所述連接肽使得它們可制成單個蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成一價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人(1988)Science(《科學(xué)》)242：423-426以及Huston等人(1988)Proc.Natl.AcadSci.USA(《美國科學(xué)院院刊》)85：5879-5883)。此類單鏈抗體也旨在涵蓋于抗體的“抗原結(jié)合部分”術(shù)語中。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并篩選出效用方式與完整抗體相同的片段。相反地，可用scFv構(gòu)造文庫篩選抗原結(jié)合力，之后使用常規(guī)技術(shù)將其與編碼人種系基因序列的其他DNA拼接在一起。這種文庫的一個例子是“HuCAL：HumanCombinatorialAntibodyLibrary(人組合抗體文庫)”(Knappik，A.等人，JMolBiol(《分子生物學(xué)雜志》)(2000)296(1)：57-86)。術(shù)語“CDR”是指抗體的互補(bǔ)決定區(qū)或高變區(qū)氨基酸殘基，這些氨基酸殘基參與或負(fù)責(zé)抗原結(jié)合。人IgG抗體亞型的高變區(qū)或CDR包含來自輕鏈可變域中的殘基24-34(L-CDR1)、50-56(L-CDR2)和89-97(L-CDR3)以及重鏈可變域中的殘基31-35(H-CDR1)、50-65(H-CDR2)和95-102(H-CDR3)的氨基酸殘基(如Kabat等人(1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1991個免疫學(xué)關(guān)注的蛋白序列)，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.)所述)和/或來自輕鏈可變域中的高變環(huán)(即殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3))以及重鏈可變域中的26-32(H1)、53-55(H2)或當(dāng)前H2Chothia定義的52-57和96-101(H3)的那些殘基(如(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)196：901-917(1987))所述)。Chothia和Lesk將結(jié)構(gòu)保守的HV稱為“正則結(jié)構(gòu)”?？蚣芑騀R1-4殘基是那些可變域殘基而不是且排除高變區(qū)。Chothia和Lesk的編號體系通過在以小寫字母符號表示的指定殘基處顯示擴(kuò)展來考慮環(huán)中的殘基的編號差別，例如30a、30b、30c等。最近，已發(fā)展并廣泛采用了通用編號體系，即國際免疫遺傳學(xué)信息體系(internationalImMunoGeneTicsinformation)(IMGT)(LaFranc等人，2005.NuclAcidsRes.(《核酸研究》)33：D593-D597)。本文中，CDR以氨基酸序列以及重鏈或輕鏈中的位置通過順序編號來表示。由于CDR在免疫球蛋白可變域的結(jié)構(gòu)中的“位置”在物種間是保守的且存在于稱為環(huán)的結(jié)構(gòu)中，因此通過使用根據(jù)結(jié)構(gòu)特征對齊可變域序列的編號體系，容易鑒定CDR和框架殘基。這種信息用于將來自一個物種的免疫球蛋白的CDR殘基移接和置換到來自通常是人抗體的受體框架中。術(shù)語“成熟”應(yīng)用于為了改變多肽性能的目的在抗體可變區(qū)進(jìn)行的定向變化。如本領(lǐng)域已知和本文所述的，V區(qū)序列中的很多位置可影響抗原的識別。實際上，抗體通過體細(xì)胞突變的漸進(jìn)過程來獲得高親和力和特異性?？稍隗w外模擬該過程以允許平行選擇和靶向變異，同時保持每個抗體鏈的序列完整性，以使得它們反映物種(在這種情況下是人)抗體，同時增強(qiáng)親和力或生物物理參數(shù)如溶解度或抗氧化性。進(jìn)行定向變化或“成熟”的過程通常在編碼序列水平上進(jìn)行并可通過制作用于選擇增強(qiáng)的性能的子文庫來實現(xiàn)。如本文所用，“OSM”是指制瘤素M多肽或包含編碼OSM多肽的編碼序列的多核苷酸。人OSM是人osm基因(基因5008)的產(chǎn)物。術(shù)語“表位”是指能與抗體特異性結(jié)合的蛋白決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)例如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及比電荷特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于與前者而不是后者的結(jié)合在變性溶劑存在的情況下會喪失。如本文所用，KD是指解離常數(shù)，具體地講，是指抗體對預(yù)定抗原的KD，并且是抗體對特定靶標(biāo)的親和力的測量。高親和力抗體對預(yù)定抗原的KD為10-8M或更低，更優(yōu)選10-9M或更低，并且更優(yōu)選10-10M或更低。KD的倒數(shù)是KA，為締合常數(shù)。如本文所用，術(shù)語“kdis”或“k2”或“kd”意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。“KD”是解離速率(k2，也稱為“解離率(off-rate)(koff)”)與締合速率(k1)或“結(jié)合率(on-rate)(kon)”的比率。因此，KD等于k2/k1或koff/kon，且以摩爾濃度(M)表示。它遵循下列原則，即KD越小，結(jié)合越強(qiáng)。因此與10-9M(或1nM)相比較，10-6M(或1微摩爾)的KD表明為弱結(jié)合。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單分子組合物的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物對特定表位呈現(xiàn)出單一的結(jié)合特異性和親和力。該術(shù)語也包括“重組抗體”和“重組單克隆抗體”，因為所有抗體都是通過重組方法制備、表達(dá)、生產(chǎn)或分離的，例如(a)從動物或雜交瘤分離的抗體，所述抗體通過抗體分泌動物細(xì)胞和融合配偶體來制備的；(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體，例如從轉(zhuǎn)染瘤分離；(c)從重組的、組合的人或其他物種的抗體文庫分離的抗體以及(d)用任何其他方法制備、表達(dá)、生產(chǎn)或分離的抗體，所述方法涉及將免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接。如本文所用，“分離的抗體”意指這樣的抗體：基本上不含有其他具有不同抗原特異性的抗體。然而，與人OSM表位、同種型或變體特異性結(jié)合的分離的抗體可對其他相關(guān)抗原，例如來自其他物種的抗原(例如OSM物種同源物)具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施例中，具有不同特異性的“分離的”單克隆抗體組合物被混合在成分明確的組合物中。如本文所用，“特異性結(jié)合”、“免疫特異性結(jié)合”和“免疫特異性地結(jié)合”是指抗體與預(yù)定抗原的結(jié)合。通常，抗體以10-7M或更小的解離常數(shù)(KD)結(jié)合，并且與預(yù)定抗原結(jié)合的KD為其與除預(yù)定抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)結(jié)合的KD的至少1/2。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異的抗體”在本文中可與術(shù)語“與抗原特異性結(jié)合的抗體”互換使用。如本文所用，“高度特異性”結(jié)合是指抗體對特定靶表位的相對KD至少小于該抗體與其他配體結(jié)合的KD的1/10。如本文所用，“類型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgA、IgE、IgM或IgG)。一些抗體種類還涵蓋也由重鏈恒定區(qū)編碼的亞類或“同種型”(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗體可進(jìn)一步被在恒定區(qū)域中的特定殘基處與蛋白質(zhì)連接的寡糖修飾，所述寡糖進(jìn)一步增強(qiáng)抗體的生物功能。例如，在人抗體同種型中，IgG1、IgG3以及現(xiàn)存較少的lgG2呈現(xiàn)出與鼠lgG2a抗體一樣的效應(yīng)子功能。所謂“效應(yīng)子”功能或“效應(yīng)子陽性”是指抗體包含與抗原特異性結(jié)合域有所區(qū)別的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能與受體或其他血液組分，例如補(bǔ)體相互作用，導(dǎo)致例如巨噬細(xì)胞募集，以及引起由抗體的抗原結(jié)合域所結(jié)合的細(xì)胞破壞的事件?？贵w具有通過效應(yīng)分子的結(jié)合而介導(dǎo)的幾種效應(yīng)子功能。例如，補(bǔ)體的C1組分結(jié)合抗體會激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的激活對細(xì)胞病原體的調(diào)理和溶解是重要的。補(bǔ)體的激活會刺激炎癥反應(yīng)，且還可涉及自身免疫性超敏反應(yīng)。另外，抗體通過Fc區(qū)結(jié)合細(xì)胞，即抗體Fc區(qū)上的Fc受體位點結(jié)合細(xì)胞上的Fc受體(FcR)。有許多種對不同類別的抗體有特異性的Fc受體，所述抗體包括IgG(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(α受體)以及IgM(μ受體)。將抗體結(jié)合到細(xì)胞表面上的Fc受體會引發(fā)許多重要的和各式各樣的生物反應(yīng)，包括吞噬和破壞抗體包裹顆粒，清除免疫復(fù)合物，殺傷細(xì)胞裂解抗體包裹的靶細(xì)胞(被稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，或ADCC)，釋放炎癥介質(zhì)，胎盤轉(zhuǎn)移和調(diào)節(jié)免疫球蛋白產(chǎn)生。術(shù)語“多肽”是指包含由肽鍵連接形成多肽的氨基酸殘基的分子。小于50個氨基酸的小多肽可稱為“肽”。多肽也可稱為“蛋白質(zhì)”。綜述本發(fā)明提供能夠結(jié)合并中和OSM蛋白質(zhì)和裂解產(chǎn)物的生物活性的分離的Mab。具體地講，OSM結(jié)合本發(fā)明的mAb能阻斷OSM與gp130結(jié)合或阻止OSM結(jié)合的gp130募集LIFRa或OSMRb。不論哪種情況，本發(fā)明的OSMmAb能夠阻斷OSM驅(qū)動的gp130受體信號傳導(dǎo)。已報道在多種病理環(huán)境下STAT3的磷酸化會導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度產(chǎn)生膠原(Lim等人，Oncogene(《癌基因》)23(39)：5416-25，2006；Huang等人，JCellBiochem(《細(xì)胞生物化學(xué)雜志》)81(1)：102-13，2001)。這些性能展示這些抗體對RA、OA和對纖維化適應(yīng)癥例如特發(fā)性肺纖維化(IPF)和糖尿病性腎病(DN)的潛在治療價值。人OSM基因產(chǎn)物OSM(NCBI登錄號NP_065391)是長度為252個氨基酸的pre-pro-多肽(SEQIDNO：11)，具有長度為25個氨基酸的信號肽和在殘基234和235之間的蛋白水解裂解位點。它是分泌性蛋白，具有在殘基31至152和74至192之間形成兩個內(nèi)部二硫鍵的五個半胱氨酸殘基(KallestadJC等人，JBiolChem.(《生物化學(xué)雜志》)1991年5月15日；266(14)：8940-5)。在殘基100和217處存在兩個潛在的N-連接糖基化位點，并且當(dāng)在真核細(xì)胞中產(chǎn)生時，蛋白質(zhì)是糖基化的。人OSM在殘基105處具有游離巰基。cynoOSM蛋白的序列在公共領(lǐng)域無法得到，但存在衍生自帶注釋的基因序列(NW_001095169)的1867bpmRNA(NCBINo.XM_001110148)的自動計算生成的記錄。為了獲得cynoOSM序列，從cynoPBMC分離RNA，然后通過RT-PCR由該cDNA擴(kuò)增基因并測序。如申請人的共同待審申請(美國序列號12/648430)中所公開，發(fā)現(xiàn)經(jīng)克隆序列(SEQIDNO：12)的預(yù)測翻譯與預(yù)測的恒河猴(Macacamullata)(Rhesus)序列有99.6％相同，與人OSM蛋白序列有92％相同，并且與小鼠OSM蛋白序列有41％相同。因此，本發(fā)明針對能夠抑制由OSM結(jié)合的gp130信號傳導(dǎo)引起的下游生物活性的人源OSM結(jié)合Mab的鑒定，并且其中Mab表現(xiàn)出如下能力：在OSM存在的情況下恢復(fù)細(xì)胞增殖、抑制組織外植體中OSM驅(qū)動的關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié))間基質(zhì)的軟骨細(xì)胞退化、有效地中和人肺成纖維細(xì)胞中OSM依賴性STAT3磷酸化以及阻止OSM誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放。1.本發(fā)明的抗體組合物本發(fā)明的OSM中和抗體是這樣的抗體，其在體外、原位和/或體內(nèi)抑制、阻斷或干擾至少一種OSM活性或OSM受體結(jié)合并且不促進(jìn)、刺激、誘導(dǎo)、或競爭OSM活性或配體結(jié)合，并且抗體結(jié)合不模擬OSM驅(qū)動的OSM受體連接(具體地講是gp130與OSM相互作用)的下游效應(yīng)，例如宿主細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。