專利名稱：交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，特別涉及更為簡易地制備交聯(lián)率低且具有優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸交聯(lián)形成的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的生物體適合性優(yōu)異，同時兼具在生物體內(nèi)可以隨時間推移而分解并最終消除的生物降解性。以往，對于利用交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的上述性質(zhì)，將其應(yīng)用于防粘連劑、骨修復(fù)劑、藥物緩釋組合物以及組織增大物質(zhì)(組織增大物質(zhì))等進行了大量研究和開發(fā)。其中，已知作為在組織增大物質(zhì)中的代表性應(yīng)用例子有在美容形成領(lǐng)域中的皺紋拉伸注入劑(皺伸ばし注入剤)。
交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠通常是將透明質(zhì)酸與交聯(lián)劑在水溶液中攪拌混合，通過交聯(lián)劑使透明質(zhì)酸高分子鏈間化學(xué)鍵合來制備。這里，將上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠施予生物體內(nèi)時，凝膠在生物體內(nèi)分解后，殘留的交聯(lián)劑成分對于生物體來說被識別為異物，引發(fā)炎癥反應(yīng)等不良影響。因此，為了保持生物體適合性，需要制備以盡可能低的交聯(lián)率交聯(lián)的透明質(zhì)酸凝膠。
但是，以往的常規(guī)交聯(lián)方法中，如果減少交聯(lián)劑的添加量，則所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的粘彈性降低，不柔軟，例如作為皺紋拉伸注入劑使用時，無法在注入部位確保一定的體積。另外，使用交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠作為藥物緩釋制劑時，為了使藥物的適當(dāng)效果維持一定期間，必需在生物體內(nèi)長時間滯留，因此要求以更高濃度的高粘彈性的交聯(lián)凝膠，但是如果減少交聯(lián)劑量，則難以獲得所述高粘彈性的交聯(lián)凝膠。因此，制備兼具低交聯(lián)率和優(yōu)異粘彈性兩者的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠成為一個非常困難的課題。
針對上述問題，在專利第3094074號中報告了交聯(lián)率較低且具有優(yōu)異粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法。但是該制備方法具體來說是將透明質(zhì)酸與交聯(lián)劑在水溶液中混合，引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)，通過在發(fā)生凝膠化之前加入水，稀釋混合溶液來暫時阻止交聯(lián)反應(yīng)的進行，再使水從該混合溶液中揮發(fā)，再次進行交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過了上述兩步交聯(lián)反應(yīng)步驟，因此操作非常繁雜，反應(yīng)難以控制，不適合大量生產(chǎn)。
專利文獻1專利第3094074號發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的問題而進行的，其目的在于提供可簡便地制備交聯(lián)率低且顯示優(yōu)異粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的新制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進行了深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用于交聯(lián)反應(yīng)的混合物中的透明質(zhì)酸為10W/V％以上的高濃度條件，即使減少交聯(lián)劑的添加量也可以得到具有優(yōu)異粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。要說明的是，使用通常的透明質(zhì)酸時，10W/V％以上的高濃度的透明質(zhì)酸水溶液呈現(xiàn)出無法稱為溶液狀的固體粉末狀或非常高粘度的凝膠狀。即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以本領(lǐng)域技術(shù)人員未曾使用的極高濃度條件使透明質(zhì)酸反應(yīng)，可以簡便地制備即使交聯(lián)率低也能顯示優(yōu)異粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法的特征在于將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑、水的混合物在酸性或堿性條件下攪拌混合。另外，在上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，該混合物在供給交聯(lián)反應(yīng)前的存儲彈性模量G’(頻率1Hz)優(yōu)選為15000Pa以上。
在上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，優(yōu)選不將該混合物中的透明質(zhì)酸高分子鏈進行物理切斷而攪拌混合。在上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，優(yōu)選通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置將該混合物攪拌混合。在上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，優(yōu)選通過面包面團攪拌裝置或搗年糕裝置將該混合物攪拌混合。在上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，優(yōu)選通過人工手揉捏將該混合物攪拌混合。在上述透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，優(yōu)選該混合物中的交聯(lián)劑濃度為0.2-1W/V％。在上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，優(yōu)選該混合物中的交聯(lián)劑濃度相對于透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為0.02-2W/W％。在上述交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，優(yōu)選交聯(lián)劑選自二乙烯基砜、1，4-丁二醇·二縮水甘油醚和乙二醇·二縮水甘油醚。


圖1是本發(fā)明的一個實施例中使用的自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置的整體圖。
圖2是本發(fā)明的一個實施例中使用的面包面團攪拌裝置的整體圖。
圖3是由本發(fā)明的實施例1-1得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(透明質(zhì)酸41W/V％，一個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元中二乙烯基砜的交聯(lián)率為0.8％)的粘彈性測定結(jié)果。
