專利名稱：編碼磺基轉(zhuǎn)移酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的負(fù)責(zé)將糖脂中的糖的硫酸鹽化的磺基轉(zhuǎn)移酶，編碼從人細(xì)胞分離的所述的酶的基因，利用表達(dá)載體生產(chǎn)磺基轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明還涉及利用反義DNA或反義RNA控制磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)的方法和利用合成的低聚核苷酸探針或引物，以及抗體或它的片段檢測(cè)磺基轉(zhuǎn)移酶的方法。
最近幾年，已知是復(fù)合碳水化合物的細(xì)胞膜上的分子的糖鏈成份如糖蛋白和糖脂的各種生理學(xué)功能已經(jīng)引起人們的關(guān)注。與糖鏈結(jié)合的硫酸基團(tuán)與各種生物學(xué)功能相關(guān)。硫酸基團(tuán)以各種結(jié)合方式與粘蛋白，粘多糖和糖脂的糖鏈結(jié)合，以及通過酯鍵和病毒糖蛋白，糖蛋白激素，底層膜糖蛋白，粘液霉菌溶酶體酶，等等的糖鏈結(jié)合。但是，它的生物學(xué)意義仍然有待闡明。
已知各種不同底物特異性的磺基轉(zhuǎn)移酶。例如，作用于糖蛋白的磺基轉(zhuǎn)移酶包括加硫酸基團(tuán)到N-糖苷型糖鏈的半乳糖的3-位置[生物化學(xué)雜志，264(6)，3364-3371(1989)]的，加硫酸基團(tuán)到N-糖苷型糖鏈的N-乙酰氨基葡糖的6-位置[生物化學(xué)雜志，319，209-216(1996)]的，加硫酸基團(tuán)到粘蛋白糖鏈的N-乙酰半乳糖胺的3-位置[糖生物學(xué)，5(7)，689-697(1995)]的，加硫酸基團(tuán)到粘蛋白糖鏈的N-乙酰氨基葡糖的3-位置[生物化學(xué)雜志，270(46)，27544-27550(1995)]的，和加硫酸基團(tuán)到腦垂體中產(chǎn)生的糖蛋白激素糖鏈的N-乙酰氨基葡糖的4-位置[生物化學(xué)雜志，266(26)，17142-17150(1991)]的磺基轉(zhuǎn)移酶。
作用于氨基葡聚糖(粘多糖)的磺基轉(zhuǎn)移酶包括加硫酸基團(tuán)到乙酰肝素硫酸鹽的艾杜糖醛酸的2-位置[生物化學(xué)雜志，271(13)，7645-7653(1996)]，加硫酸基團(tuán)到乙酰肝素硫酸鹽的N-硫酸化氨基葡萄糖的6-位置[生物化學(xué)雜志，270(8).4172-4179(1995)]，加硫酸基團(tuán)到肝素的艾杜糖醛酸的2-位置和N-硫酸化氨基葡萄糖的6-位置[生物化學(xué)雜志，269(40)，24538-24541(1994)]，加硫酸基團(tuán)到乙酰肝素硫酸鹽的N-硫酸化氨基葡萄糖的3-位置[生物化學(xué)雜志，271(43)，27072-27082(1996)]，作用于乙酰肝素硫酸鹽的N-硫酸化[生物化學(xué)雜志263(5)，2417-2422(1988)]，作用于肝素的N-硫酸化[生物化學(xué)雜志，266(13)，8044-8049(1991)]，加硫酸基團(tuán)到硫酸軟骨素的N-乙酰半乳糖胺和硫酸角質(zhì)素的半乳糖的6-位置和加硫酸基團(tuán)到硫酸軟骨素的N-乙酰半乳糖胺的4-位置[生物化學(xué)雜志，268，(29)，21968-21974(1993)，和僅作用于角膜硫酸角質(zhì)素[生物化學(xué)雜志，259，(19)，11771-11776(1984)]的磺基轉(zhuǎn)移酶。
除了本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶，已知通過加硫酸基團(tuán)到葡糖苷酸的3-位置[生物化學(xué)雜志，268(1)，330-336(1993)]參與被單克隆抗體HNK-1識(shí)別的糖鏈的合成的磺基轉(zhuǎn)移酶作用于糖脂。
在這些磺基轉(zhuǎn)移酶中，已知起源于大鼠肝臟的參與肝素糖鏈的合成的N-磺基轉(zhuǎn)移酶[N-乙酰肝素硫酸鹽磺基轉(zhuǎn)移酶，生物化學(xué)雜志，267(22)，15744-15750(1992)]，起源于MST細(xì)胞的參與肝素糖鏈的合成的N-磺基轉(zhuǎn)移酶[N-脫酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶，生物化學(xué)雜志，269(3)，2270-2276(1994)]，起源于雞胚軟骨細(xì)胞的通過轉(zhuǎn)移硫酸基團(tuán)到N-乙酰半乳糖胺的C-6位置參與軟骨素糖鏈的合成的酶[軟骨素6-磺基轉(zhuǎn)移酶，生物化學(xué)雜志，270(31)，18575-18580(1995)]作用于已經(jīng)被克隆的復(fù)合碳水化合物。