合適的OSM中和抗體、指定部分或變體也可任選地影響至少一種OSM活性或功能，例如但不限于：RNA、DNA或蛋白合成；蛋白釋放；細(xì)胞激活、增殖或分化；抗體分泌；OSM受體信號傳導(dǎo)；OSM裂解；OSM結(jié)合、OSM或gp130誘導(dǎo)、合成或分泌。本發(fā)明基于能夠抑制OSM結(jié)合或OSM對LIFR的募集之后的gp130信號傳導(dǎo)的抗人OSM單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)。對展示在與pIX外殼蛋白連接的絲狀噬菌體顆粒上的Fab文庫形式的抗體結(jié)合域(參見WO29085462A1并在下文中進(jìn)一步描述)選擇結(jié)合OSM的能力。使用gp130的競爭測定用于區(qū)分那些Fab，所述Fab在與OSM結(jié)合時阻止OSM結(jié)合gp130。作為另外一種選擇，F(xiàn)ab在與OSM結(jié)合時能阻止LIFR募集到gp130結(jié)合。使用基于細(xì)胞(A375，人黑素瘤細(xì)胞)的測定來鑒定多個能夠抑制gp130介導(dǎo)的表達(dá)OSM的宿主細(xì)胞的pSTAT3激活的候選抗體。本文所述的OSM結(jié)合抗體識別活性形式的人OSM蛋白上的至少兩個不同區(qū)，這指示另外發(fā)現(xiàn)OSM上多個適合靶向抗體或其他具有類似阻斷功能的能力的化合物。因此，本文中作為氨基酸序列提供的抗體結(jié)合域的表達(dá)和純化還提供這樣的工具，其提供用于選擇表現(xiàn)出OSM中和活性的新分子的方法。在一個實施例中，抗人OSM抗體具有結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含具有如SEQIDNO：49-55所示的氨基酸序列的輕鏈可變(VL)或重鏈可變(VH)區(qū)，并且所述抗體或其結(jié)合部分免疫特異性地結(jié)合OSM。在本發(fā)明的另一個實施例中，包含具有SEQIDNO：54或55的重鏈，并且其抗原結(jié)合部分結(jié)合OSM蛋白且另外具有本發(fā)明抗體的特定功能性能，例如：1.以小于100pM的KD結(jié)合人OSM2.以小于500pM的KD結(jié)合cynoOSM3.能夠在2ng/ml人OSM存在的情況下將A375-S2細(xì)胞的增殖恢復(fù)不存在OSM的情況下的90％水平，4.能夠在2ng/mlcynoOSM存在的情況下將A375-S2細(xì)胞的增殖恢復(fù)不存在OSM的情況下的90％水平，5.抑制組織外植體中OSM驅(qū)動的關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié))間基質(zhì)的軟骨細(xì)胞退化，6.有效地中和正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)中OSM依賴性STAT3磷酸化，或7.阻斷小鼠中用OSM系統(tǒng)性刺激之后的細(xì)胞因子釋放。在本發(fā)明的另一個方面，如本文所述的表現(xiàn)出以上提及的生物活性的一些或全部的抗體的結(jié)構(gòu)特征，具體地講，定名為M55和M71結(jié)合域的Mab被用于制備結(jié)構(gòu)相關(guān)的人抗OSM抗體，這些抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能性能，例如與OSM結(jié)合。更具體地，M55和M71的一個或多個CDR區(qū)(例如SEQIDNO：1和8的特定殘基)可與已知的人框架區(qū)和CDR例如SEQIDNO：13-28、30-46重組地組合，從而產(chǎn)生本發(fā)明另外的重組工程化的人抗OSM抗體。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體具有如下序列，包括IGVH1-69(SEQIDNO：1)或IGVH5-51(SEQIDNO：3)的FR1、2和/或3，其中來自選自SEQIDNO：13-22的CDR的一個或多個殘基存在于SEQIDNO：1或3的CDR位置，同時仍保留抗體結(jié)合OSM的能力(例如保守替換)。因此，在另一個實施例中，工程化的抗體可由一個或多個CDR組成，所述CDR例如與SEQIDNO：13-22中列出的CDR或如SEQIDNO：29或47給出的L-CDR3的變體有90％、95％、98％或99.5％相同。除了僅結(jié)合OSM，還可對諸如以上所述的那些工程化抗體選擇其對本發(fā)明抗體的其他功能特性的保留，例如抑制OSM蛋白或其裂解產(chǎn)物與GP130陽性細(xì)胞結(jié)合的能力，這種結(jié)合將導(dǎo)致對體內(nèi)GP130陽性細(xì)胞的增殖的抑制。可通過例如標(biāo)準(zhǔn)ELISA測試本發(fā)明的人單克隆抗體與OSM的結(jié)合。2.OSM中和抗體的產(chǎn)生可通過多種技術(shù)產(chǎn)生表現(xiàn)出所需生物活性譜的OSM中和抗體，如本文中以M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71和M83舉例說明的，這些例子包含具有文庫框架SEQIDNO：1、3、8的指定重鏈和輕鏈序列并具有SEQIDNO：13-28、30-46的CDR。在另一個實施例中，由本發(fā)明的抗體結(jié)合的表位，包含SEQIDNO：11的殘基51-227中的最少五個至全部或因此得到的核酸編碼序列，可用來免疫受試者，以便在宿主中直接產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，達(dá)到治療、預(yù)防或緩解與OSM的產(chǎn)生相關(guān)的疾病或疾病癥狀的目的。在一個實施例中并如本文所舉例說明的，人抗體選自噬菌體文庫，其中噬菌體包含人免疫球蛋白基因，并且該文庫將人抗體結(jié)合域表達(dá)為例如單鏈抗體(scFv)，表達(dá)為Fab，或一些其他的呈現(xiàn)配對或不配對的抗體可變區(qū)的構(gòu)造(Vaughan等人，NatureBiotechnology(《自然生物技術(shù)》)14：309-314(1996)；Sheets等人，PITAS(USA)95：6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)，222：581(1991))。本發(fā)明的人單克隆抗體也可用噬菌體展示法制備，以用來篩選人免疫球蛋白基因的文庫。此類用于分離人抗體的噬菌體展示法在本領(lǐng)域是成熟的。參見例如授予Ladner等人的美國專利No.5,223,409；No.5,403,484；和No.5,571,698；授予Dower等人的美國專利No.5,427,908和No.5,580,717；授予McCafferty等人的美國專利No.5,969,108和No.6,172,197；以及授予Griffiths等人的美國專利No.5,885,793；No.6,521,404；No.6,544,731；No.6,555,313；No.6,582,915和No.6,593,081。通過稱為生物淘選(biopanning)的多步驟程序選擇并鑒定噬菌體克隆。生物淘選這樣進(jìn)行：將展示蛋白配體變體的噬菌體(噬菌體展示文庫)與靶標(biāo)孵育，通過洗滌技術(shù)移除未結(jié)合的噬菌體，然后特異性地洗脫結(jié)合的噬菌體。將洗脫的噬菌體任選地擴(kuò)增，然后使其通過附加的結(jié)合和任選擴(kuò)增的循環(huán)，所述擴(kuò)增富集特異序列的庫，這些特異序列有利于那些載有展示與靶標(biāo)的最佳結(jié)合的抗體片段的噬菌體克隆。在若干輪之后，將各個噬菌體克隆進(jìn)行表征，并通過確定噬菌體毒粒的相應(yīng)DNA的序列來確定被克隆展示的肽的序列。Fab噬菌體-pIX文庫在噬菌體展示技術(shù)的具體實施例中，Shi等人，JMolBiol(《分子生物學(xué)雜志》)397：385-396，2010；WO29085462A1和美國序列號12/546850中所述且本文將進(jìn)一步詳述的展示在pIX噬菌體外殼蛋白上的合成Fab文庫，被用于從衍生自人種系基因的人IgG序列的所有組成成分中選擇連接子。對由已知IGV和IGJ種系序列編碼的四個VL和三個VH域構(gòu)建文庫，所述種系序列基于已觀察到的這些序列在從天然來源分離的人抗體中存在的頻率而選.擇。選.擇的VH、IMGT命名為IGHV1-69(SEQIDNO：1)、IGHV3-23(SEQIDNO：2)或IGHV5-51(SEQIDNO：3)。VH設(shè)計的多樣性產(chǎn)生在CDR3區(qū)中具有可變長度的序列的重鏈，其中仍然為恒定長度的H-CDR1和H-CDR2中具有有限多樣性的位置。在文庫的所有成員中，框架4(H-FR4)保持不變(SEQIDNO：4)。VH169，IGHV1-69*01長度＝98，CDR1＝31-35，CDR2＝50-66QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYX1ISWVRQAPGQGLEWMGX2IX3X4X5X6GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQIDNO：1)其中，在169文庫中，X1為A或G，X2為G或W，X3可為I或S，X4可為P或A，X5可為I或Y并且X6可為F或N。VH323，IGHV3-23*01長度＝98，CDR1＝31-35，CDR2＝50-66EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSX1YX2MX3WVRQAPGKGLEWVSX4IX5X6X7GX8STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(SEQIDNO：2)其中，在323文庫中，X1可為S、D、N或T；X2可為A、G或W；X3可為S或H；X4可為V、A、N或G；X5可為S、N、K或W；X6可為Y、S、G或Q；X7可為S或D；并且X8可為S或G。VH551，IGHV5-51*03長度＝98，CDR1＝31-35，CDR2＝50-66EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTX1YWIX2WVRQMPGKGLEWMGX3IX4PX5DSX6TRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR(SEQIDNO：3)其中，在551文庫中，X1可為S、N或T；X2可為S或G；X3可為I或R；X4可為D或Y；X5可為G或S；X6可為D或Y。具有(11個殘基)WGQGTLVTVSS(SEQIDNO：4)的FR4或JH區(qū)已與以上序列連接形成完整重鏈可變區(qū)。靶向用于多樣化的H-CDR1和H-CDR2位置通過以下來確定：1)種系基因的多樣性；和2)在已知結(jié)構(gòu)的抗體-抗原復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的與抗原接觸的頻率(Almagro，JMolRecognit.(《分子識別雜志》)17：132-143，2004)。選擇的位置處的氨基酸多樣性通過以下來確定：1)在種系中的用途；2)在人重排V基因中最常被觀察到的氨基酸；3)預(yù)測將來自單堿基體細(xì)胞突變的氨基酸；和4)有助于抗原識別的氨基酸的生物化學(xué)和生物物理特性。文庫整合VH(H3)的CDR3的多樣性，模擬人抗體的所有組成成分(Shi等人，2010，同上)，如下所示(式I)，其中最終長度介于7和14個殘基之間。在超過5000個人可變區(qū)的CDR3中，氨基酸甘氨酸(G)和丙氨酸(A)經(jīng)常在所有位置中使用。此外，天冬氨酸(D)經(jīng)常在第95位中使用，酪氨酸(Y)經(jīng)常被編碼于在J區(qū)段的規(guī)范區(qū)之前的位置。氨基酸苯丙氨酸(F)、天冬氨酸(D)和酪氨酸(Y)在第99-101位占優(yōu)勢，它們用于IgG的這些位置。由于這些位置通常充當(dāng)H-CDR3的結(jié)構(gòu)支撐且不那么容易被抗原和/或IgG的表面接近，所以固定第99位的氨基酸苯丙氨酸加亮氨酸(50/50比率)、第100位的天冬氨酸以及第101位的酪氨酸。因此，式I的序列插入在SEQIDNO：1、2或3和SEQIDNO：4之間形成完整VH。-(D)-(N)n(N+O)m(F)DY-(I)其中：(D)＝富含Asp(D)和Gly(G)的位置。(N)n＝富含Ala(A)和Gly(G)的位置，n＝3-7。(O)m＝富含Ala(A)、Gly(G)和Y(Tyr)，m＝1-4。(F)＝Phe(F)優(yōu)勢位置。多種形式的文庫涵蓋與也衍生自人種系所有組成成分的固定或多樣化的輕鏈配對。在本發(fā)明中，四個輕鏈文庫VLκ基因(Kawasaki等人，2001.EurJImmunol(《歐洲免疫學(xué)雜志》)31：1017-1028以及Schaeble&Zachau，1993BiolChemHoppeSeyler(《HoppeSeyler生物化學(xué)》)374：1001-1022)為A27(IGKV3-20*01)、B3(IGKV4-1*01)、L6(IGKV3-11*01)和O12(IGKV1-39*01)，其中括號中的基因名稱為推測的相應(yīng)IMGT基因。Fab通過雙順反子載體的表達(dá)展示在pIX上，其中VH-CH1域與外殼蛋白序列融合，并且VL-CLκ或VL-CLλ表達(dá)為與VH-CH1自締合的游離多肽。CDR區(qū)以下劃線表示。基于Vkappa(Vk)種系基因的輕鏈可變文庫012；IGKV1-39*01，IGKV1D-39*01長度＝88；CDR1＝24-34，CDR2＝50-56DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISX1X2X3NWYQQKPGKAPKLLIYX4ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQIDNO：5)L6，IGKV3-11*01長度＝88，CDR1＝24-34，CDR2＝50-56EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVX1X2X3LAWYQQKPGQAPRLLIYX4ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQIDNO：6)A27，IGKV3-20*01，長度＝89，CDR1＝24-35，CDR2＝51-57EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVX1X2X3X4LAWYQQKPGQAPRLLIYX5ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQIDNO：7)B3，DPK24，VKIVKlobeck；IGKV4-1*01長度＝94，CDR1＝24-40，CDR2＝56-62DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLX1SSNNX2NX3LAWYQQKPGQPPKLLIYX4ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQIDNO：8)每個可變區(qū)支架的特定位置處的多樣性匯總于下表1中，其中氨基酸單字母代碼被采用并交替出現(xiàn)在如圖1所示的特定位置處。