圖4是市售交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(RestylaneQ-MED公司制)的粘彈性測定結(jié)果。
圖5是由本發(fā)明的實施例1-2得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(透明質(zhì)酸33W/V％，一個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元中1，4-丁二醇·二縮水甘油醚的交聯(lián)率為1％)的粘彈性測定結(jié)果。
圖6是由本發(fā)明的實施例1-3得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(透明質(zhì)酸26W/V％，一個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元中二乙烯基砜的交聯(lián)率為0.8％)的粘彈性測定結(jié)果。
圖7是由本發(fā)明的實施例1-4得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(透明質(zhì)酸26W/V％，一個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元中1，4-丁二醇·二縮水甘油醚的交聯(lián)率為1％)的粘彈性測定結(jié)果。
圖8是由本發(fā)明的實施例1-5得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(透明質(zhì)酸13W/V％，一個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元中1，4-丁二醇·二縮水甘油醚的交聯(lián)率為2.8％)的粘彈性測定結(jié)果。
圖9是往由本發(fā)明的制備方法得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿和1.2％透明質(zhì)酸水溶液中添加酶溶液得到的試驗品(以及對照品)在酶反應(yīng)后樣品的重量以理論殘留樣品百分率(％)的形式匯總的圖。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明的實施方式進行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于此。
本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法的特征在于在酸性或堿性條件下將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑、水的混合物攪拌混合，由此，可以簡便地制備雖然交聯(lián)率低但具有優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
在本發(fā)明中，“交聯(lián)率”表示一個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元的交聯(lián)劑的數(shù)量。例如交聯(lián)率100％是表示相對于一個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元結(jié)合有一個交聯(lián)劑。
本發(fā)明中使用的透明質(zhì)酸如下述通式所示，是N-乙?；?D-葡糖胺殘基和D-葡糖醛酸殘基交替鍵合的直鏈狀高分子，只要是上述結(jié)構(gòu)即可，沒有特別限定，均可使用。
透明質(zhì)酸例如可通過由雞冠或其它動物組織分離提取、或者通過使用鏈球菌屬等微生物進行的發(fā)酵法獲得。本發(fā)明中，也可以使用透明質(zhì)酸的衍生物，例如透明質(zhì)酸鈉鹽、透明質(zhì)酸鉀鹽等透明質(zhì)酸金屬鹽，或?qū)⑼该髻|(zhì)酸的羥基、羧基等醚化、酯化、酰胺化、縮醛化、縮酮化得到的透明質(zhì)酸衍生物等。
本發(fā)明的透明質(zhì)酸可以使用市售商品。市售的透明質(zhì)酸例如有バイオヒアロ12(資生堂社制備)、透明質(zhì)酸(紀(jì)文社制備)等。
在本發(fā)明中，供給交聯(lián)反應(yīng)的混合物中必須含有10W/V％以上的上述透明質(zhì)酸。這樣，在以高濃度含有透明質(zhì)酸的混合物中，透明質(zhì)酸分子鏈以非常復(fù)雜地相互纏繞的狀態(tài)存在，因此透明質(zhì)酸鏈之間部分交聯(lián)，分子鏈之間被互相立體地束縛，可以使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)牢固穩(wěn)定。因此，通過將含有10W/V％以上透明質(zhì)酸的混合物用于交聯(lián)反應(yīng)，可以制備雖然交聯(lián)率低但顯示優(yōu)異粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。另一方面，透明質(zhì)酸濃度低于10W/V％時，交聯(lián)率低，透明質(zhì)酸分子鏈的自由度高，結(jié)果交聯(lián)凝膠變得柔軟，無法獲得優(yōu)異的粘彈性。另外，本發(fā)明中，更優(yōu)選在供給交聯(lián)反應(yīng)的混合物中含有10-20W/V％的上述透明質(zhì)酸。
在使用通常使用的分子量為10萬以上的透明質(zhì)酸制備上述10W/V％以上的高濃度透明質(zhì)酸水溶液時，通常呈現(xiàn)固體粉末狀或非常高粘度的凝膠狀，在頻率1Hz下的存儲彈性模量G’為15000Pa以上。在本發(fā)明中，優(yōu)選供給交聯(lián)反應(yīng)的混合物以呈現(xiàn)上述固體粉末狀或高粘度凝膠狀的狀態(tài)進行反應(yīng)。即，在本發(fā)明中，上述透明質(zhì)酸分子必須以非常復(fù)雜的絡(luò)合狀態(tài)進行交聯(lián)反應(yīng)，即使透明質(zhì)酸濃度為10W/V％以上，如果透明質(zhì)酸以分散于水中的所謂溶液狀進行反應(yīng)，有時也無法得到具有所需粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。因此，本發(fā)明中優(yōu)選供給交聯(lián)反應(yīng)前的混合物的存儲彈性模量G’(頻率數(shù)1Hz)為15000Pa以上。
對本發(fā)明中使用的透明質(zhì)酸的分子量沒有特別限定，優(yōu)選分子量為10萬以上，進一步優(yōu)選分子量為50萬-300萬左右。通常使用的透明質(zhì)酸幾乎都是分子量為10萬以上的，尤其是也存在低分子化的分子量為1萬左右的透明質(zhì)酸。在本發(fā)明中，如果使用上述分子量為1萬左右的低分子化透明質(zhì)酸，則即使使透明質(zhì)酸濃度為10W/V％以上，透明質(zhì)酸形成在水中均勻分散的溶液狀，在降低交聯(lián)率時變?nèi)彳洠矡o法獲得所需的粘彈性，因此不優(yōu)選。
本發(fā)明中使用的交聯(lián)劑只要是可以通過化學(xué)鍵將上述透明質(zhì)酸的高分子鏈之間進行交聯(lián)的交聯(lián)劑即可，可以使用任何交聯(lián)劑。作為透明質(zhì)酸的交聯(lián)劑，可以使用具有2個以上官能團的多官能性化合物，所述官能團為可以與透明質(zhì)酸分子所具有的羧基、羥基、乙酰氨基等反應(yīng)性官能團反應(yīng)并形成共價鍵的官能團。本發(fā)明中使用的交聯(lián)劑具體有1，3-丁二烯二環(huán)氧化物、1，2，7，8-二環(huán)氧辛烷、1，5-己二烯二環(huán)氧化物等烷基二環(huán)氧化物；乙二醇二縮水甘油醚、1，4-丁二醇二縮水甘油醚、雙酚A二縮水甘油醚等二縮水甘油醚；二乙烯基砜、表氯醇等。其中特別優(yōu)選使用二乙烯基砜、1，4-丁二醇·二縮水甘油醚、以及乙二醇·二縮水甘油醚。本發(fā)明中，還可以將兩種以上交聯(lián)劑適當(dāng)組合使用。