本發(fā)明人純化了3’-磷酸腺苷酸-5’-磷酸硫酸鹽GalCer磺基轉(zhuǎn)移酶[EC 2.8.2.11]，一種加硫酸基團(tuán)到半乳糖的3-位置的羥基上的磺基轉(zhuǎn)移酶，它來(lái)自人腎癌細(xì)胞系(SMKT-R3)[生物化學(xué)雜志，119(3)，421-427(1996)]。所述磺基轉(zhuǎn)移酶在人腎癌組織或其細(xì)胞系中高水平表達(dá)，它的水平與腎癌細(xì)胞中硫酸化糖脂的積累有關(guān)。盡管這一事實(shí)暗示了該酶和癌癥的關(guān)系，但該酶的氨基酸序列仍有待測(cè)定，其基因仍有待克隆。
在過去對(duì)已知磺基轉(zhuǎn)移酶的工業(yè)利益的生產(chǎn)的嘗試中，由于該酶的低天然豐度并且與其它酶如蛋白酶和硫酸酯酶共同存在，通過簡(jiǎn)單的方法和大量地以純化形式分離所需要的磺基轉(zhuǎn)移酶非常困難。
所以需要利用基因工程技術(shù)克隆磺基轉(zhuǎn)移酶基因和低耗高純度生產(chǎn)磺基轉(zhuǎn)移酶的方法。雖然如上所述，有克隆磺基轉(zhuǎn)移酶基因的報(bào)道，但可得到的報(bào)道的數(shù)量很少。同時(shí)因?yàn)榇嬖诖罅康牟煌孜锾禺愋缘幕腔D(zhuǎn)移酶，利用一種上面提到的磺基轉(zhuǎn)移酶基因獲得另一種不同底物特異性的磺基轉(zhuǎn)移酶的基因的嘗試遇到的困難是由于不同底物特異性的酶之間的低基因同源性而難于獲得所需要的磺基轉(zhuǎn)移酶基因。此外，由于作用于糖脂糖鏈的磺基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列和基因結(jié)構(gòu)仍然未知，難于用基因工程手段克隆和生產(chǎn)這樣的磺基轉(zhuǎn)移酶。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供編碼在腎細(xì)胞中特定表達(dá)，在腎癌細(xì)胞中以高水平特定表達(dá)和作用于糖脂的糖鏈的磺基轉(zhuǎn)移酶的基因。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供生產(chǎn)高純度磺基轉(zhuǎn)移酶的方法，該酶是利用導(dǎo)入含有前面所述的基因的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體的遺傳工程方法得到的。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供前面所述的基因編碼的多肽。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供與本發(fā)明的基因或其一部分互補(bǔ)的反義DNA和反義RNA。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供與本發(fā)明的基因特異地雜交的合成低聚核苷酸探針或引物。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供與多肽特異結(jié)合的抗體或其片段。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供純化的磺基轉(zhuǎn)移酶。
從下面的敘述中能明了本發(fā)明的這些和其它目的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種編碼具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離基因，該多肽通過作用于以Galβ1-R為代表的糖鏈特異地將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到Gal的C-3-位置的羥基基團(tuán)上，其中Gaa代表半乳糖；R代表碳水化合物，類脂或復(fù)合糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的方法，該方法包括步驟培養(yǎng)導(dǎo)入本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)化體和從得到的培養(yǎng)物中收集具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及被本發(fā)明的基因編碼的具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與本發(fā)明的多肽特異結(jié)合的抗體或其片段。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及純化的磺基轉(zhuǎn)移酶，該酶作用于以Galβ1-R為代表的糖鏈，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，類脂或復(fù)合糖，以便特異地轉(zhuǎn)移硫酸基團(tuán)到Gal的C-3-位置的羥基基團(tuán)上。