表1：所有文庫中的VLCDR3具有七個殘基，其中前兩個殘基為谷氨酰胺(Gln，Q)并且對應(yīng)于Kabat殘基95的殘基是脯氨酸(Pro，P)。對于L-CDR3，所述序列符合QQX1X2X3X4PX5T(SEQIDNO：9)，其中變異與下表中一樣，殘基位置根據(jù)Kabat。表2：由于基因間可變序列長度不同，所以可使用如Al-LazikaniB、LeskAM、ChothiaC，1997(Standardconformationsforthecanonicalstructuresofimmunoglobulins.(免疫球蛋白的規(guī)范結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)象)JMolBiol(《分子生物學(xué)雜志》)273：927-948)中所定義的殘基編號將高變環(huán)或CDR中的特定殘基位置的多樣性描述如下。在該體系中，通過對給定殘基指定子位置a、b、c等來適應(yīng)高變環(huán)的長度變化。使用框架4(FR4)區(qū)段例如JK4，F(xiàn)GQGTKVEIK(SEQIDNO：10)來形成完整人輕鏈可變區(qū)。在初始選擇中已顯示Fab對0.2至20nM的多種蛋白靶標(biāo)的親和力。用于改善結(jié)合參數(shù)的綜合成熟過程的方法由改組VL或VH多樣性或任選地定向或有限VL修飾組成，所述方法使用設(shè)計并用于如引用的出版物中所述、如本文中所教導(dǎo)的文庫的載體和引物完成，并且與本領(lǐng)域已知的方法組合。OSM結(jié)合免疫球蛋白域的替代來源可通過多種方法來制備具有本文公開的人Mab的特征的OSM結(jié)合抗體或形成來源于免疫球蛋白域的結(jié)合片段，所述方法包括Kohler和Milstein(1975)Nature(《自然》)256：495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)(雜交瘤方法)。在雜交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合適的宿主動物，例如倉鼠或獼猴，以引起淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能產(chǎn)生將特異性地結(jié)合到用于免疫的蛋白的抗體?；蛘撸蓪⒘馨图?xì)胞在體外免疫。然后用適合的融合劑，例如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice(《單克隆抗體：理論與實踐》)，第59-103頁(AcademicPress，1986))。如本文所述和/或本領(lǐng)域中已知的，還可以通過對能產(chǎn)生全套人抗體的轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠、大鼠、倉鼠、非人靈長類動物等等)進(jìn)行免疫來任選地產(chǎn)生OSM中和抗體。可使用合適的方法，例如本文描述的方法，從這些動物分離產(chǎn)生人抗OSM的抗體的細(xì)胞并使其無限增殖化。作為另外一種選擇，可將抗體編碼序列克隆，導(dǎo)入合適的載體，并用來轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，從而通過本文教導(dǎo)的方法和本領(lǐng)域所知的那些方法表達(dá)和分離抗體。使用在其種系基因結(jié)構(gòu)中載有人免疫球蛋白(Ig)基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠來提供高親和力的完全人單克隆抗體的分離，該抗體針對多種靶標(biāo)，包括正常人免疫系統(tǒng)對其具有耐受性的人自身抗原(Lonberg，N.等人，US5569825、US6300129和1994，Nature(《自然》)368：856-9；Green，L.等人，1994，NatureGenet.(《自然·遺傳學(xué)》)7：13-21；Green，L.&Jakobovits，1998，Exp.Med.(《實驗醫(yī)學(xué)》)188：483-95；Lonberg，N和Huszar，D.，1995，Int.Rev.Immunol.(《國際免疫學(xué)綜述》)13：65-93；Kucherlapati等人，US6713610；Bruggemann，M.等人，1991，Eur.J.Immunol.(《歐洲免疫學(xué)雜志》)21：1323-1326；Fishwild，D.等人，1996，Nat.Biotechnol.(《自然·生物技術(shù)》)14：845-851；Mendez，M.等人，1997，Nat.Genet.(《自然·遺傳學(xué)》)15：146-156；Green，L.，1999，J.Immunol.Methods(《免疫學(xué)方法雜志》)231：11-23；Yang，X.等人，1999，CancerRes.(《癌癥研究》)59：1236-1243；Brüggemann，M.和Taussig，MJ.，Curr.Opin.Biotechnol.(《生物技術(shù)當(dāng)前述評》)8：455-458，1997；Tomizuka等人，WO02043478)。此類小鼠中的內(nèi)源免疫球蛋白基因座可以被破壞或缺失，以消除動物產(chǎn)生由內(nèi)源基因編碼的抗體的能力。此外，諸如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和Medarex(SanJose，Calif.)之類的公司可從事使用如上所述的技術(shù)提供針對所選抗原的人抗體?？墒褂萌魏魏线m的技術(shù)例如重組蛋白制備技術(shù)來制備用作淘選策略中的靶配體和用作免疫原性抗原的多肽。呈純化蛋白或蛋白混合物(包括全細(xì)胞或細(xì)胞提取物或組織提取物)形式的靶配體或其片段，或在免疫的情況下抗原，可在動物體內(nèi)由編碼所述抗原或所述抗原的一部分的核酸從頭形成。本發(fā)明的分離的核酸可用本領(lǐng)域熟知的(a)重組方法、(b)合成技術(shù)、(c)純化技術(shù)或它們的組合進(jìn)行制備。編碼單克隆抗體的DNA易于使用本領(lǐng)域已知的方法來分離和測序，所述已知的方法為例如通過使用能特異性地與編碼人抗體區(qū)的重鏈和輕鏈的基因結(jié)合的寡核苷酸探針。在雜交瘤生成的情況下，此類細(xì)胞可用作此類DNA的來源。作為另外一種選擇，使用其中編碼序列和翻譯產(chǎn)物相關(guān)聯(lián)的展示技術(shù)，例如噬菌體或核糖體展示文庫，簡化了連接子和核酸的選擇。噬菌體選擇后，可分離來自噬菌體的抗體編碼區(qū)，并用來產(chǎn)生完整抗體，包括人抗體或任何其他所需的抗原結(jié)合片段，并且表達(dá)在任何所需的宿主內(nèi)，所述宿主包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌。人抗體本發(fā)明還提供結(jié)合人OSM的人免疫球蛋白(或抗體)。這些抗體也可表征為工程化或適應(yīng)獲得的。所述免疫球蛋白具有基本上來自人種系免疫球蛋白的一個或多個可變區(qū)并且包括已知參與抗原識別的殘基的定向變異，所述殘基例如CDR或結(jié)構(gòu)上限定的高變環(huán)的殘基。一個或多個恒定區(qū)，如果存在，也基本上來自人免疫球蛋白。人抗體對OSM表現(xiàn)出的KD為至少約10-6M(1μM)、約10-7M(100nM)、10-9M(1nM)，或更小。為了影響親和力的改變，例如改善人抗體對OSM的親和力或降低人抗體對OSM的KD，可以對CDR殘基或其他殘基進(jìn)行替換。用于產(chǎn)生結(jié)合OSM的人抗體的來源優(yōu)選為本文提供的序列，這些序列為可變區(qū)、框架和/或CDR，標(biāo)記為SEQIDNO：13-55，使用展示在絲狀噬菌體顆粒上的全套人源Fab鑒定為能夠結(jié)合人OSM并與食蟹猴OSM交叉反應(yīng)。如果人可變域框架采取與CDR從其產(chǎn)生的親本可變框架相同或相似的構(gòu)象，則將CDR中的任何者替換進(jìn)入任何人可變域框架很可能導(dǎo)致保持其正確的空間取向。在最終Mab中將配對的重鏈和輕鏈可變框架區(qū)可以衍生自相同或不同人抗體序列。人抗體序列可為天然存在的人抗體序列，衍生自人種系免疫球蛋白序列，或者可為幾個人抗體和/或種系序列的共有序列。合適的人抗體序列可通過計算機(jī)比較小鼠可變區(qū)的氨基酸序列和已知人抗體的序列來進(jìn)行鑒定。分別進(jìn)行重鏈和輕鏈的比較，但是每種比較的原則是相同的。就實驗方法而言，已發(fā)現(xiàn)它特別便于構(gòu)建可變序列文庫，可以根據(jù)所需的活性、結(jié)合親和力或特異性來對此可變序列文庫進(jìn)行篩選。用于構(gòu)建此類變體文庫的一種形式為噬菌體展示載體。作為另外一種選擇，可使用用于使編碼可變域中靶殘基的核酸序列隨機(jī)化或多樣化的替代已知方法來產(chǎn)生變體。確定是否需要進(jìn)一步取代以及選擇用于取代的氨基酸殘基的另一種方法，可使用計算機(jī)建模來完成。用來產(chǎn)生免疫球蛋白分子三維圖像的計算機(jī)硬件和軟件可廣泛獲得。通常，分子模型的生成起始于免疫球蛋白鏈或其結(jié)構(gòu)域的已解算的結(jié)構(gòu)。將要建模的鏈與已解算的三維結(jié)構(gòu)的鏈或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸序列相似性的比較，并且選擇表現(xiàn)出最高序列相似性的鏈或結(jié)構(gòu)域作為分子模型構(gòu)建的起始點。對已解算的起始結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以允許被建模的免疫球蛋白鏈或結(jié)構(gòu)域中的實際氨基酸與起始結(jié)構(gòu)中的那些實際氨基酸之間的不同。然后將修飾的結(jié)構(gòu)組裝進(jìn)復(fù)合免疫球蛋白中。最后，通過能量最小化以及通過證實所有原子彼此處于合適的距離且鍵長和鍵角在化學(xué)可接受限度內(nèi)來改良模型。由于密碼的簡并性，多種核酸序列將編碼每個免疫球蛋白氨基酸序列。所需的核酸序列可通過固相DNA從頭合成或通過早期制備的所需多核苷酸的變體的PCR誘變來生成。在本申請中描述的所有編碼抗體的核酸明確地包括在本發(fā)明中。如本文所述產(chǎn)生的人抗體的可變區(qū)段通常連接到人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。所述抗體將包含輕鏈和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)通常包含CH1、鉸鏈、CH2、CH3結(jié)構(gòu)域，并且有時還包含CH4結(jié)構(gòu)域。所述人抗體可包含來自任何抗體種類，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和來自任何亞類(同種型)，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的任何類型恒定區(qū)。當(dāng)需要人源化抗體呈現(xiàn)細(xì)胞毒活性時，恒定區(qū)通常為補(bǔ)體結(jié)合性恒定區(qū)，并且種類通常為IgG1。當(dāng)不需要此類細(xì)胞毒活性時，恒定區(qū)可以是IgG2類。人源化抗體可包含來自不止一個種類或同種型的序列。將可任選地與恒定區(qū)連接的編碼人源化輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核酸插入表達(dá)載體中。輕鏈和重鏈可克隆在相同或不同的表達(dá)載體中。將編碼免疫球蛋白鏈的DNA區(qū)段可操作地連接到確保免疫球蛋白多肽表達(dá)的一個或多個表達(dá)載體中的對照序列。此對照序列包括信號序列、啟動子、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列(參見Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(《美國科學(xué)院院刊》)USA86，10029(1989)；WO90/07861；Co等人，J.Immunol.(《免疫學(xué)雜志》)148，1149(1992)，所述文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文中用于所有目的)。3.使用抗OSM的抗體的方法如以下詳細(xì)描述的，本發(fā)明顯示具有M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71和M83的可變域的分離的單克隆抗體結(jié)合OSM上的重疊表位并且展示體外和/或體外OSM抑制活性。重要的是，選擇的MAb的反應(yīng)性包括如下能力：劑量依賴性地阻斷OSM與gp130的相互作用、降低在gp130存在的情況下的OSM信號傳導(dǎo)、降低OSM刺激的A375細(xì)胞增殖、阻止巨噬細(xì)胞刺激的軟骨細(xì)胞膠原生成、或降低體內(nèi)OSM導(dǎo)致的細(xì)胞因子釋放。考慮到本發(fā)明所述的單克隆抗體的特性，抗體或其抗原結(jié)合片段適合作為治療劑和預(yù)防劑來治療或預(yù)防人和動物中OSM相關(guān)的病癥。