本發(fā)明中，在供給交聯(lián)反應(yīng)的混合物中，上述交聯(lián)劑的配合量沒有特別限定，從所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的生物體適應(yīng)性角度考慮，優(yōu)選用盡可能少量的交聯(lián)劑進行交聯(lián)反應(yīng)。具體來說，優(yōu)選在供給交聯(lián)反應(yīng)的混合物中，上述交聯(lián)劑濃度為0.02-1W/V％，更優(yōu)選為0.05-0.5W/V％。或者優(yōu)選混合物中的交聯(lián)劑濃度相對于透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為0.02-2W/W％。根據(jù)本發(fā)明，使交聯(lián)劑濃度在混合物中為1W/V％以下時也可以制備具有優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。在本發(fā)明中，使用通常的低分子交聯(lián)劑、使交聯(lián)劑濃度為0.066W/V％、使透明質(zhì)酸濃度為14W/V％進行交聯(lián)反應(yīng)時，假定交聯(lián)劑全部與透明質(zhì)酸的反應(yīng)性基團反應(yīng)，則所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)率通常是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元約為1.67％以下。換而言之，每64個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元鍵合一個交聯(lián)劑。
本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，在酸性或堿性條件下將含有上述透明質(zhì)酸10W/V％以上、上述交聯(lián)劑、水的混合物進行攪拌混合，使上述透明質(zhì)酸所具有的反應(yīng)性官能團與上述交聯(lián)劑反應(yīng)，由此通過化學(xué)鍵使透明質(zhì)酸高分子鏈間交聯(lián)，生成交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
本發(fā)明中，為提高交聯(lián)反應(yīng)時透明質(zhì)酸的反應(yīng)性，可通過鹽酸、硫酸等酸；氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿；或磷酸鹽、季銨鹽等的適當(dāng)?shù)木彌_液適當(dāng)調(diào)節(jié)混合物的pH，在酸性或堿性條件下進行攪拌混合。具體來說，例如優(yōu)選調(diào)節(jié)混合物的pH值，使其在酸性條件下為pH1-5、堿性條件下為pH 10-14。
本發(fā)明中，供給交聯(lián)反應(yīng)的混合物中，除上述必須成分之外，還可以在不影響本發(fā)明的目的和效果的范圍預(yù)先配合通常在藥物、化妝品等中使用的成分?？梢耘浜系某煞掷缬锌箟难峒捌溲苌?、甘油等保濕劑、視黃醇及其衍生物、水楊酸等抗炎藥等。
本發(fā)明中，對將上述混合物攪拌混合的方法沒有特別限定，優(yōu)選在不物理性地切斷混合物中的透明質(zhì)酸高分子鏈的條件下進行攪拌混合。透明質(zhì)酸具有極高的水溶脹性，例如約10W/V％左右的透明質(zhì)酸水溶液顯示極高粘度的凝膠狀。因此例如在通常廣泛使用的螺旋槳混合機或分散機等旋轉(zhuǎn)式攪拌混合裝置中，會附著在攪拌葉片或裝置壁等上，很難將整個體系均勻攪拌混合。并且使用上述攪拌混合裝置，強行使攪拌葉片旋轉(zhuǎn)進行攪拌混合時，銳利的攪拌葉片會將透明質(zhì)酸高分子的分子鏈物理性切斷，無法獲得目標(biāo)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)凝膠)。這樣，使用通常的攪拌混合裝置在高濃度條件的透明質(zhì)酸水溶液中進行均勻交聯(lián)反應(yīng)是非常困難的，因此以往在交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備中，通常是在0.1-3W/V％左右的低粘度透明質(zhì)酸水溶液中進行交聯(lián)反應(yīng)。
與此相對，在本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，例如通過使用自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置進行攪拌混合、使用面包面團攪拌裝置(或搗年糕裝置)進行攪拌混合、或者通過人工手揉捏進行攪拌混合，在不物理性切斷混合物中的透明質(zhì)酸高分子鏈的條件下進行攪拌混合，由此在10W/V％以上這樣的極高透明質(zhì)酸濃度的條件下也可以容易地形成均勻的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。即，根據(jù)上述攪拌混合方法，即使在透明質(zhì)酸高濃度條件下，也能在不物理性切斷透明質(zhì)酸高分子的分子鏈的條件下即可將體系整體均勻攪拌混合，制備均勻交聯(lián)的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
以下，對于本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，列舉攪拌混合方法的具體例子來進一步對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
1.通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置進行的攪拌混合將本發(fā)明的上述混合物進行攪拌混合的方法可以采用利用自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置的攪拌混合。
本發(fā)明中使用的自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，例如可以將日本特開昭61-290946號公報、日本實公平5-32110號公報、日本特開平10-43568號公報、日本特開平11-226376號公報以及日本特開2000-271465號公報等中記載的混合裝置應(yīng)用在本發(fā)明中。
圖1表示本發(fā)明的一個實施例的自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置。
本發(fā)明的一個實施例的自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置10具備裝試樣的容器主體14及其容器蓋12、固定保持容器主體14的容器支架16、使容器支架16沿著自轉(zhuǎn)軸18旋轉(zhuǎn)的自轉(zhuǎn)裝置20、支持自轉(zhuǎn)裝置20的支持部22、使支持部22沿著公轉(zhuǎn)軸24旋轉(zhuǎn)的公轉(zhuǎn)裝置26。
(制備例1)1)向自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置10的容器主體14中裝入含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物30，蓋上容器蓋12，安裝在容器支架16上。