圖1以圖譜顯示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的最適pH；圖2以圖譜顯示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度；圖3以圖譜顯示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定pH；和圖4以圖譜顯示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定溫度。
如本文所述，術(shù)語(yǔ)“具有通過作用于以Galβ1-R，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，類脂或復(fù)合糖，為代表的糖鏈將硫酸基團(tuán)特異地轉(zhuǎn)移到Gal的C-3-位置的羥基基團(tuán)上的磺基轉(zhuǎn)移酶活性”(下文中也稱為“具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性”)是指具有下面作用和底物特性的特征的特性。具有這樣的磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽包括那些具有下面物理化學(xué)特性的多肽，生物化學(xué)雜志，119(3)，421-427(1996)給出了一個(gè)例子。
1.作用作用于以Galβ1-R為代表的糖鏈，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，類脂或復(fù)合糖，以便特異地轉(zhuǎn)移硫酸基團(tuán)到Gal的C-3-位置的羥基基團(tuán)上。
2.底物特異性與半乳糖基神經(jīng)酰胺(GalCer)，乳糖神經(jīng)酰胺(LacCer)，半乳糖1-烷基-2-酰基甘油(GalAAG)，半乳糖二?；视?GalDG)，葡糖神經(jīng)酰胺(GlcCer)，神經(jīng)酰胺四己糖苷(Gb4Cer)，gangliotriaosyl神經(jīng)酰胺(Gg3Cer)，gangliotetraosyl神經(jīng)酰胺(Gg4Cer)和neolactotetraosyl神經(jīng)酰胺(nLc4Cer)反應(yīng)，與神經(jīng)酰胺三己糖苷(Gb3Cer)，半乳糖和乳糖不反應(yīng)。
3.最適pH和穩(wěn)定pH最適pH約為7.0，穩(wěn)定pH是6.0-8.0。
4.最適溫度和穩(wěn)定溫度最適溫度約為37℃，穩(wěn)定溫度高達(dá)80℃。
5.分子量在還原條件下SDS-PAGE測(cè)定，約為54kDa。
用根據(jù)分析生化，182，9-15(1989)敘述的方法稍微修改的方法可以測(cè)定磺基轉(zhuǎn)移酶的活性。具體地說(shuō)，制備了50μl反應(yīng)混合物，其中包括溶于5nmolGalCer，0.5μmol，MnCl2，1nmol[35S]PAPS(100cpm/pmol)，0.5mgLubrolPX，12.5nmol/二硫蘇糖醇，0.25μmol NaF，0.1μmol ATP，20μgBSA和25mM二甲胂酸鈉-HCl(pH65)中的20ng酶蛋白。在37℃溫育混合物30分鐘后，加入1ml氯仿/甲醇/水(30∶60∶8)終止反應(yīng)。用DEAE-葡聚糖凝膠A-25分離反應(yīng)產(chǎn)物，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。將一單位的活性定義為每分鐘轉(zhuǎn)移1μmol硫酸基團(tuán)的酶量。如果反應(yīng)產(chǎn)物顯示不低于1×10-7毫單位的如這一方法所測(cè)定的活性，那么判定產(chǎn)物具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”指編碼具有上述磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因，或含有所述基因的基因。具體地說(shuō)，本發(fā)明的基因的例子是編碼含有序列表的SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的多肽或其一部分的基因和含有序列表的SEQ ID NO2所示的核苷酸序列或其一部分的基因。