一般來講，使用將包括將治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，或選擇的具有類似結(jié)合譜和生物活性的抗體或分子施用給敏感受試者或表現(xiàn)出其中已知OSM活性具有病理后果的病癥(例如免疫疾患或腫瘤生長和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移)的受試者。可以施用所述抗體的任何活性形式，包括Fab和F(ab′)2片段。優(yōu)選地，所用抗體與受者物種相容，使得在受試者中對MAb的免疫反應(yīng)不會造成不能接受的短循環(huán)半衰期或引起對MAb的免疫反應(yīng)。施用的MAb可表現(xiàn)出一些輔助功能，例如與受試者的Fc受體結(jié)合和激活A(yù)DCC機(jī)制，以便使用細(xì)胞溶解或細(xì)胞毒機(jī)制排除靶細(xì)胞群，或可將它們進(jìn)行工程化以限制或消除這些輔助功能，從而保留靶細(xì)胞群。個體治療可包括施用治療有效量的本發(fā)明的抗體?？贵w可以如下所述的試劑盒提供?？贵w可以例如相等量的混合物形式使用或施用，或可以單獨地按序提供或一起施用。在向患者提供在受試患者中能結(jié)合OSM的抗體或其片段或能阻斷OSM的抗體時，施用劑的劑量會根據(jù)諸如患者的年齡、體重、身高、性別、一般身體狀況、既往病史等因素而有所不同。在一個相似的方法中，本發(fā)明的單克隆抗體的另一個治療用途為，使用針對本發(fā)明的一個單克隆抗體培育的抗獨特型抗體來主動免疫患者。用模擬表位結(jié)構(gòu)的抗獨特型進(jìn)行免疫可引起主動抗OSM反應(yīng)(Linthicum，D.S.和Farid，N.R.，Anti-idiotypes，Receptors，andMolecularMimicry(抗獨特型、受體和分子模擬)(1988)，第1-5和285-300頁)。同樣，可通過施用作為疫苗組分的一個或多個抗原表位和/或致免疫表位來引起主動免疫?？煽诜蚍悄c道服用一定量的疫苗，該量足夠在預(yù)防性或治療上實現(xiàn)受試者產(chǎn)生對抗此生物功能區(qū)的保護(hù)性抗體?？捎眉兓问降目乖?致免疫肽、肽的片段或肽的修飾形式主動免疫宿主?？蓪⒉粚?yīng)初始蛋白序列的一個或多個氨基酸加入初始肽或截短形式的肽的氨基端或羧基端。此類額外的氨基酸可用于將該肽偶聯(lián)到另一個肽、偶聯(lián)到大載體蛋白或偶聯(lián)到支撐物。可用于這些目的的氨基酸包括：酪氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸以及它們的衍生物。可使用替代的蛋白修飾技術(shù)，例如NH2端乙?；駽OOH端酰胺化，以提供另外的將該肽偶聯(lián)或融合到另一個蛋白或肽分子或支撐物的方法。旨在將能夠阻斷不需要的OSM生物活性的抗體以足夠?qū)崿F(xiàn)減輕、治愈或緩解OSM相關(guān)癥狀或病變的量提供給受試者。如果試劑的劑量、給藥途徑等足以影響此類反應(yīng)，則認(rèn)為該量為“實現(xiàn)”癥狀減輕的足夠量或“治療有效量”?？赏ㄟ^分析受試者的受影響的組織、器官或細(xì)胞，如通過成像技術(shù)、或通過體外分析組織樣品來測定對抗體施用的反應(yīng)。如果試劑的存在導(dǎo)致受試患者的生理出現(xiàn)可檢測的改變，那么該試劑為生理上顯著的。治療應(yīng)用可使用本發(fā)明的OSM中和抗體、其抗原結(jié)合片段或特定變體在細(xì)胞、組織、器官或動物(包括哺乳動物和人)中測量或引發(fā)效應(yīng)，以診斷、監(jiān)測、調(diào)節(jié)、治療、緩解、幫助預(yù)防由OSM或表達(dá)OSM的細(xì)胞介導(dǎo)、影響或調(diào)節(jié)的病癥的發(fā)病率或減輕該病癥的癥狀。因此，本發(fā)明提供了使用至少一種本發(fā)明的OSM抗體調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種OSM相關(guān)疾病的方法，如本領(lǐng)域已知的或如本文所述的。已知在多種涉及炎癥的疾病狀態(tài)中OSM被上調(diào)，并且OSM已牽連多種生物作用，包括骨形成、軟骨退化、膽固醇吸收、疼痛和炎癥。具體適應(yīng)癥在下文討論。適應(yīng)癥本發(fā)明人已證明OSM介導(dǎo)軟骨破壞，并且已顯示OSM導(dǎo)致來自組織外植體的關(guān)節(jié)間基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞退化。OSM也促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，例如TNFα，其能促進(jìn)軟骨釋放膠原，如T.Cawston等人(1998，ArthritisandRheumatism(《關(guān)節(jié)炎與風(fēng)濕病》)，41(10)1760-1771)和以下事實所示，所述事實是：目前舉例為M71結(jié)合域的抗體能夠阻斷系統(tǒng)性細(xì)胞因子釋放。本發(fā)明的抗體M55、M64、M69和M71顯示出如下能力：將巨噬細(xì)胞-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的蛋白聚糖合成增加到不存在OSM特異性抗體的情況下所見水平以上。本發(fā)明人已進(jìn)一步證明，施用本發(fā)明的抗OSM的中和抗體將抑制體內(nèi)OSM驅(qū)動的細(xì)胞因子和趨化因子釋放，例如IL-6、IP-10和KC。IP-10即干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10kDa或可誘導(dǎo)的小細(xì)胞因子B10是在人中由CXCL10基因(C-X-C基序趨化因子10(CXCL10))編碼的蛋白。多種作用已歸因于CXCL10，例如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突細(xì)胞的化學(xué)趨向性以及促進(jìn)T細(xì)胞粘附內(nèi)皮細(xì)胞。KC，現(xiàn)在稱為趨化因子(C-X-C基序)配體1(CXCL1)是屬于CXC趨化因子家族的小細(xì)胞因子，其之前被稱為GRO1癌基因、GROα、中性粒激活蛋白3(NAP-3)和黑素瘤生長刺激活性α(MSGA-α)。在人中，該蛋白由CXCL1基因編碼。CXCL1由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)，并具有中性粒細(xì)胞趨化活性。根據(jù)本發(fā)明，因此提供了使用選自M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71和M83的抗體或抗體片段來制造用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)蛋白聚糖退化疾病例如骨關(guān)節(jié)炎、炎性關(guān)節(jié)病或炎性疾患的藥物。OSM的拮抗劑的一個具體用途是用來制造用于阻止或降低軟骨釋放膠原的藥物。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防炎性關(guān)節(jié)病或炎性疾患的方法，所述方法包括給患有此類疾患的患者施用有效量的阻斷OSM與gp130結(jié)合的此類抗體。本發(fā)明的抗體可用于治療促炎過程的制劑中，在促炎過程中，OSM直接或間接地(例如通過釋放炎性細(xì)胞因子)導(dǎo)致組織或器官尤其是皮膚、肺和關(guān)節(jié)發(fā)病。此類病狀包括骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、神經(jīng)性關(guān)節(jié)病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肩袖撕裂關(guān)節(jié)病、風(fēng)濕熱、賴特爾綜合征、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化、原發(fā)勝膽汁性肝硬化、天皰瘡、類天皰瘡、壞死性血管炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎、肉樣瘤病、肉芽腫病、血管炎、惡性貧血、CNS炎性疾患、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、自身免疫性溶血性貧血、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯病、雷諾綜合癥、腎小球腎炎、皮肌炎、慢性活動性肝炎、乳糜瀉、AIDS的自身免疫性并發(fā)癥、萎縮性胃炎、和阿狄森氏病、內(nèi)毒素血癥或敗血性休克(敗血病)、或敗血病癥狀的一種或多種以及其他類型的急性和慢性炎癥。尤其能從本發(fā)明的方法受益的那些患者是患有由大腸桿菌(E.coli)、乙型流感嗜血桿菌(HaemophilusinfluenzaB)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)、葡萄球菌或肺炎球菌導(dǎo)致的感染的那些患者。具有敗血病風(fēng)險的患者包括遭受燒傷、傷口、腎或肝功能衰竭、創(chuàng)傷、燒傷、免疫功能不全(HIV)、造血瘤、多發(fā)性骨髓瘤、Castleman病或心臟粘液瘤的那些患者。其他與OSM相關(guān)并可接受用本發(fā)明的抗體的治療或預(yù)防療法病癥包括纖維化疾病例如肺纖維化、糖尿病性腎病、特發(fā)性肺纖維化、系統(tǒng)性硬化、以及肝硬化。使用本發(fā)明的抗體治療或預(yù)防的另一種適應(yīng)癥是涉及背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元的傷害性疼痛。施用和給藥本發(fā)明提供優(yōu)選為含水磷酸鹽緩沖鹽水或混合鹽溶液的OSM中和抗體的穩(wěn)定制劑，以及保存溶液和制劑以及適用于藥物和獸用藥用途的多用途保存制劑，所述制劑包含于藥學(xué)上可接受的制劑中的至少一種OSM中和抗體。合適的媒介物及其制劑，包含其他人蛋白如人血清白蛋白在內(nèi)，描述于例如Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(制藥科學(xué)與實踐)，第21版，Troy，D.B.編輯，LipincottWilliams和Wilkins，Philadelphia，PA2006，第5部分，PharmaceuticalManufacturing(《藥物制造》)第691-1092頁，特別參見第958-989頁。在本文所述的穩(wěn)定或保存制劑或溶液中的OSM中和抗體可以根據(jù)本發(fā)明通過多種遞送方法施用給患者，所述遞送方法包括靜脈內(nèi)(I.V.)；肌肉內(nèi)(I.M.)；皮下(S.C.)；經(jīng)皮；經(jīng)肺；透粘膜；使用在植入物、滲透泵、藥筒、微型泵中的制劑；或技術(shù)人員理解、本領(lǐng)域熟知的其他方式。例如，可通過下列位點特異性施用到體室或體腔中：關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、病灶內(nèi)、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮方式。通常，如果施用全身劑量的抗體，希望提供給受者劑量在約1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μg/kg、1μg/kg-100μg/kg、100μg/kg-500μg/kg、500μg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(受者的體重)范圍內(nèi)的劑量，但也可施用較低或較高的劑量。當(dāng)然，本發(fā)明的拮抗劑的合適劑量將根據(jù)諸如待治療的疾病或疾患、給藥途徑和待治療的個體的年齡和體重以及拮抗劑的性質(zhì)等因素而有所不同。雖然不受任何具體劑量的束縛，但據(jù)信例如對于非腸道給藥，0.01至20mg/kg的本發(fā)明的抗體(或其他大分子)的日劑量(通常以如上文所述的藥物組合物的部分存在)可適于治療典型成人。治療可以單劑量療法進(jìn)行，或優(yōu)選地以多劑量療法進(jìn)行，在多劑量療法中，最初治療過程可以為給予1-10次單獨的劑量，接著為了維持和/或增強(qiáng)反應(yīng)，有必要在后續(xù)的時間間隔給予其他劑量，例如在1-4個月時給予第二種劑量，并且如果需要，在幾個月后給予一種或多種后續(xù)的劑量。合適的治療療程的例子包括：(i)0、1個月和6個月，(ii)0、7天和1個月，(iii)0和1個月，(iv)0和6個月，或其他足以引起預(yù)期會減輕疾病癥狀或減輕疾病嚴(yán)重程度的所需反應(yīng)的療程。本發(fā)明的抗體可單獨使用，或與免疫抑制劑例如類固醇(潑尼松等)、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素A或嘌呤類似物(例如甲氨蝶呤、6-巰嘌呤等)、或抗體例如抗-淋巴細(xì)胞抗原抗體、抗-白細(xì)胞抗原抗體、TNF拮抗劑如抗-TNF抗體或TNF抑制劑如可溶性TNF受體、或試劑例如NSAID或其他細(xì)胞因子抑制劑組合使用。序列表本發(fā)明現(xiàn)結(jié)合以下具體的、非限制性實例進(jìn)行描述。實例1：試劑和測定法為了選擇和表征OSM結(jié)合抗體，形成人和CynoOSM的構(gòu)建體以用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)。人OSM(NP_065391，由NM_020530編碼)為252個氨基酸前體，其加工成227個氨基酸的全長分泌性蛋白(SEQIDNO：11)，該分泌性蛋白為前蛋白，其進(jìn)一步加工成更完全活性的成熟形式，即氨基酸1-184。人OSMcDNA從OriGene(Cat.No.SC121421)訂購，將來自O(shè)riGene克隆的人OSM的ORF通過PCR擴(kuò)增，并將信號肽(鼠IgG1)與用于蛋白純化的六-His標(biāo)簽和用于定點蛋白生物素酰化的Avi標(biāo)簽(SEQIDNO：56)一起引入。選擇后者是為了避免存在于與受體相互作用的OSM附近的賴氨酸殘基的隨機(jī)化學(xué)生物素酰化。使用SuperscriptIII第一鏈合成體系(InVitrogen)從cynoPBMC’sRNA克隆食蟹猴OSM以獲得cDNA，然后使用由人OSM序列設(shè)計的UTR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如美國專利申請序列號12/648430中所述。