2)運轉(zhuǎn)自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置10，使自轉(zhuǎn)裝置20和公轉(zhuǎn)裝置26旋轉(zhuǎn)。
上述混合物30以10W/V％以上這樣極高的濃度含有透明質(zhì)酸，呈固體粉末狀或非常高粘度的凝膠狀。
在上述制備例中，容器支架16通過自轉(zhuǎn)裝置20沿自轉(zhuǎn)軸18旋轉(zhuǎn)，并且支持自轉(zhuǎn)裝置20的支持部22通過公轉(zhuǎn)裝置26沿公轉(zhuǎn)軸24旋轉(zhuǎn)。裝在容器支架16中的混合物30沿著自轉(zhuǎn)軸18自轉(zhuǎn)的同時，沿著公轉(zhuǎn)軸24公轉(zhuǎn)。
如上所述，將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物30供給到具有自轉(zhuǎn)裝置20和公轉(zhuǎn)裝置26的自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置10中，使其在自轉(zhuǎn)的同時進行公轉(zhuǎn)，而進行攪拌混合，由此，雖然混合物30為固體粉末狀或非常高粘度的凝膠狀，但是不會物理性切斷透明質(zhì)酸高分子的分子鏈，體系整體可以均勻攪拌混合，因此可容易地在透明質(zhì)酸分子間形成均勻的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
容器支架16可通過自轉(zhuǎn)裝置20和公轉(zhuǎn)裝置26同時進行自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)速度可自由設(shè)定。容器支架16的旋轉(zhuǎn)速度因所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的性質(zhì)、容量、以及容器支架16或自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置10的規(guī)模而不同，但通常自轉(zhuǎn)速度為60-1000轉(zhuǎn)/分鐘，公轉(zhuǎn)速度為300-3000轉(zhuǎn)/分鐘左右。通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置10對混合物30進行攪拌混合的時間也與上述旋轉(zhuǎn)速度的情況同樣，因所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的性質(zhì)、容量以及裝置的規(guī)模等各條件而不同，但通常為10秒-30分鐘左右。
2.通過面包面團攪拌裝置進行的攪拌混合將本發(fā)明的上述混合物進行攪拌混合的方法可以采用通過面包面團攪拌裝置進行的攪拌混合。
本發(fā)明中使用的面包面團攪拌裝置是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，可以將各種市售的裝置應(yīng)用于本發(fā)明。
圖2表示本發(fā)明的一個實施例的面包面團攪拌裝置。
本發(fā)明的一個實施例的面包面團攪拌裝置40具備裝試樣的容器主體44、其容器蓋42和容器主體44中的面包面團攪拌用葉片46、使容器主體44沿旋轉(zhuǎn)軸48旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)裝置50。這里，面包面團攪拌用葉片46與通常的攪拌器或食品加工器用的銳利的攪拌葉片不同，是為攪拌面包面團的目的而設(shè)計的。通常的面包面團通過攪拌形成谷蛋白的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，獲得獨特的粘彈性，與本發(fā)明大致相同，必須在不物理性切斷谷蛋白的分子鏈地條件下進行攪拌混合(在通過支鏈淀粉的相互纏繞獲得粘彈性的舂米的情況下也相同)。
(制備例2)1)在面包面團攪拌裝置40的容器主體44中安裝面包面團攪拌用葉片46，在該容器主體44中裝含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物60，蓋上容器蓋42。
2)運轉(zhuǎn)面包面團攪拌裝置40，使旋轉(zhuǎn)裝置50旋轉(zhuǎn)。
上述制備例中，容器主體44中的面包面團攪拌用葉片46通過旋轉(zhuǎn)裝置50沿旋轉(zhuǎn)軸48旋轉(zhuǎn)。通過面包面團攪拌用葉片的旋轉(zhuǎn)，裝在容器主體44中的混合物60被攪拌混合。這里，面包面團攪拌用葉片46設(shè)計得使可在不物理性切斷面包面團中的谷蛋白分子鏈的條件下進行攪拌混合。因此，在上述制備例中，不會物理性切斷混合物60中的透明質(zhì)酸高分子的分子鏈即可以將體系整體均勻攪拌混合。
如上所述，將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物60供給面包面團攪拌裝置40，通過面包面團攪拌葉片46的旋轉(zhuǎn)進行攪拌混合，由此混合物60雖然形成固體粉末狀或非常高粘度的凝膠狀，但可以在不物理性切斷透明質(zhì)酸高分子的分子鏈的條件下將體系整體均勻攪拌混合，因此可以容易地在透明質(zhì)酸分子間形成均勻的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
面包面團攪拌用葉片46的旋轉(zhuǎn)速度可自由設(shè)定，因所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的性質(zhì)、容量、面包面團攪拌用葉片46的形狀、以及容器主體44或面包面團攪拌裝置40的規(guī)模而不同，通常旋轉(zhuǎn)速度為1000-2000轉(zhuǎn)/分鐘左右。通過面包面團攪拌裝置40對混合物60進行攪拌混合的時間也與上述旋轉(zhuǎn)速度的情況相同，因所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的性質(zhì)或容量、葉片的形狀和裝置的規(guī)模等各條件而不同，但通常為2-6分鐘左右。
本發(fā)明將上述混合物攪拌混合的方法與上述面包面團攪拌裝置同樣，也可以采用利用搗年糕裝置進行的攪拌混合。
本發(fā)明中使用的搗年糕裝置是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，可以將各種市售的裝置應(yīng)用在本發(fā)明中。
3.通過人工手揉捏進行攪拌混合本發(fā)明中，將上述混合物進行攪拌混合的方法還可以采用通過人手揉捏進行的攪拌混合。
(制備例3)1)將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物裝在可密閉的塑料袋中并封口。
2)用兩手的兩根手指對上述袋中的混合物進行揉捏，充分混合。
如上所述，將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物通過人手的揉捏進行攪拌混合，由此混合物雖然形成固體粉末狀或非常高粘度的凝膠狀，但可在不物理性切斷透明質(zhì)酸高分子的分子鏈的條件下將體系整體均勻攪拌混合，因此透明質(zhì)酸分子間可形成均勻的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
通過人手的揉捏將上述混合物混合的時間因所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的性質(zhì)或容量、以及袋子的大小等各條件而不同，但通常為5-10分鐘左右。