甚至編碼含有部分SEQID NO1所示的氨基酸序列的多肽的基因或含有部分SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的基因也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們編碼具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。這些是起源于人腎癌細(xì)胞系SMKT-R3的3’-磷酸腺苷酸-5’-磷酸硫酸鹽GalCer磺基轉(zhuǎn)移酶[EC2.8.2.11]的基因，但本發(fā)明并不局限于它們。任何基因，甚至起源于微生物，如細(xì)菌，酵母，絲狀真菌，子囊菌和擔(dān)子菌，植物，和動(dòng)物以及其它人組織的基因都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們編碼具有同樣的磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，本發(fā)明還包括上述編碼具有相同磺基轉(zhuǎn)移酶活性功能的多肽的基因的突變體。例如，任何編碼由于序列表的SEQID NO1所示的氨基酸序列的一個(gè)到幾個(gè)氨基酸殘基的缺失，疊加，插入或替代產(chǎn)生的多肽的基因都包括在本發(fā)明的基因中，只要它們編碼具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。簡(jiǎn)要地說(shuō)，不僅那些從天然源分離的基因而且人工制備的基因都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們編碼具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
同時(shí)，那些編碼能與本發(fā)明的基因在嚴(yán)格條件下雜交，并具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如本文所述術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下”意指，例如下面所示的條件。具體地說(shuō)，溫育在50℃在含有0.5％SDS，5×Denhardt’s[Denhardt’s＝0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙烯基吡咯烷酮，0.1％Ficoll 400]和100μg/ml的鮭精子DNA的6×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)中進(jìn)行4小時(shí)。
在本發(fā)明中，重組DNA是基因工程技術(shù)得到的DNA，含有本發(fā)明的基因。
在本發(fā)明中，表達(dá)載體是通過插入上述重組DNA構(gòu)建的載體以便它在所需的寄主細(xì)胞中表達(dá)。摻入下面敘述的反義DNA的載體也包括在本發(fā)明的表達(dá)載體中。被插入的載體可以是質(zhì)粒載體或噬菌體載體。有用的質(zhì)粒載體包括，但不限于，pUC18，pUC19，pBluescript，pT7和其它商業(yè)可獲得產(chǎn)品；有用的噬菌體載體包括，但不限于，λgt10和λgt11λ噬菌體載體和其它商業(yè)可獲得產(chǎn)品。寄主細(xì)胞包括微生物，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞，可根據(jù)所用的表達(dá)載體適當(dāng)選擇。
在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化體是通過在上述寄主細(xì)胞中導(dǎo)入上述表達(dá)載體得到的細(xì)胞，它表達(dá)本發(fā)明的基因。
通過例如分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，T.Maniatis et al.，eds.，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1982，pp249-254敘述的方法可以完成表達(dá)載體的導(dǎo)入。其次，為了選擇表達(dá)所需基因的轉(zhuǎn)化體，利用了表達(dá)載體的特性。例如，當(dāng)質(zhì)粒載體是pBluescript并且寄主細(xì)胞是大腸桿菌時(shí)，通過選擇在含有氨芐青霉素的平板上選擇具有氨芐青霉素抗性的菌落，或在含有氨芐青霉素，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的平板上選擇具有氨芐青霉素抗性的白色菌落來(lái)分離摻入外源基因的菌落。