表達(dá)的全長蛋白示于SEQIDNO：12中，其中裂解的活性形式由184個殘基即51-227表示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將人和CynoOSM的前體和成熟形式在HEK293中表達(dá)并純化。使用大腸桿菌來源的市售人OSM(R&DSystems，Cat.No.295-OM)作為對照在A375-S2細(xì)胞增殖和pSTAT信號傳導(dǎo)測定中測試蛋白的功能活性。Mab當(dāng)使用對照抗體時，使用指定CNTO6234的人IgG1同種型抗體?；瘜W(xué)生物素?；褂冒邢蚣?xì)胞因子上的胺殘基的NHS-酯化學(xué)(EZ-連接磺基-NHS-LC-生物素?；噭┖校琍ierce，#21435)將重組人OSM生物素酰化。將生物素偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)化，使靶標(biāo)標(biāo)記效率為每摩爾抗原一摩爾生物素。后者使結(jié)合和功能活性的損失最小化，同時確保蛋白群的近乎完全標(biāo)記。在反應(yīng)完成時，使用包括在EZ-連接磺基-NHS-LC-生物素?；噭┖?Pierce)中的Zeba脫鹽離心柱從游離生物素試劑和殘余離去基團(tuán)中純化蛋白。大約80％的起始材料被回收。使用HABA測定(Pierce生物素定量試劑盒，#28005)來測量生物素結(jié)合水平，該水平表明為每摩爾人OSM大約一摩爾生物素。使用Octet儀器(FortéBIO)來驗證鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)和gp130-Fc(R&DSystems，Cat.No.671-GP)對生物素?；鞍椎慕Y(jié)合。Octet測量結(jié)果顯示生物素酰化的人OSM結(jié)合gp130的特征圖與未標(biāo)記的起始材料的特征圖基本上相同。體外靶向生物素?；?5個殘基的Avi標(biāo)簽(GLNDIFEAQKIEWHE)(SEQIDNO：56)具有與內(nèi)源性BirA底物BCCP類似的生物素-受體動力學(xué)(Beckett等人，1999，ProteinScience(《蛋白科學(xué)》))。當(dāng)與所關(guān)注的蛋白連接時，具有一個受體賴氨酸殘基的Avi標(biāo)簽將僅在一個位置被生物素?；?。使用從Avidity商購的生物素-蛋白連接酶和試劑在體外將重組CynoOSM位點特異性地進(jìn)行生物素酰化。使用一價鏈霉抗生物素蛋白親和樹脂純化生物素酰化的CynoOSM。通過SDS-PAGE和SEC-HPLC評價所得蛋白的質(zhì)量。使用HABA測定(Pierce生物素定量試劑盒，#28005)來測量生物素結(jié)合水平，該水平表明為每摩爾cynoOSM大約一摩爾生物素。使用Octet儀器(FortéBIO)來驗證鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)和gp130-Fc嵌合體對生物素酰化蛋白的結(jié)合。Octet測量結(jié)果顯示生物素酰化的CynoOSM結(jié)合gp130的特征圖與未標(biāo)記的起始材料的特征圖基本上相同。固相免疫測定初始噬菌體-Fab淘選使用以2μg/ml的于TBS中的生物素?；娜薕SM或cynoOSM涂覆的NEUTRAVIDINTMELISA板(Pierce)。在4℃下孵育過夜，封閉和洗滌之后，加入來自每輪淘選的多克隆噬菌體庫的1∶100稀釋液。用對pVIII，即M13噬菌體主要外殼蛋白(GEHealthcare，Cat.No.27-9421-01)特異的HR綴合的單克隆檢測結(jié)合的噬菌體，然后加入化學(xué)發(fā)光底物POD(Roche，Cat.No.11582950001)，并在PerkinElmer儀器上讀數(shù)。使用來自大腸桿菌上清液的分泌性可溶Fab-His蛋白進(jìn)行各個克隆的初步篩選。使用包含可溶Fab-His蛋白的細(xì)菌上清液進(jìn)行ELISA格式中的結(jié)合。將黑色MaxiSorp板(Nunc，Cat.No.437111)用1μg/ml的羊抗人Fd(CH1)抗體(TheBindingSite，Cat.No.PC075)涂覆并在4℃下孵育過夜。在將板洗滌和封閉之后，加入50μl未稀釋的細(xì)菌上清液(包含F(xiàn)ab-His蛋白)并使之在室溫下孵育1小時，同時溫和搖振。將板洗滌，并將生物素酰化的人或CynoOSM(20nM)加入到捕集的Fab中。在室溫下1小時之后，加入SA-HRP(Invitrogen，Cat.No.43-4323)并如上進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。通過計算，用20nM濃度的人OSM進(jìn)行的初步結(jié)合ELISA篩選將允許檢測具有在納摩爾親和力范圍內(nèi)的親和力的克隆。表位分箱(EpitopeBinning)表位分箱是為了基于結(jié)合特征劃分MAb而進(jìn)行的競爭測定法，其使用人IgG1轉(zhuǎn)化的mAb和商業(yè)抗體MAB29進(jìn)行，所述商業(yè)抗體已知為OSMRβ/LIFRα募集阻斷劑(R阻斷劑)。向384孔多陣列板(MesoScaleDiscovery(MSD)，L25XA-4)的每個孔中加入2.5μg/ml的于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.4(Sigma，P3813)中的抗人Fc(JacksonImmuno，709-005-149)。將板在4℃下孵育過夜，然后在室溫下用50μl的MSD阻斷劑A封閉1小時。將384多陣列板洗滌三次(PBSpH7.4，0.05％Tween20(Scytek，PBT010)，并向每個孔中加入1.0μg/ml測試mAb溶液，然后在室溫下在效價板搖動器上以水平6搖振1小時。將板如前洗滌三次。平行地，在單獨的96孔板(COSTAR，3357)中在MSD測定緩沖液(1∶3的封閉緩沖液與PBSpH7.4，0.05％Tween20)將5μg/ml競爭mAb溶液與1μg/ml生物素?；疧SM(R&DSystems，295-OM-010/CF)混合，并在室溫下在效價搖動器上以水平3搖振1小時。將競爭抗體和生物素?；疧SM的前復(fù)合物加入到384多陣列板的每個孔中并在室溫下?lián)u振(在效價板搖動器上以水平6)1小時。然后將板洗滌三次并向每個孔中加入鏈霉抗生物素蛋白磺基標(biāo)簽(streptavidinsulfoTAG)(MSD，R32Ad-S)并在室溫下?lián)u振(在效價板搖動器上以水平6)搖振30分鐘。將板洗滌三次并向每個孔中加入用蒸餾水按1∶4稀釋的讀數(shù)緩沖液T(MSD，R92TC-1)。將板在MSDS6000儀器上讀數(shù)?；谠谏锼仵；疧SM存在且不存在競爭mAb的情況下對測試mAb獲得的信號(最大信號)以及來自自身競爭的信號(最大信號減少2-4倍)來解讀數(shù)據(jù)。當(dāng)在競爭mAb存在的情況下的值在來自自身競爭的值的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)時，指定表位競爭。A375細(xì)胞A375細(xì)胞(ATCC：CRL-1619)為衍生自惡性黑素瘤的人上皮細(xì)胞。將A375-S2細(xì)胞(ATCC：CRL-1872，對IL-1敏感的CRL-1619亞系)在T-175培養(yǎng)瓶(Corning；Cat.No.431080)中培養(yǎng)于補(bǔ)充有10％FBS(Gibco)的完全生長培養(yǎng)基(DMEM/GlutaMax-I，Gibco)中，并在每三至四天大約80％鋪滿時以1∶20傳代培養(yǎng)比率進(jìn)行傳代培養(yǎng)。A375-S2細(xì)胞增殖(BrdU摻入)測定使用化學(xué)發(fā)光ELISA通過BrdU摻入測量由人或食蟹猴OSM造成的A375-S2細(xì)胞增殖的減少。制瘤素M減少A375-S2人黑素瘤細(xì)胞系的增殖(Zarling等人，PNAS83：9739-9743)。該細(xì)胞系用于在抗體發(fā)現(xiàn)的所有階段評價抗-制瘤素M抗體。在37℃下在95％O2-5％CO2中將A375-S2細(xì)胞維持在T-150組織培養(yǎng)瓶(BDFalcon35-5001)中的DMEM(Gibco11995)+10％FBS(Gibco16140)+1％青霉素/鏈霉素(Gibco15140)中并每周按1∶10分離兩次。為了進(jìn)行增殖測定，使細(xì)胞胰蛋白酶化(0.25％，Gibco25200)以將它們從T150瓶中移除，然后以2000細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)于黑色TC涂覆的板(BDFalcon353948)的內(nèi)部48個孔中的200μLDMEM/FBS/青霉素-鏈霉素中。在37℃/95％O2-5％CO2下孵育過夜之后，移除培養(yǎng)基并以180μL的新鮮培養(yǎng)基替代。準(zhǔn)備一個單獨的板，該板包含10X終濃度的所有測試溶液。從該板轉(zhuǎn)移20μL到細(xì)胞板中的對應(yīng)孔中以形成適當(dāng)?shù)膶嶒灄l件。每種實驗條件以一式三份進(jìn)行測試。在任何評價中和的實驗中，將抗體和制瘤素M一起孵育至少1小時，然后加入到細(xì)胞中。然后將板在37℃/95％O2-5％CO2下孵育另外72小時。此時，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光BrdU細(xì)胞增殖ELISA(Roche11669915001)。將BrdU標(biāo)記試劑加入到培養(yǎng)物中并保持4小時。然后移除培養(yǎng)基，并將100μL的固定溶液加入到每個孔中。在室溫下30分鐘之后，移除溶液并加入100μL/孔的抗-BrdU-POD溶液。在室溫下2小時之后，將板用PBS-Tween洗滌并將100μL的SuperSignalPico(ThermoScientific37069)加入到每個孔中。然后使用PerkinElmerVictor3儀器讀取發(fā)光。進(jìn)行初始實驗以確定自身產(chǎn)生的CHO細(xì)胞來源的重組人和食蟹猴制瘤素M抑制增殖的劑量-反應(yīng)。從起始濃度100ng/ml到以1∶5稀釋得到的終濃度0.0244ng/ml測試Osm。相比于用媒介物對照處理的細(xì)胞計算增殖抑制百分比。此實驗的結(jié)果示于圖2A中。隨著人或cyno制瘤素M的濃度增加，BrdU摻入相應(yīng)減少。基于抗增殖活性程度和效應(yīng)的EC50，人和食蟹猴制瘤素M的抗增殖活性是不可區(qū)別的?；谶@些實驗，使用2ng/ml濃度的制瘤素M來評價和比較抗-制瘤素M抗體，因為該濃度將增殖抑制大約80％，從而給出在其中確定抗體劑量反應(yīng)的較大窗口。在2ng/ml的人或cyno制瘤素M存在的情況下評價抗體的完全劑量范圍。此外，在使用最高濃度的抗-制瘤素M抗體時，同種型對照包含在實驗中。測定窗口由未處理的對照孔(最大增殖)和與單獨2ng/ml制瘤素M孵育的孔(最小增殖)之間的差異限定，并且在任何抗體濃度下的中和百分比限定在該窗口內(nèi)。使用A375-S2磷酸-STAT3測定的pSTAT3信號傳導(dǎo)OSM通過結(jié)合細(xì)胞表面受體gp130并誘導(dǎo)受體與OSMRβ異源二聚化以開始細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)級聯(lián)放大來抑制A375-S2細(xì)胞的生長，所述信號傳導(dǎo)級聯(lián)放大包括信號傳導(dǎo)分子STAT3的激活(磷酸化)(Kortylewski等人，Oncogene(《癌基因》)18：3742-3753，1999)。STAT3信號傳導(dǎo)的破壞中止A375-S2細(xì)胞的OSM生長抑制，表明STAT3激活是OSM信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵步驟(Heinrich等人，Biochem.J.(《生物化學(xué)雜志》)374：1-20，2003)。已顯示A375-S2細(xì)胞中的STAT3磷酸化是依賴OSM濃度的并且可利用商業(yè)試劑盒來測量受刺激的細(xì)胞中的STAT3磷酸化。選擇A375-S2細(xì)胞中OSM誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的中和作為Mab候選物的初步篩選測定。對于OSM誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的抗體中和，將A375-S2細(xì)胞以25,000細(xì)胞/孔接種到96孔組織培養(yǎng)板中(Corning；Cat.No.3596)的200μl完全生長培養(yǎng)基中并孵育24小時。將細(xì)胞用包含5ng/ml人OSM(重組的、哺乳動物細(xì)胞來源的OSMN1-1)的溶液處理，該溶液已在室溫下與1∶5連續(xù)稀釋的實驗mAb(從10μg/m起始)孵育3小時。對照包括未處理的細(xì)胞、刺激的細(xì)胞(僅5ng/mlOSM)以及hIgG1同種型對照mAb。除非另外指明，否則所有處理均以一式三份進(jìn)行。按照制造商規(guī)程使用磷酸-STAT3全細(xì)胞裂解液試劑盒(MSD；Cat.No.K150DID-1，LotNo.K0010570)進(jìn)行pSTAT3含量的分析。簡而言之是，將細(xì)胞在200μl/孔體積中處理10分鐘；移除處理溶液并通過多通道移液管加入50μl的細(xì)胞MSD裂解緩沖液。將板在軌道搖動器(300RPM)上放置5分鐘。然后，將每種裂解液轉(zhuǎn)移30l到MSD磷酸-STAT396孔板中。將板密封并在室溫下在軌道搖動器(300RPM)上放置1小時，用150μl的MSD洗滌緩沖液洗滌三次，然后將25μl的第二檢測抗體綴合物(抗-pSTAT3-Ru(bpy)32+)加入到每個孔中，再次密封并在室溫下在軌道搖動器(300RPM)上孵育1小時。將板如前洗滌并將150μl的MSD讀數(shù)緩沖液(三丙胺溶液)加入到每個孔中。將板在MSDSECTORImager6000儀器上讀數(shù)。獲得行內(nèi)成熟的、親本和對照mAb的完全EC50劑量-反應(yīng)曲線并將其繪制成歸一化的百分比pSTAT3信號。