根據(jù)以上說明的本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，具體來說，雖然交聯(lián)率為是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為2％以下的低交聯(lián)率，但仍可以簡便地制備在生理食鹽水中達到溶脹平衡時該交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在頻率1Hz下的存儲彈性模量G’為100Pa以上，更優(yōu)選為1000Pa以上的具有非常優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
由本發(fā)明的制備方法得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠可以直接或者通過配合在適當(dāng)?shù)呐浞街杏糜谒幬?、化妝品等。特別是根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以簡便地制備交聯(lián)率低但顯示優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，因此可用于應(yīng)用于生物體的物質(zhì)，例如皺紋拉伸注入劑等組織增大物質(zhì)、藥物緩釋性組合物、防粘連劑、骨修復(fù)劑等。
由本發(fā)明的制備方法得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠其抗酶解性(透明質(zhì)酸酶抗性)高，在生物體內(nèi)可長時間保持凝膠結(jié)構(gòu)，因此特別優(yōu)選用于例如關(guān)節(jié)注入劑(関節(jié)注入剤)、眼球玻璃體取代劑(眼內(nèi)硝子體置換剤)、眼科用手術(shù)輔助劑(眼科用手術(shù)補助剤)。
目前，為了改善變形性膝關(guān)節(jié)病、肩周炎、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的膝關(guān)節(jié)痛等癥狀，將透明質(zhì)酸作為關(guān)節(jié)注入劑使用。由本發(fā)明得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的抗酶解性高，因此通過用作關(guān)節(jié)注入劑，有望使癥狀改善的效果比以往的制品保持更長時間。另外，目前，用于使脫落的視網(wǎng)膜復(fù)位的眼球玻璃體取代物廣泛使用硅油。作為上述眼球玻璃體取代物，雖然適合采用作為生物體內(nèi)成分的透明質(zhì)酸，但是透明質(zhì)酸在眼球內(nèi)容易被酶分解，因此目前尚未有作為玻璃體取代物的透明質(zhì)酸銷售。由本發(fā)明得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的抗酶解性高，用作玻璃體取代物時，可以長時間存留在眼內(nèi)，使視網(wǎng)膜與脈絡(luò)膜附著，有望獲得使視網(wǎng)膜復(fù)位的效果。近年來，通過使用透明質(zhì)酸作為眼科手術(shù)輔助劑，白內(nèi)障手術(shù)可以安全且容易地進行。由本發(fā)明得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠雖然是交聯(lián)凝膠，但是非常小的微粒，與高粘彈性透明質(zhì)酸溶液顯示同等的粘彈性。因此，有望與市售的透明質(zhì)酸眼科手術(shù)輔助劑同樣地用作眼科手術(shù)時的輔助劑等。并且市售的透明質(zhì)酸均經(jīng)過過濾滅菌，而由本發(fā)明得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠可以進行高壓蒸氣滅菌，可以使最終產(chǎn)品的微生物污染危險性降低到最小。
以下給出本發(fā)明的實施例，進一步對本發(fā)明進行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于此。
在高濃度透明質(zhì)酸條件下制備交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置)本發(fā)明人首先使用自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置，在50W/V％這樣極高的透明質(zhì)酸濃度條件下嘗試使用少量交聯(lián)劑進行交聯(lián)反應(yīng)，測定所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的粘彈性，與市售的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠進行粘彈性比較。在本發(fā)明中，測定透明質(zhì)酸水溶液的容積，計算W/V％。
實施例1-1透明質(zhì)酸41W/V％、二乙烯基砜交聯(lián)率0.8％向1800μL純化水中加入200μL 2N NaOH水溶液和2μL二乙烯基砜，進一步添加1.0g透明質(zhì)酸(バイオヒアロ12資生堂社制備)。將該混合物(在頻率1Hz下的存儲彈性模量G’300000Pa)通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置(AR-250THINKY社制造)在室溫攪拌混合5分鐘。將生成物在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，將溶脹的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠用樣品磨(サンプルミル)(SK-M2型共立理工制造)進行破碎，得到目標(biāo)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿。對于所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿，使用流變計(Rheolyst AR1000-NTAインスツルメント社制造)、在25℃、頻率0.1-10Hz的條件下進行存儲彈性模量G’和損耗彈性模量G”的測定。假定添加的交聯(lián)劑全部與透明質(zhì)酸的反應(yīng)性基團反應(yīng)，則所得交聯(lián)透明質(zhì)酸的交聯(lián)率是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為0.8％。測定結(jié)果如圖3所示。
比較例1-1市售交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(RestylaneQ-MED社制備)交聯(lián)率1％為了與本發(fā)明進行比較，對于以往廣泛用作皺紋拉伸注入劑的市售交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠(RestylaneQ-MED社制備)與上述實施例1-1同樣地進行存儲彈性模量G’和損耗彈性模量G”的測定。該市售交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠是根據(jù)日本專利第3094074號公報所記載的方法制備的，推測其交聯(lián)率是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為1％。測定結(jié)果如圖4所示。