本發(fā)明提供從在表達(dá)本發(fā)明的基因和生產(chǎn)所述基因編碼的多肽的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體得到的培養(yǎng)物中生產(chǎn)具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的方法。
如果確認(rèn)了所需磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，通過使轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基組成，培養(yǎng)基pH，培養(yǎng)溫度，所用誘導(dǎo)物的量和時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)期和表達(dá)磺基轉(zhuǎn)移酶的其它條件最佳化，就可以有效地生產(chǎn)磺基轉(zhuǎn)移酶。
利用已知的方法可以從轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物中純化磺基轉(zhuǎn)移酶。當(dāng)轉(zhuǎn)化體在細(xì)胞內(nèi)積累表達(dá)產(chǎn)物，如在大腸桿菌，那么在完成培養(yǎng)后離心收集轉(zhuǎn)化體，然后用超聲波或諸如此類方法破碎，接著離心等等，以便產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞提取物。通過普通蛋白質(zhì)純化方法，如鹽析，凝膠過濾，和疏水，親和和其它各種層析法，可以從所述的提取物中純化所需的磺基轉(zhuǎn)移酶。在某些寄主-載體系統(tǒng)的情況中，表達(dá)產(chǎn)物分泌到轉(zhuǎn)化體外。在這種情況下，可以用上述同樣方法從培養(yǎng)物的上清液中純化所述酶。
對(duì)于某些寄主-載體系統(tǒng)的情況中，在轉(zhuǎn)化體中表達(dá)的多肽以不溶物質(zhì)積累(內(nèi)含體)。在這種情況下，可以回收不溶物質(zhì)并在溫和條件下溶解如變性處理，例如脲溶解，接著去除變性，恢復(fù)原始活性。
雖然寄主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的外源磺基轉(zhuǎn)移酶與各種內(nèi)源磺基轉(zhuǎn)移酶共存，但由于它的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過內(nèi)源磺基轉(zhuǎn)移酶的量，它的純化非常容易。同時(shí)，當(dāng)磺基轉(zhuǎn)移酶分泌到轉(zhuǎn)化體外時(shí)，培養(yǎng)基成份等是共同存在的，但它們通常差不多沒有干擾磺基轉(zhuǎn)移酶純化的蛋白質(zhì)成份，一個(gè)有利的方面是與從SMKT-R3細(xì)胞純化磺基轉(zhuǎn)移酶相比，它的純化不需要費(fèi)力的分離過程。
對(duì)于真核細(xì)胞起源的磺基轉(zhuǎn)移酶的情況，酶本身具有糖鏈。在這樣的情況，利用不能生物合成糖鏈的宿主細(xì)胞，例如，原核細(xì)胞，如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌或放線菌類，或失去糖鏈生物合成能力的突變酵母，真菌，動(dòng)物，昆蟲或植物細(xì)胞，生產(chǎn)具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性但沒有糖鏈的多肽。此外，可以將糖鏈添加到酶本身。在這樣的情況下，利用能生物合成糖鏈的寄主細(xì)胞，例如，酵母，真菌，動(dòng)物，昆蟲或植物細(xì)胞，可以生產(chǎn)具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性并具有糖鏈的多肽。
本發(fā)明的多肽是被本發(fā)明的上述基因編碼的多肽，并具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性，那些具有上述各種物理-化學(xué)特性的即是例子。具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽的例子是具有SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列的天然存在的磺基轉(zhuǎn)移酶多肽或含有其一部分的多肽，和由于SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的缺失，疊加，插入或替代產(chǎn)生的多肽。