通過表面等離子體共振進(jìn)行的親和力測量(Biacore)使用所述的人或CynoOSM構(gòu)建體，用表面等離子體共振(SPR)與Biacore3000光學(xué)生物傳感器(Biacore)測量結(jié)合親和力。生物傳感器表面這樣來制備：使用用于胺偶聯(lián)化學(xué)的制造商說明書將抗小鼠(Jackson，Cat.No.315-005-046)和抗人(Jackson，Cat.No.109-005-098)的抗IgGFc抗體混合物偶聯(lián)到CM-5芯片(Biacore，Cat.No.BR-1000-14)的羧甲基化葡聚糖表面。大約19,000RU(反應(yīng)單位)的抗OSM抗體被固定在四個流通池的每一個中。在25℃下在運行緩沖液(DPBS+0.005％P20+3mMEDTA)中進(jìn)行動力學(xué)實驗。用運行緩沖液制備100nM至0.412nM的連續(xù)稀釋人和CynoOSMECD。約200RU的mAb被捕集在傳感器芯片的流通池2至4上。流通池1用作參考表面。捕集mAb后，以50uL/min注射抗原三分鐘(締合相)，隨后是10分鐘的緩沖液流(解離相)。通過兩個18秒的脈沖以50μl/min注射100mMH3PO4(Sigma，Cat.No.7961)，使芯片表面再生。使用BIAevaluation軟件(Biacore，3.2版)處理收集的數(shù)據(jù)。首先采用如下方式將數(shù)據(jù)減去兩個參照值：從分析物注射得到的曲線中扣除參照值，再從該曲線中扣除緩沖液注射生成的曲線。使用整體擬合的1∶1結(jié)合模型進(jìn)行數(shù)據(jù)的動力學(xué)分析。每個mAb的結(jié)果以Ka(結(jié)合率)、Kd(解離率)和KD(親和常數(shù))的格式記錄。實例2：OSM結(jié)合FAB的選擇從頭Fab-pIX文庫已描述于Shi等人，JMolBiol(《分子生物學(xué)雜志》)397：385-396，2010；WO09085462A1；美國序列號12/546850；并且本文中上述被指定169、323和551，其參考使用的重鏈人種系框架：IMGT命名中的IGHV1-69(SEQIDNO：1)、IGHV3-23(SEQIDNO：2)或IGHV5-51(SEQIDNO：3)。所述三個重鏈文庫框架與如下四個輕鏈文庫VLκ框架組合：A27(IGKV3-20*01(SEQIDNO：5))、B3(IGKV4-1*01(SEQIDNO：6))、L6(IGKV3-11*01(SEQIDNO：7))和O12(IGKV1-39*01(SEQIDNO：8))。在文庫中，通過添加包含重鏈中的SEQIDNO：4和輕鏈中的SEQIDNO：10的J區(qū)(FR4)而使FabV區(qū)完整。重鏈CDR3具有7-14個殘基的可變長度。每個文庫的完整V區(qū)的例子示于圖1中并被編號，并且CDR區(qū)根據(jù)Kabat顯示。初始組的抗OSM噬菌體展示命中使用市售的糖基化人OSM鑒定。按照用于噬菌體選擇的公布方案(Marks和Bradbury，AntibodyEngineering(《抗體工程》)第248卷：161-176，HumanaPress，2004)使用捕集在順磁性鏈霉抗生物素蛋白(SA)珠(Invitrogen，Cat.No.112.05D)上的生物素酰化的人OSM(R&DSystems，Cat.No.295-OM)對Fab-pIX噬菌體展示文庫進(jìn)行淘選。簡而言之，將生物素?；娜薕SM加入到已預(yù)吸附在未綴合的珠上的噬菌體文庫中使最終濃度為100nM并在溫和旋轉(zhuǎn)下孵育1小時。加入封端的SA珠并孵育15分鐘以捕集生物素?；腛SM與結(jié)合的噬菌體。將磁力捕集的噬菌體/抗原/珠復(fù)合物用1ml的TBST洗滌5次并用1mlTBS洗滌1次。在移除最終TBS洗滌液之后，加入1ml的按指數(shù)律生長的TG1細(xì)胞(Stratagene，Cat.No.200123)并在37℃下且不搖振的情況下孵育30分鐘。將經(jīng)感染的細(xì)菌鋪涂在LB/瓊脂(1％葡萄糖/100μg/ml羧芐青霉素)板(Teknova，Cat.No.L5804)上并在37℃下孵育過夜。刮取細(xì)菌菌苔并制備甘油原種[15％甘油/羧芐青霉素(100μg/ml)/2xYT]并在-80℃下保存。為了制備用于第二輪淘選的噬菌體，將25ml的2xYT/羧芐青霉素(100μg/ml)用25μl的細(xì)菌甘油原種接種并在37℃下培養(yǎng)直至OD600為大約0.5。將輔助噬菌體VCSM13(Stratagene，Cat.No.200251)以大約10∶1的感染復(fù)數(shù)加入到培養(yǎng)物中并在37℃下且不搖振的情況下孵育30分鐘。細(xì)菌自旋向下，沉淀物重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(2xYT/羧芐青霉素/卡那霉素/IPTG)中并在30℃下培養(yǎng)過夜。將噬菌體用2％PEG/0.25MNaCl(終濃度)沉淀并重懸于2ml的PBS中。將第一輪噬菌體在4℃下保存并用于進(jìn)行第二輪淘選。淘選參數(shù)為：第1輪，100nM抗原，在室溫下孵育1小時，用TBST洗滌5次然后用TBS洗滌1次；第2輪，10nM抗原，在室溫下孵育1小時，用TBST洗滌10次/用TBS洗滌1次；以及第3輪，1nM抗原，在4℃下孵育16小時(過夜)，用TBST洗滌10次/用TBS洗滌1次。使用ELISA監(jiān)測成功，其中Fab被抗人Fd(CH1)抗體捕集，加入20nM的生物素酰化的人OSM并用SA-HR檢測結(jié)合的OSM。如展示的Fab的三十(30)個獨特的重鏈-輕鏈配對被鑒定，通過ELISA顯示，它們與CynoOSM交叉反應(yīng)。重鏈代表來自169(IGHV1-69衍生的)和551(IGHV5-51衍生的)文庫的序列，并與代表所有四個文庫種系來源(A27、B3、L6和O12)的輕鏈可變區(qū)組合。實例3：osm結(jié)合MAB的表征四螺旋束構(gòu)造的OSM的特征在于由相對松散的環(huán)連接的四個α螺旋區(qū)段，這些螺旋區(qū)段定名為A、B、C和D。OSM通過位于螺旋A和C中的表面(位點II)與gp130相互作用，所述表面經(jīng)確定包括SEQIDNO：1的氨基酸殘基Q16、Q20、G120、N123、N124的接觸(Deller等人，Structure(《結(jié)構(gòu)》)8(8)：863-874，2000；Liu等人，Int.J.Mol.Med.(《國際分子醫(yī)學(xué)雜志》)23：161-172，2009)。據(jù)信，負(fù)責(zé)OSM與OSMRβ和LIFRα相互作用的表面(位點III)主要由位于螺旋D中的殘基限定(Deller等人，同上)。目的是選擇OSM的高親和力連接子，其能夠通過阻止OSM與gp130結(jié)合(位點II或B阻斷劑)或阻止OSM結(jié)合的gp130募集LIFRa或OSMRb(位點III或R阻斷劑)來阻止OSM驅(qū)動的gp130信號傳導(dǎo)。將30個初始選擇的OSM結(jié)合Fab中的29個克隆到用于轉(zhuǎn)化為全長人IgG1Mab的載體中。表征測定為(1)用于鑒定表位簇或“箱”的競爭性結(jié)合，(2)通過表面等離子體共振的親和力測量(Biacore)，以及(3)阻斷pSTAT3信號傳導(dǎo)的能力。已使用如實例1中所述的哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的(糖基化)人和cyno蛋白進(jìn)行所有的篩選和測定。結(jié)果基于pSTAT3和ELISA結(jié)合測定中mAb相對于對照MAB295(R&DSystems)的分級選擇的mAb子集的親和力測量數(shù)據(jù)示于表3中。表3：選擇的抗OSM第一輪mAb子集的親和力。分箱測定的結(jié)果顯示M5、M6和M9彼此競爭但不與MAB295競爭。M10與MAB295競爭。通過pSTAT3測定，這四個mAb也顯示為gp130信號傳導(dǎo)的功能中和劑。因此，得出如下結(jié)論：M10為R阻斷劑，M5、M6和M9阻斷OSM與gp130的結(jié)合(B阻斷劑)。治療先導(dǎo)物的靶標(biāo)親和力由明確地競爭OSM-gp130相互作用的需要決定，OSM-gp130相互作用的親和力(KD)已測量為大約1nM。因此，期望對OSM的靶標(biāo)親和力為100pM或更低KD。發(fā)現(xiàn)為OSM-gp130相互作用阻斷劑的中和MAbM5、M6和M9，加上M10被選擇用于內(nèi)聯(lián)成熟，以便產(chǎn)生滿足治療候選物的100pM親和力要求的衍生物。附加的所需特性是，mAb以在對人OSM的親和力的五倍內(nèi)的親和力結(jié)合食蟹猴OSM(KD為500pM或更低)。發(fā)現(xiàn)這四個Mab的結(jié)合域的組成代表經(jīng)定名的四個獨特的重鏈和輕鏈對，如表4中所示。表4：MabHC文庫HCIDLCIDM10169H2L2M6551H14L12M9551H17IGKV4-1(B3)M5551H135L111完整可變區(qū)序列包含用于形成本文上述噬菌體文庫的種系序列，因此，固定的殘基匹配未突變的親本種系殘基。就這一點而言，每個V區(qū)由定名為SEQIDNO：1-3或5-8的支架內(nèi)的指定CDR1和CDR2；接著CDR3(表3和4)以及分別是輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(表5LC和表6HC)接著J區(qū)組成，重鏈的J區(qū)為SEQIDNO：4，輕鏈的J區(qū)為SEQIDNO：10。表5：HC可變區(qū)H2包含衍生自SEQIDNO：1的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3，其中X1＝A，X2＝G，X3＝I，X4＝P，X5＝I，并且X6＝F，其中H-CDR2中有附加突變。來自文庫551的HC(H14、H17和H135)包含衍生自SEQIDNO：3的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3，其中X1＝S，X2＝S或G，X3＝I，X4＝Y(jié)，X5＝G并且X6＝Y(jié)或D。四個HC中的每一個由獨特的CDR3(SEQIDNO：19-22)組成。表6：選擇的Fab的LC可變區(qū)均衍生自B3文庫并且包括在IMGT數(shù)據(jù)庫中表示為IGKV4-1(B3)的種系序列，IGKV4-1(B3)被用作文庫多樣化的起始序列，如本文和引用的出版物所述。四個輕鏈中的三個在CDR1中有差異并具有相同的H-CDR2。四個選擇的LC可變FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的共有序列衍生自SEQIDNO：8，其中X1為Y、S或A；X2為K、E或N；X3為Y、W或F；并且X4總是為W。鑒定了兩個獨特的CDR3序列。L-CDR3可由共有序列(SEQIDNO：29)表示，該共有序列由式Q-Q-(S，Y)-(F，Y)-S-(F，T)-PLT表示。實例4：親和力重新選擇實例3中描述的四個V區(qū)配對即OSMM5、OSMM6、OSMM9和OSMM10被選擇用于輕鏈重新選擇以改善親和力。為了以一種有效且迅速的方式使來自初步選擇的大量抗體親和力成熟，使用描述于Shi等人，JMolBiol(《分子生物學(xué)雜志》)397：385-396，2010和WO09085462A1以及美國序列號12/546850中的“內(nèi)聯(lián)”成熟方法。簡而言之，將在起始幾輪的選擇中獲得的抗原特異性克隆的VH區(qū)與對應(yīng)VL支架的文庫組合，在這種情況下為基于B3的V區(qū)(SEQIDNO：8)。形成三個新的文庫，一個使用用于初步選擇中的VL文庫作為多種VL鏈的來源，而另外兩個文庫基于已知結(jié)構(gòu)的抗原-抗體復(fù)合物的近期分析而設(shè)計(Raghuanthan等人，J.Mol.Recognit(《分子識別雜志》)，2010)?；谧羁赡軈⑴c靶標(biāo)蛋白的結(jié)合(也稱為特異性決定殘基用途(SDRU))的那些殘基來選擇用于多樣化的殘基。在Vκ輕鏈中，這已被確定為以Chothia和Lesk所定義的高變環(huán)為中心的三個接觸區(qū)，它們根據(jù)靶標(biāo)是蛋白、肽或小半抗原而稍有不同。表5示出用于親和力成熟的VL文庫，其中B3是與發(fā)現(xiàn)階段期間所用相同的文庫，文庫2“聚焦SDRM的(SDRMfocused)”基于SDRU殘基并聚焦多樣性，而NNK為隨機(jī)化文庫。在該表中，“X”意指由NNK混合形成的任何氨基酸加上一個終止密碼子。表7匯總了文庫1、2和3中的多樣性。在分析最終文庫期間，鑒定了一些氨基酸，這些氨基酸不是初始設(shè)計的部分，因此是由于合成方法而引入。對于文庫2，使用二核苷酸進(jìn)行合成，這些氨基酸為：S(位置30c)、T(位置30d)、EK(位置30f)、IW(位置32)、TV(位置50)、I(位置92)、D(位置93)、以及F(位置96)。表7：由第三輪淘選輸出制備Fab-His蛋白，并且采用單克隆Fab-HisELISA來鑒定具有比對應(yīng)親本Fab高的結(jié)合信號的各個命中。在這些分級ELISA中使用兩個濃度的生物素酰化的人抗原：2nM和0.2nM。將每個親本克隆的結(jié)合信號設(shè)定為100％。存在22個來自M6和M9的親和力成熟的命中，當(dāng)與包含初始重鏈和輕鏈V區(qū)的親本Fab相比時顯示出提高高達(dá)9倍(900％)的結(jié)合。重鏈和輕鏈的這些新配對中的一些被選擇用于進(jìn)一步評價。與MAB295對照和親本mAbM6和M9的親和力相比的人和食蟹猴OSM的內(nèi)聯(lián)成熟mAb的親和力(KD)匯總于表8中，并且那些mAb的CDR組成示于表9中。在一些情況下，LCV與H14和H17均配對?；谒鼈兊纳镂锢硖匦院凸δ苄苤付楹蜻x治療先導(dǎo)物的某些mAb以灰色突出顯示。表8：表9：較高親和力Mab的LC-CDR表選擇的候選物中的LC-CDR3多樣性Q-Q-(S，Y)-(F，Y)-S-(F，T)-PLT(SEQIDNO：29)被降低，并且重新選擇的高親和力LC-CDR3的共有序列表示為QQY-(F，Y)-STP-(L，I)-T(SEQIDNO：47)。對于重新選擇的mAb，H14和H17的VH都具有共同的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3，其由SEQIDNO：48給出并包含SEQIDNO：14(CDR1)和SEQIDNO：17(CDR2)。