如圖3所示，由上述實施例1-1得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿交聯(lián)率為0.8％，比較低，但在生理食鹽水中達到溶脹平衡時，在頻率0.1-10Hz的范圍的存儲彈性模量G’約為20000Pa，損失彈性模量G”約為5000Pa，顯示優(yōu)異的粘彈性。這是由于供給交聯(lián)反應(yīng)的混合物中的透明質(zhì)酸濃度為41W/V％，明顯高，因此只通過少量的交聯(lián)劑進行交聯(lián)，透明質(zhì)酸分子鏈之間就立體地互相束縛，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)牢固穩(wěn)定。而如圖4所示，以往廣泛用作皺紋拉伸注入劑的比較例1-1的市售交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿的交聯(lián)率為1％左右，在生理食鹽水中達到溶脹平衡時其存儲彈性模量G’約為1000Pa，損耗彈性模量G”約為200Pa。由此可知，由上述實施例1-1得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿雖然交聯(lián)率低，但作為皺紋拉伸注入劑在實際應(yīng)用時顯示足夠的優(yōu)異的粘彈性。
作為上述比較例1-1使用的市售交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿雖然交聯(lián)率低，但其制備方法如專利第3094074號公報中所述，要經(jīng)過下述分兩步的交聯(lián)反應(yīng)工序，必須進行非常繁雜的操作，即將透明質(zhì)酸和交聯(lián)劑在水溶液中混合引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)，在發(fā)生凝膠化之前加入水稀釋混合溶液，由此暫時阻礙交聯(lián)反應(yīng)的進行，再使水從該混合溶液中揮發(fā)，再次進行交聯(lián)反應(yīng)。與此相對，上述實施例1-1的制備方法通過在41W/V％這樣極高的透明質(zhì)酸濃度條件下進行交聯(lián)反應(yīng)，可以非常簡便地制備低交聯(lián)率且顯示優(yōu)異粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
接著，本發(fā)明人將交聯(lián)劑的種類和供給交聯(lián)反應(yīng)的透明質(zhì)酸濃度條件進行適當(dāng)改變，嘗試進行與上述實施例1-1同樣的試驗，研究與所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿的粘彈性的關(guān)系。
實施例1-233W/V％透明質(zhì)酸、1，4-丁二醇·二縮水甘油醚交聯(lián)率1％向2250μL純化水中加入250μL 2N NaOH水溶液、5μL 1，4-丁二醇·縮水甘油醚，進一步添加1.0g透明質(zhì)酸(バイオヒアロ12資生堂社制備)。將該混合物(在頻率1Hz下的存儲彈性模量G’100000Pa)通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置(AR-250THINKY社制造)在室溫攪拌混合5分鐘，然后在室溫下靜置24小時。將所得凝膠在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，將溶脹的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠用樣品磨(SK-M2型共立理工制造)破碎，得到目標(biāo)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿。對于所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿與實施例1-1同樣地進行存儲彈性模量G’和損失彈性模量G”的測定。假定添加的交聯(lián)劑全部與透明質(zhì)酸的反應(yīng)性基團反應(yīng)，則所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)率是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為1％。測定結(jié)果如圖5所示。
如圖5所示，使用1，4-丁二醇·二縮水甘油醚作為交聯(lián)劑，在透明質(zhì)酸濃度為33W/V％的條件下得到實施例1-2的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其交聯(lián)率為1％，比較低，但在生理食鹽水中達到溶脹平衡時，在頻率0.1-10Hz范圍其存儲彈性模量G’約為1500Pa，損耗彈性模量G”約為300-400Pa。由此可知，即使使用與上述實施例1-1不同的交聯(lián)劑，在透明質(zhì)酸濃度高的條件下進行交聯(lián)反應(yīng)，仍可得到低交聯(lián)率且顯示優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
實施例1-326W/V％透明質(zhì)酸、二乙烯基砜交聯(lián)率0.8％向3000μL純化水中加入333μL 2N NaOH水溶液、2μL二乙烯基砜，進一步添加1.0g透明質(zhì)酸(バイオヒアロ9資生堂社制備)。將該混合物(在頻率1Hz下的存儲彈性模量G’60000Pa)通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置(AR-250THINKY社制造)在室溫攪拌混合5分鐘。將所得產(chǎn)物在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，將溶脹的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠用樣品磨(SK-M2型共立理工制造)破碎，得到目標(biāo)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿。對于所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿與上述實施例1-1同樣地進行存儲彈性模量G’和損耗彈性模量G”的測定。假定添加的交聯(lián)劑全部與透明質(zhì)酸的反應(yīng)性基團反應(yīng)，則所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)率是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為0.8％。測定結(jié)果如圖6所示。
實施例1-426W/V％透明質(zhì)酸、1，4-丁二醇·二縮水甘油醚交聯(lián)率1％向3000μL純化水中加入333μL 2N NaOH水溶液、5μL 1，4-丁二醇·二縮水甘油醚，進一步添加1.0g透明質(zhì)酸(イオヒアロ12資生堂社制備)。將該混合物(在頻率1Hz下的存儲彈性模量G’60000Pa)通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置(AR-250THINKY社制造)在室溫攪拌混合5分鐘，然后在室溫靜置24小時。將所得凝膠在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，將溶脹的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠用樣品磨(SK-M2型共立理工制造)破碎，得到目標(biāo)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿。對于所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿與上述實施例1-1同樣地進行存儲彈性模量G’和損耗彈性模量G”的測定。假定添加的交聯(lián)劑全部與透明質(zhì)酸的反應(yīng)性基團反應(yīng)，則所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)率是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為1％左右。測定結(jié)果如圖7所示。