降低人和CynoA375-S2細(xì)胞增殖的能力為了評價內(nèi)聯(lián)成熟的抗體，進(jìn)行劑量-反應(yīng)，以5μg/ml或1μg/ml起始，并以1∶5稀釋分別降低至0.0016或0.00032μg/ml。M71導(dǎo)致的中和示于圖2B中。隨著抗體濃度增加，人和食蟹猴制瘤素M兩者的抗增殖效應(yīng)被中和。使用來自用人(開放符號)和食蟹猴(閉合符號)制瘤素M進(jìn)行的三個單獨實驗的數(shù)據(jù)計算劑量-反應(yīng)曲線。表10匯總了M55、M64、M69和M71抗人和食蟹猴制瘤素M的IC50(95％置信區(qū)間)。表10：人gp130競爭使用如實例1中所述的表面等離子體共振(SPR)與Biacore3000光學(xué)生物傳感器(Biacore)在選擇用于內(nèi)聯(lián)成熟的抗OSMmAb加上來自上表的選擇的新連接子和人gp130之間進(jìn)行競爭實驗。通過按照制造商說明書將每種測試mAb偶聯(lián)到CM-5芯片(Biacore，Cat#BR-1000-14)的羧甲基化葡聚糖表面來制備生物傳感器表面。每種測試mAb大約4,000-15,000RU(反應(yīng)單位)被固定在儀器的四個流通池的每一個中。在25℃下在運行緩沖液(DPBS+0.005％P20+3mMEDTA)中進(jìn)行競爭實驗。將人OSM(自身OSMN1-1)用運行緩沖液稀釋至30nM并以3μl/min在具有固定的mAb的每一個流通池上注射3分鐘。捕集人OSM后，注射300nM的競爭mAb或人gp130-Fc(締合相)三分鐘，隨后是注射緩沖液流(解離相)3分鐘。通過兩個12秒的脈沖以50μL/min注射100mMH3PO4(Sigma，Cat#7961)，使芯片表面再生。使用BIAevaluation軟件3.2版(Biacore)處理收集的數(shù)據(jù)。首先，在注射人OSM時將傳感圖對齊。然后記錄人OSM、競爭mAb或gp130-Fc的結(jié)合水平(RU)。當(dāng)將競爭mAb或gp130-Fc注射在OSM表面上時結(jié)合水平(RU)上升，則表明與固定的測試mAb不存在競爭，反之亦然。流通池(Fc1等)固定的mAb沿著表10的橫向樣品行出現(xiàn)。M2之前顯示與商業(yè)抗體MAB295競爭，已知MAB295不與結(jié)合OSM的gp130競爭。競爭結(jié)合測定的結(jié)果顯示，M54、M55、M64、M69和M71與人gp130-Fc競爭OSM抗原(表11)。表11：人gp130競爭成熟的候選先導(dǎo)物mAb。在A375細(xì)胞中阻斷pSTAT3的能力在存在或不存在5ng/mlhOSM的情況下，在A375細(xì)胞中進(jìn)行M6和M9以及這些Mab的內(nèi)聯(lián)成熟的變體對pSTAT3的抑制，所計算的EC50值示于表12中。表12：pSTAT3抑制mAbIDEC50(ng/ml)95％置信區(qū)間曲線擬合R2M6529.524.35至35.820.9921M6737.730.93至45.920.9905M4550.042.45至58.910.9931M8371.259.59至85.050.9908MAB29572.146.91至110.70.9848M5478.566.11.至93.230.9930M6388.258.55至132.90.9819M6497.177.01至122.40.9902M68126.9107.2至150.10.9924M69141.7115.1至174.50.9914M66152.7111.1至209.80.9833M71159.6128.3至198.50.9885M55181.6153.0至215.60.9869M42191.393.67至390.70.9607M62233.5206.4至264.10.9947M53236.6196.3至285.20.9859M6650.3241.7至17500.9540M91218.0352.8至42080.9614M85-0.4454IL13-0.3438實例5：生物活性巨噬細(xì)胞-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)測定在巨噬細(xì)胞-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中評價M71。已知分化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生制瘤素M(Hasegawa等人，Rheumatology(《風(fēng)濕病學(xué)》)38：612-617，1999)。OSM可降低構(gòu)成軟骨基質(zhì)的重要部分的高度硫酸化蛋白聚糖類多聚糖白聚糖(GAG)的合成。.使用重組HEK產(chǎn)生的His-Avi標(biāo)記的人和食蟹猴制瘤素M來發(fā)現(xiàn)抗人制瘤素M抗體，并且使用這些分子以及來自R&D體系(295-OM)的細(xì)菌來源的重組人制瘤素M來評價這些抗體的活性。這些都與原生內(nèi)源性人制瘤素M不相同，是因為his-avi標(biāo)簽(HEK產(chǎn)生的Osm)或缺少糖基化(細(xì)菌重組Osm)。已知巨噬細(xì)胞分泌制瘤素M(Grove等人，JLipidRes(《脂質(zhì)研究雜志》)32：1889-97，1991)并且制瘤素M降低人軟骨細(xì)胞中的蛋白聚糖合成(Sanchez等人，OAandCart.(《骨關(guān)節(jié)炎與軟骨》)12：810-10，2004)。因此，使用巨噬細(xì)胞-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系來確定抗人制瘤素M抗體中和內(nèi)源性或原生人制瘤素M的能力。簡而言之，將包含40,000個正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的單一藻酸鹽珠在分化的人巨噬細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)72小時。這些實驗在劑量范圍的抗制瘤素M抗體存在的情況下進(jìn)行。在實驗結(jié)束時，通過摻入放射性355O4來測量蛋白聚糖合成。從所有細(xì)胞中獲得CD14+外周血單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞以2.5×105細(xì)胞/孔培養(yǎng)在48孔板上的0.5ml巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI+具有10％熱滅活的FBS、1％NEAA和1％青霉素-鏈霉素的谷氨酰胺)中。將細(xì)胞用100ng/ml的巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(M-CSF)處理。48小時之后，置換培養(yǎng)基以移除非貼壁細(xì)胞。在第6天時，將含有M-CSF的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基的用不含M-CSF的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基置換。在第8天時，將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基(50％Ham’sF-具有10％胎牛血清的12/50％DMEM)置換并將單一藻酸鹽珠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物(ArticularEngineering#CDD-H-2200)加入到每個孔中。保留等分試樣的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基并在-80℃下保存，以用于使用R&D體系人制瘤素MDuoSet(DY295)分析制瘤素M水平。將藻酸鹽珠-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)物在20μg/ml的抗人制瘤素M抗體(M64，M71，M55，M69)存在的情況下或在劑量范圍(5μg/ml至0.00076μg/ml；1∶3稀釋)的抗體(M71andM55)存在的情況下維持。此外，人IgG1同種型對照(CNTO6234)以測試的抗制瘤素M抗體的最高濃度包含在板上。其他對照是僅軟骨細(xì)胞(沒有共培養(yǎng))以及在2ng/ml人制瘤素M存在的情況下的軟骨細(xì)胞。此外，維持僅包含巨噬細(xì)胞的孔以便測量制瘤素M產(chǎn)生。在共培養(yǎng)72小時之后，將10μCi/ml放射性35SO4(Perkin-ElmerNEX041H002MC)加入到每個孔中并保持另外20小時。使用CPC沉淀技術(shù)(MPBIomedicals(#190177)測量35SO4的摻入。在與35SO4孵育20小時之后，移除經(jīng)標(biāo)記的培養(yǎng)基并將每個珠用含Ca和Mg的DPBS洗滌兩次。在第二次洗滌之后，將200μl的檸檬酸鹽緩沖液(150mMNaCl，55mM檸檬酸鈉，ph6.8)加入到每個珠。將板在37℃下孵育10至15分鐘直至柱被溶解。將來自每個孔的100μl等分試樣轉(zhuǎn)移到用1％CPC預(yù)濕的Millipore多層篩96孔濾板，然后將10μl的10％CPC加入到每個孔中并保持5分鐘。然后對板抽真空直至過濾器干燥。然后將每個孔用200μl的1％CPC洗滌2次，每次均抽真空直至過濾器干燥。然后將塑性底部從板移除并用密封物(PerkinElmer#6005185)置換。將閃爍液(50μl，PerkinElmer#6013621)加入到每個孔中并將板密封物施加到板的頂部。然后在頂部計數(shù)讀出器(TopCountreader)上對板計數(shù)。在20μg/ml時，M64、M71、M55和M69將蛋白聚糖合成增加至在不存在抗體的情況下觀察到的水平以上，而同種型對照無效果(圖3)。在單獨的實驗中，M71以劑量依賴的方式將蛋白聚糖合成增加至單獨軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出的水平(定義為100％中和)，EC50為30ng/ml，而同種型對照無效果。這些數(shù)據(jù)顯示，巨噬細(xì)胞來源的Osm降低共培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中的蛋白聚糖合成，并且抗人制瘤素M抗體中和原生制瘤素M。人肺成纖維細(xì)胞磷酸-STAT3測定OSM誘導(dǎo)正常人肺成纖維細(xì)胞的增殖和膠原產(chǎn)生(Scaffidi等人，Br.J.Pharmacol(《英國藥理學(xué)雜志》)136：793-801，2002)。成纖維細(xì)胞過度產(chǎn)生膠原是多種病理病癥的關(guān)鍵特征(Lim等人，Oncogene(《癌基因》)23(39)：5416-25，2006；Huang等人，JCellBiochem(《細(xì)胞生物化學(xué)雜志》)81(1)：102-13，2001)。制瘤素M受體信號傳導(dǎo)激活JAK-STAT通路，并且STAT3的磷酸化是信號傳導(dǎo)通路中的早期事件(Auguste等人(1997)SignalingofTypeIIOncostatinMReceptor(II型制瘤素M受體的信號傳導(dǎo))JBiolChem(《生物化學(xué)雜志》)272：15760-15764)。使用R&D體系人/小鼠pSTAT3Duoset(DYC4607-5)在正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)中確定制瘤素M產(chǎn)生pSTAT3的能力。然后使用該測定來確定M55和M71中和制瘤素M信號傳導(dǎo)的能力。使用在Lonza專有的FGM-2(CC-3132)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的來自Lonza的NHLF(CC-2512)進(jìn)行這些實驗。簡而言之，將細(xì)胞以25,000細(xì)胞/孔接種在板上的FGM-2中并培養(yǎng)24小時。然后將細(xì)胞用制瘤素M或抗體加上制瘤素M處理10分鐘。為了避免在該10分鐘孵育期間的溫度依賴效應(yīng)，將用于準(zhǔn)備處理物的所有溶液在37℃下預(yù)熱并維持。在10分鐘處理之后，吸掉培養(yǎng)基并用完全裂解緩沖液置換。裂解緩沖液(pH＝7.2)由1％NP-40、1％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS、0.15MNaCl和0.01M磷酸鈉組成，并在4℃下保存。使用時，完全裂解緩沖液這樣來制備：將1片蛋白酶抑制劑混合物(Roche，11836153001)和110μLHALT磷酸酶抑制劑(ThermoScientific78420)加入到11ml的裂解緩沖液中。在10分鐘裂解步驟之后，所得的裂解液準(zhǔn)備用于pSTAT3檢測。為了確定制瘤素M劑量-反應(yīng)，將NHLF細(xì)胞用劑量范圍的OSM(100ng/ml至0.024ng/mlw/1∶4稀釋，一式三孔)處理。用預(yù)熱的PBS+1％BSA準(zhǔn)備稀釋板，其中每個孔中Osm的濃度比處理需要的終濃度高10X，并包括僅有培養(yǎng)基的孔作為未處理的對照。將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板完全移除并用180μl的預(yù)熱FGM-2置換。將計時器開啟10分鐘，然后從稀釋板中的每個孔轉(zhuǎn)移20μl到培養(yǎng)板中的對應(yīng)孔中。10分鐘之后，通過抽吸完全移除細(xì)胞板中的處理溶液并用100μl的完全裂解緩沖液置換。為了最小化孵育時間的差異，將裂解緩沖液以與處理相同的順序加入到孔中。然后將測定板在搖動器上放置10分鐘。搖振之后，將裂解液在-80℃下冷凍用于以后測試或直接轉(zhuǎn)移到涂覆有抗pSTAT3的ELISA板中。根據(jù)制造商說明書進(jìn)行ELISA(R&D體系人/小鼠pSTAT3Duoset)，不同的是1)僅將90μl的裂解液或標(biāo)準(zhǔn)物加入到每個孔中和2)SuperSignalPico(ThermoScientific37069)用作HR底物。在Victor3讀板儀上對ELISA板讀取發(fā)光。為了評價M55和M71在NHLF中和OSM信號傳導(dǎo)的能力，在2ng/ml人OSM存在的情況下將細(xì)胞用劑量范圍的抗OSM抗體(一式三孔，500ng/ml至0.005ng/ml，以1-10稀釋或50ng/ml至1.563ng/ml，以1∶2稀釋)處理。