實施例1-513W/V％透明質(zhì)酸、1，4-丁二醇·二縮水甘油醚交聯(lián)率2.8％向2250μL純化水中加入250μL 2N NaOH水溶液和5μL 1，4-丁二醇·縮水甘油醚，進一步添0.375g透明質(zhì)酸(バイオヒアロ12資生堂社制備)。將該混合物(在頻率1Hz下的存儲彈性模量G’20000Pa)通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置(AR-250THINKY社制造)在室溫攪拌混合5分鐘，然后在室溫靜置24小時。將所得凝膠在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，將溶脹的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠用樣品磨(SK-M2型共立理工制造)破碎，得到目標(biāo)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿。對于所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿與上述實施例1-1同樣地進行存儲彈性模量G’和損耗彈性模量G”的測定。假定添加的交聯(lián)劑全部與透明質(zhì)酸的反應(yīng)性基團反應(yīng)，則所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)率是1個透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元為2.8％。測定結(jié)果如圖8所示。
如圖6所示，在透明質(zhì)酸濃度為26W/V％的條件下，使用二乙烯基砜作為交聯(lián)劑的實施例1-3中，交聯(lián)率為0.8％左右，在生理食鹽水中達到溶脹平衡時上述存儲彈性模量G’約為300-700Pa，損耗彈性模量G”約為100-200Pa。如圖7所示，使用1，4-丁二醇二縮水甘油醚的實施例1-4中，交聯(lián)率為1％左右，在生理食鹽水中達到溶脹平衡時上述存儲彈性模量G’約為200Pa，損耗彈性模量G”約為30-50Pa。如圖8所示，使用1，4-丁二醇·二縮水甘油醚作為交聯(lián)劑，在透明質(zhì)酸濃度為13W/V％的條件下得到的實施例1-5的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠，其交聯(lián)率為2.8％左右，在生理食鹽水中達到溶脹平衡時上述存儲彈性模量G’約為150Pa，損耗彈性模量G”約為20Pa。
由以上的結(jié)果可知，通過在高濃度透明質(zhì)酸條件下進行交聯(lián)反應(yīng)，可得到0.8-2.8％左右的低交聯(lián)率但具有優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。
透明質(zhì)酸濃度條件的研究接著，本發(fā)明人為了對供給交聯(lián)反應(yīng)的透明質(zhì)酸的濃度條件進行了更為詳細(xì)的研究，將透明質(zhì)酸濃度條件進行各種改變，嘗試與上述實施例1-1同樣的試驗，研究與交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的粘彈性的關(guān)系。
實施例2-1、2-2、比較例2-1～2-5向4.7mL純化水中加0.25mL 2N NaOH水溶液和用二甲基亞砜稀釋為13.3倍的二乙烯基砜50μL(3μL二乙烯基砜)，進一步向其中添加各種濃度的透明質(zhì)酸(バイオヒアロ12資生堂社制備)(實施例2-11g(18.2W/V％)、實施例2-20.75g(13.9W/V％)、比較例2-10.5g(9.4W/V％)、比較例2-20.25g(5.0W/V％)、比較例2-30.15g(3.0W/V％)、比較例2-40.1g(2.0W/V％)、比較例2-50.05g(1.0W/V％))。將該混合物通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置(AR-250THINKY社制造)在室溫攪拌混合5分鐘。將生成物在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，將溶脹的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠用樣品磨(SK-M2型共立理工制造)破碎，得到目標(biāo)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿。對于所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿用流變儀(Rheolyst AR1000-NTAインスツルメント制造)，在25℃、頻率1Hz的條件下進行存儲彈性模量G’的測定。結(jié)果如下表1所示。


如表1所示，在混合物中的透明質(zhì)酸濃度為13.9-18.2％的實施例2-1、2-2中，在生理食鹽水中達到溶脹平衡時的存儲彈性模量G’分別為627.7Pa、204.1Pa，表明可得到具有優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。而在混合物中的透明質(zhì)酸濃度為9.4W/V％的比較例2-1中，存儲彈性模量G’為0.17Pa，顯示極低的粘彈性。進一步地，在混合物中的透明質(zhì)酸濃度為5.0W/V％以下的比較例2-2～2-5中，雖然可見部分形成交聯(lián)凝膠，但是大部分為高濃度透明質(zhì)酸溶液，無法得到顯示粘彈性的凝膠。
通過面包面團攪拌裝置制備交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠接著，本發(fā)明人使用市售的面包面團攪拌裝置嘗試進行高濃度透明質(zhì)酸與少量交聯(lián)劑的交聯(lián)反應(yīng)，并測定所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的粘彈性。
實施例3-1
向190mL純化水中加入用二甲基亞砜稀釋為16.7倍的二乙烯基砜溶液2mL(120μL二乙烯基砜)，輕輕攪拌，進一步添加28.0g透明質(zhì)酸(バイオヒアロ12資生堂社制備)(透明質(zhì)酸濃度13.0W/V％)。將該混合物用市售的面包面團攪拌裝置(ナシヨナルフ一ドプロセツサMK-K58松下電器社制造，安裝另外銷售的面包葉片(AUF84-137))，在室溫攪拌混合2分鐘，然后添加10mL 2N NaOH水溶液，再攪拌混合5分鐘。將生成物裝入可密封的聚乙烯袋中，在室溫靜置18小時，得到200g交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。將約7.2g該交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，得到溶脹凝膠。再將該溶脹凝膠用磨破碎，制成漿，將約1mL填充到小型注射筒中，進行高壓蒸氣滅菌。該高壓蒸氣滅菌后使用流變計(Rheolyst AR1000-NTAインスツルメント社制造)在25℃、頻率1Hz的條件下進行存儲彈性模量G’的測定，為577Pa。
通過手工揉捏制備交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠接著，本發(fā)明人嘗試通過手工揉捏攪拌混合，嘗試使高濃度透明質(zhì)酸與少量交聯(lián)劑發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，測定所得交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的粘彈性。
實施例4-1、4-2、比較例4-1在預(yù)先用乙醇消毒的聚乙烯袋(長100mm、寬70mm)中加入4.95mL 0.1N NaOH水溶液和用二甲基亞砜稀釋為13.3倍的二乙烯基砜溶液50μL(3μL二乙烯基砜)，充分?jǐn)嚢?，進一步添加各種濃度的透明質(zhì)酸(バイオヒアロ12資生堂社制備)(實施例4-10.7g(13W/V％)、實施例4-20.6g(11W/V％)、比較例4-10.5g(9.4W/V％))。添加透明質(zhì)酸后迅速將袋子密封，用兩手的兩根手指將袋中的混合物揉捏，充分混合。混合約5分鐘后將袋子顛倒，將凝膠狀的混合物集中在袋底部，將其成型為棒狀。將袋在潔凈操作臺(クリ一ンベンチ)內(nèi)靜置4小時，然后拆開袋子取出生成物，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。將該交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在生理食鹽水中靜置一周，達到溶脹平衡，得到溶脹凝膠。再將該溶脹凝膠用磨破碎制成漿，將約1mL填充在小型注射筒內(nèi)，進行高壓蒸氣滅菌。該高壓蒸氣滅菌后使用流變計(Rheolyst AR1000-NTAインスツルメント社制造)，在25℃、頻率1Hz的條件下進行存儲彈性模量G’的測定，分別為181Pa(實施例4-1)、61.5Pa(實施例4-2)、10.5Pa(比較例4-1)。
將由以上各實施例得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的漿在手指上碾擦，可以確認(rèn)在通過機械(自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置或面包面團攪拌裝置)進行攪拌混合制備的透明質(zhì)酸凝膠漿中存在極少量的硬凝膠微粒，但是在用手揉捏攪拌混合制備的透明質(zhì)酸凝膠淤漿中未見有上述硬微粒的存在。由此可以認(rèn)為本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法中，通過人手工揉捏攪拌混合是更為適合的方法。
交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的抗酶解性接著，本發(fā)明人考慮到例如向皺紋拉伸注入劑那樣注入到生物體內(nèi)的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿的應(yīng)用，對由本發(fā)明得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿的抗酶解性進行了研究。
抗酶解性試驗將由本發(fā)明的制備方法得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿1-5和1.2％透明質(zhì)酸水溶液各1g分別裝入無菌Eppendorf離心管(2mL)內(nèi)，為使試管內(nèi)液面水平，將各管裝入甩平(スウイングバケツ)離心機中進行離心(8300×g，2000rpm，10分鐘)。然后向各管內(nèi)的透明質(zhì)酸表面緩慢地加入0.112mL透明質(zhì)酸酶溶液(牛睪丸萃取透明質(zhì)酸酶、2000單位/mL，0.1mol/L，磷酸緩沖液pH 7.4)，以此作為試驗品。以除了不含透明質(zhì)酸酶之外其余均在同樣條件下制成的作為對照品。將各管放入37℃的恒溫槽中，進行16小時酶促反應(yīng)。添加酶溶液后試驗品的最終酶活性為201單位/mL。反應(yīng)后將各管倒立，將液態(tài)樣品用紙巾吸收，測定殘留在管底部的樣品重量。將各試樣的試驗品以及對照品的樣品重量測定結(jié)果以理論殘留樣品百分率(％)的形式匯總于圖9。理論殘留樣品百分率(％)是將理論初期樣品重量(1g)中減去液化的樣品重量的差作為殘留樣品重量，將殘留樣品重量以與理論初期量(1g)的百分率的形式表示。
如圖9所示，在加入了不含有酶的添加液(0.112mL)的對照品中，添加液部分的重量增加了，但完全未見1.2％透明質(zhì)酸水溶液或交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的液化。而在添加了酶的試驗品中，1.2％透明質(zhì)酸水溶液中約80％液化。與此相對，由本發(fā)明的制備方法得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠1-5中，凝膠的液化為35％-25％。由此可以認(rèn)為由本發(fā)明得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠漿的抗酶解性(透明質(zhì)酸酶抗性)高，可在生物體內(nèi)長時間保持凝膠結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，在酸性或堿性條件下將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物攪拌混合。
2.權(quán)利要求1所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，混合物在供給交聯(lián)反應(yīng)之前的存儲彈性模量G’(頻率1Hz)為15000Pa以上。
3.權(quán)利要求1或2所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，在不物理性切斷該混合物中的透明質(zhì)酸高分子鏈的條件下進行攪拌混合。
4.權(quán)利要求3所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，通過自轉(zhuǎn)-公轉(zhuǎn)式混合裝置將該混合物攪拌混合。
5.權(quán)利要求3所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，通過面包面團攪拌裝置或搗年糕裝置將該混合物攪拌混合。
6.權(quán)利要求3所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，通過人工手揉捏將該混合物攪拌混合。
7.權(quán)利要求1～6中任一項所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，該混合物中的交聯(lián)劑濃度為0.02-1W/V％。
8.權(quán)利要求1～6中任一項所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，相對于透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元，該混合物中的交聯(lián)劑濃度為0.02～2W/W％。
9.權(quán)利要求1～8中任一項所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的制備方法，其特征在于，交聯(lián)劑選自二乙烯基砜、1，4-丁二醇·二縮水甘油醚和乙二醇·二縮水甘油醚。
全文摘要
本發(fā)明提供可以簡便地制備交聯(lián)劑含量少且顯示優(yōu)異的粘彈性的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的新制備方法。其特征在于，在酸性或堿性條件下將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物攪拌混合。
文檔編號C08L5/00GK101056891SQ200580038760
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者橫川佳浩, 岡隆史, 森雄一郎, 上野則夫 申請人:株式會社資生堂