用PBS準(zhǔn)備稀釋板以用于20X終濃度的抗體劑量-反應(yīng)處理，包括用于同種型對照(抗OSM抗體的最高濃度)的孔，而且未處理的對照和僅用OSM處理的細(xì)胞均不含抗體。單獨用FGM-2以40ng/ml(20X終濃度)制備人制瘤素M。在稀釋板中將20X抗體和OSM溶液按等體積混合以形成10X處理溶液，并將板在37℃下孵育1小時以允許OSM與抗體結(jié)合。1小時之后，將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板移除并用180μl的預(yù)熱FGM-2置換。將計時器開啟10分鐘，并從稀釋板中的每個孔轉(zhuǎn)移20μl到培養(yǎng)板中的對應(yīng)孔中。10分鐘之后，通過抽吸完全移除細(xì)胞板中的溶液并用100μl的完全裂解緩沖液置換。為了最小化孵育時間的差異，將裂解緩沖液以與處理相同的順序加入到孔中。然后將測定板在搖動器上放置10分鐘。搖振之后，將裂解液在-80℃下冷凍用于以后測試或直接轉(zhuǎn)移到涂覆有抗pSTAT3的ELISA板中。根據(jù)制造商說明書進(jìn)行ELISA(R&D體系人/小鼠pSTAT3Duoset)，不同的是1)僅將90μl的裂解液或標(biāo)準(zhǔn)物加入到每個孔中和2)SuperSignalPico(ThermoScientific37069)用作HR底物。在Victor3讀板儀上對ELISA板讀取發(fā)光。人制瘤素M增加NHLF細(xì)胞中的pSTAT3，其中EC50為大約1ng/ml。制瘤素M劑量反應(yīng)的實例提供于圖4A中。對于該實例，EC50為0.90ng/ml，且95％置信區(qū)間為0.70至1.17ng/ml?？怪屏鏊豈抗體的中和能力在2ng/ml的制瘤素M存在的情況下確定，并且所有數(shù)據(jù)歸一化成在2ng/mlOSM存在且不存在抗體的情況下的發(fā)光。圖4B示出M71對OSM誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的劑量依賴性中和。隨著M71的濃度增加，STAT3磷酸化程度降低。由來自六個單獨實驗的數(shù)據(jù)計算劑量-反應(yīng)曲線，并且對M71計算的IC50為8.9ng/ml，95％置信區(qū)間為6.9至11.6ng/ml。實例6：體內(nèi)活性在全身施用人制瘤素M之后，對M71評價其阻斷體內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。腹膜內(nèi)注射人制瘤素M增加某些血清細(xì)胞因子的水平，推測是通過與鼠白血病抑制因子受體相互作用。給小鼠全身(i.p.)施用人制瘤素M發(fā)展為用于評價抗制瘤素M單克隆抗體在體內(nèi)環(huán)境下的中和能力的模型。給小鼠i.p.注射于200μl的PBS中的10μg人制瘤素M或PBS媒介物對照。1小時之后，用CO2使小鼠麻醉并通過末端心臟穿刺收集血液。使各個血液樣品在冰上凝結(jié)20分鐘，然后以3500rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘。將血清樣品冷凍保存，直至按照制造商說明書用Milliplex鼠MAP細(xì)胞因子/趨化因子多路復(fù)用(32)面板進(jìn)行分析。樣品分析顯示，相比于媒介物對照，人制瘤素M顯著增加鼠KC、IP-10、MCP-1、IL-6和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的血清水平，對面板中的其他細(xì)胞因子無影響。這些數(shù)據(jù)顯示，注射人制瘤素M誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放，推測是通過與鼠白血病抑制因子受體相互作用(Richards等人，JImmunol.(《免疫學(xué)雜志》)159：2431-37，1997；Lindberg等人，MolCellBiol(《分子細(xì)胞生物學(xué)》)18：3357-3367，1988)，所述受體可用于測試抗制瘤素M抗體的體內(nèi)中和能力。在小鼠全身施用模型中評價M71和M55。簡而言之，對小鼠皮下給藥M71或M55(20、2.0或0.2mg/kg的人IgG1抗人Osm)、CNTO6234(huIgG1同種型對照，20mg/kg)或體積為10μl/g的PBS。24小時之后，然后給每只小鼠i.p.注射10μg的于PBS(SigmaD8357)中的自身產(chǎn)生的CHO細(xì)胞來源的重組人制瘤素Mw/0.1％小鼠血清白蛋白(SigmaA3559)或單獨PBS-MSA媒介物對照(200μL總體積)。1小時之后，用CO2使小鼠麻醉并通過末端心臟穿刺收集血液。使各個血液樣品在冰上凝結(jié)20分鐘，然后以3500rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘。將血清樣品冷凍保存，直至使用Milliplex鼠MAP細(xì)胞因子/趨化因子多路復(fù)用(32)面板進(jìn)行分析。按照制造商說明書分析血清樣品。人制瘤素M誘導(dǎo)通過試劑盒檢測的細(xì)胞因子中的如下五種的血清水平顯著(非配對學(xué)生t檢驗)增加：嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-6、IP-10、KC和MCP-1。以20mg/kg預(yù)先給藥同種型對照CNTO6234對制瘤素M誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放沒有影響。然而，預(yù)先給藥M71顯著降低IP-10、MCP-1、IL-6和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(以2.0和20mg/kg給藥)以及KC(以20mg/kg給藥)的血清水平。0.2mg/kg的M71對任何細(xì)胞因子均沒有影響。M71和同種型對照對IP-10和MCP-1的影響分別示于圖5A和B中。觀察到M55具有不那么穩(wěn)健的中和作用，因為20和2.0mg/kg的中和作用僅見于IP-10。用20mg/kgM55時，IL-6、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和MCP-1的血清水平降低，而用任何劑量的M55均未見KC水平降低。這些數(shù)據(jù)顯示了抗制瘤素M抗體中和鼠全身施用模型中外源人制瘤素M的生物效應(yīng)的能力。IP-10即干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10kDa或可誘導(dǎo)的小細(xì)胞因子B10是在人中由CXCL10基因(C-X-C基序趨化因子10(CXCL10))編碼的蛋白。多種作用已歸因于CXCL10，例如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突細(xì)胞的化學(xué)趨向性以及促進(jìn)T細(xì)胞粘附內(nèi)皮細(xì)胞。KC，現(xiàn)在稱為趨化因子(C-X-C基序)配體1(CXCL1)是屬于CXC趨化因子家族的小細(xì)胞因子，其之前被稱為GRO1癌基因、GROα、中性粒激活蛋白3(NAP-3)和黑素瘤生長刺激活性α(MSGA-α)。在人中，該蛋白由CXCL1基因編碼。CXCL1由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)，并具有中性粒細(xì)胞趨化活性。實例7：共結(jié)晶學(xué)將包含V區(qū)H17(SEQIDNO：51)和L180(SEQIDNO：55)的Fab片段與人OSM(SEQIDNO：10)殘基26-212結(jié)晶。OSM與gp130細(xì)胞因子家族的其他成員共有其四螺旋束三維結(jié)構(gòu)。四螺旋束構(gòu)造的特征在于由相對松散的環(huán)連接的四個α螺旋區(qū)段，這些螺旋區(qū)段定名為A(殘基10-37)、B(殘基67-90)、C(殘基105-131)和D(殘基159-185)。OSM通過稱為位點II的表位與gp130相互作用，位點II包括位于螺旋A和C中的氨基酸殘基(Q16，Q20，G120，N123，N124)(Deller等人，Structure(《結(jié)構(gòu)》)8(8)：863-874，2000；Liu等人，Int.J.Mol.Med.(《國際分子醫(yī)學(xué)雜志》)23：161-172，2009)。據(jù)信，位點III即負(fù)責(zé)OSM與OSMRβ和LIFRα相互作用的表位，主要由位于螺旋D中的殘基限定(Deller等人，Structure(《結(jié)構(gòu)》)8(8)：863-874，2000)。結(jié)晶在20℃下通過沉滴蒸氣擴(kuò)散方法進(jìn)行復(fù)合物的結(jié)晶，使用Oryx4蛋白結(jié)晶機(jī)械手(DouglasInstruments)，分配等體積的0.2μL蛋白復(fù)合物(10.95mg/mL)和0.2μL儲備溶液。進(jìn)行多重結(jié)晶篩選。大部分的液滴保持澄清，反映出復(fù)合物的高溶解度。從0.1MMESpH6.5，2.4M硫酸銨和0.1MTrispH8.5，3.5M甲酸鈉獲得晶體。晶體結(jié)構(gòu)溶液的結(jié)果與H14/L180Fab接觸的OSM殘基構(gòu)成結(jié)合表位。與OSM接觸的抗體殘基構(gòu)成結(jié)合互補(bǔ)位。兩個可變域的所有六個CDR參與OSM結(jié)合。接觸的殘基在表13中給出并示于圖5中。長CDR-L1連同重鏈可變區(qū)H1的CDR形成山谷狀的抗原結(jié)合位點，其中底部具有小脊(圖4C，左圖)。在結(jié)合時，山谷的兩側(cè)沿著螺旋A和C包圍OSM四螺旋束，其中底部脊結(jié)合在兩螺旋之間(圖4C，右圖)。抗體和抗原結(jié)合界面遮蔽的溶劑可觸及表面(對于Ab為對于Ag為)。雖然界面處存在多個帶電殘基，但不存在電荷-電荷配對，表明vdw和H鍵合在抗體和抗原相互作用中發(fā)揮最重要的作用。表13：*對于氫鍵(以粗體突出顯示)距離截止值為而對于vdw接觸為因此H17/L180Fab在之前顯示被gp130接觸的殘基；Q20和G120處，并沿著A和C螺旋接觸OSM。實例8：藥代動力學(xué)OSM是與炎性過程相關(guān)的可溶性靶標(biāo)，與細(xì)胞上的細(xì)胞表面展示的靶標(biāo)不同。因此可使用用賦予改變的FcR結(jié)合的突變工程化Fc的方法將包含如本文發(fā)現(xiàn)的結(jié)合區(qū)和另外具有Fc域的完整IgG的性質(zhì)調(diào)整成與其用途相關(guān)的目的和治療規(guī)格。在本發(fā)明組合物中，循環(huán)中的緩釋活性和持久性是治療單克隆IgG的有益規(guī)格。因此，F(xiàn)c域?qū)π律荏w(FcRn)具有增強(qiáng)的親和力。使用之前描述的突變M428L(MedImmune美國專利No.7670600)結(jié)合N434S(US7371826，WO2006/053301)，使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)構(gòu)造突變的和野生型抗體。將這兩個Mab即M71和M71L/S在標(biāo)準(zhǔn)活性測定中進(jìn)行比較，并比較它們在非人的靈長類動物的循環(huán)中的持久性。測定在A375-S2增殖測定中并行比較M71和M71L/S。從起始濃度1μg/ml至0.00032μg/ml(以1∶5稀釋)評價劑量-反應(yīng)。在1μg/ml的濃度時，這些抗體的同種型對照即分別是CNTO3930和CNTO8852，對2ng/ml的人制瘤素M抑制增殖的能力沒有影響。M71和M71L/S在1μg/ml時均完全中和制瘤素M的效應(yīng)，并且IC50無可測量的差異。在小鼠全身施用模型中比較M71和M71L/S。簡而言之，給小鼠皮下給藥M71和M71L/S(20、10或5.0mg/kg)、CNTO3930(huIgG1同種型對照，20mg/kg)、CNTO8852(用于Fc突變變型的同種型對照，20mg/kg)或體積為10μl/g的PBS。24小時之后，給每只小鼠i.p.注射10μg的于PBS(SigmaD8357)中的自身產(chǎn)生的CHO細(xì)胞來源的重組人制瘤素Mw/0.1％小鼠血清白蛋白(SigmaA3559)或單獨PBS-MSA媒介物對照(200μL總體積)。1小時之后，用CO2使小鼠麻醉并通過末端心臟穿刺收集血液。使各個血液樣品在冰上凝結(jié)20分鐘，然后以3500rpm旋轉(zhuǎn)10-15分鐘。將血清樣品冷凍保存直至使用由對IL-6、MCP-1、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、KC和IP-10特異的珠組成的定制Millipore鼠多路復(fù)用進(jìn)行分析。同種型對照對由人制瘤素M誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放均沒有任何影響。然而，M71和M71L/S均中和制瘤素M誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放，并且在效能或功效方面無明顯差異。藥代動力學(xué)分析在非末端食蟹猴藥代動力學(xué)研究中比較M71和M71L/S的血清半衰期。該研究包括總共12只食蟹猴，并對每種抗體評價皮下(s.c.，n＝3)和靜脈內(nèi)(i.v.，n＝3)施用?？贵w按3mg/kg劑量給藥，并且該研究進(jìn)行超過60天。在1小時(僅IV組)和6小時以及在第1、2、4、6、8、12、16、30、37、45和60天時抽取血樣樣品。將來自樣品的血清在-80℃下凍存直至測試。使用在食蟹猴血清中針對MesoScaleDiscovery平臺優(yōu)化的ELISA確定血清中的抗體水平。生物素?；东@抗體為針對M71培育的抗獨特型抗體(小鼠抗M71)。檢測抗體為釕標(biāo)記的抗人IgG，并且讀出是MesoScaleDiscovery化學(xué)發(fā)光。該研究的結(jié)果示于圖6A和B中。圖6A示出來自i.v.給藥的圖線，其中M71的血清半衰期為15.21+/-3.0天，而M71L/S的半衰期為29.4+/-2.3天。類似的結(jié)果從s.c.給藥獲得(圖6B)，其中M71的血清半衰期為15.4+/-4天，而M71L/S的血清半衰期為32.0+/-5.9天。結(jié)果顯示，相比于M71，M71L/St1/2增加約兩倍。