在本發(fā)明中，將“反義DNA”和“反義RNA”定義為具有與本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因或其一部分互補(bǔ)的核苷酸序列并通過與該基因形成雙鏈結(jié)構(gòu)抑制或調(diào)節(jié)從內(nèi)源磺基轉(zhuǎn)移酶基因(基因組DNA和mRNA)表達(dá)基因信息(轉(zhuǎn)錄，翻譯)。反義DNA或反義RNA的長(zhǎng)度是可以根據(jù)核苷酸序列的特異性和導(dǎo)入細(xì)胞的方法而變化。通過利用合成儀，以相反于正常方向的方向(反義方向)表達(dá)基因，或諸如此類的人工合成可以制備反義DNA或反義RNA。例如，已知有大量的反義技術(shù)，包括用tat基因[核酸研究，19，3359-3368(1991)]或rev基因[美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)程，86，4244-4248(1989)]抑制HIV繁殖。通過這些方法，和利用本發(fā)明的反義DNA或反義RNA，可以抑制或調(diào)節(jié)內(nèi)源磺基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)。也可以將本發(fā)明的反義DNA或反義RNA用作實(shí)驗(yàn)室原位雜交等的試劑。
在本發(fā)明中，合成的低聚核苷酸探針或引物是與上述基因特異雜交的核苷酸。通過利用合成儀的人工合成方法或PCR方法通?？梢灾苽渌龅牡途酆塑账崽结樆蛞?。
在本發(fā)明中，任何抗體，單克隆的或多克隆的，或其片段，只要能與本發(fā)明的多肽特異結(jié)合都能滿足目的。通過例如，John Wiley和Sons，Inc.，1992出版的免疫學(xué)，John E. Coligan，ed.，的現(xiàn)有方案敘述的方法，利用本發(fā)明的整個(gè)或部分多肽免疫接種兔，鼠或其它動(dòng)物可以容易地制備本發(fā)明的抗體。在純化后，可以用肽酶等處理該抗體以便生產(chǎn)抗體片段。得到的抗體或其片段的用途包括親和層析，cDNA文庫(kù)篩選，和藥學(xué)，診斷試劑和研究試劑。
下文通過來(lái)自泌尿?qū)W研究，17，317-324(1989)敘述的SMKT-R3，人腎癌細(xì)胞系的磺基轉(zhuǎn)移酶的例子對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)的描述。
通過生物化學(xué)雜志，119(3)，421-427(1996)(該公開物引入本文作為參考)，敘述的方法，首先大量培養(yǎng)SMKT-R3細(xì)胞得到本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離和純化磺基轉(zhuǎn)移酶。具體地說(shuō)，本發(fā)明的純化磺基轉(zhuǎn)移酶是通過下面敘述的方法生產(chǎn)的。
收集用EGF處理的SMKT-R3細(xì)胞(約1×1010個(gè)細(xì)胞)，用PBS洗滌，儲(chǔ)存于-80℃直到使用。使用時(shí)，融化2.5×109個(gè)細(xì)胞，懸浮于等體積的TBS，用Potter型勻漿器簡(jiǎn)單地勻漿。用等體積的2×溶解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl2，2mM β-巰基乙醇，2％Lubrol PX，40％甘油，0.5mM氟化苯甲砜，和0.02mM E-64)補(bǔ)充到勻漿并在冰上聲處理10分鐘。在離心后，將得到的上清液在緩沖液A(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，10％甘油，和5mMMnCl2)中透析。
離心透析物質(zhì)除去透析過程中出現(xiàn)的沉淀。將上清液加到DE-52柱上，柱的出口直接與用緩沖液B(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，10％甘油，和5mM MnCl2)平衡過的肝素-瓊脂糖CL6B柱相連。然后用緩沖液B洗柱直到流出物在280nm處的吸光值小于0.02。在脫離DE-52柱后，用溶于緩沖液C(20mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.1％Lubrol PX，20％甘油，和10mMMnCl2)的0.2M NaCl洗脫在肝素-瓊脂糖CL6B柱上的酶。
合并肝素-瓊脂糖層析的酶活性餾分，并在緩沖液B中透析。將滲析液加到用緩沖液B平衡過的半乳糖基鞘氨醇(CalSph)-瓊脂糖柱上。然后用緩沖液B洗柱直到洗脫液基本無(wú)蛋白，用含有0.1M NaCl的緩沖液C洗脫磺基轉(zhuǎn)移酶。
合并GalSph-瓊脂糖上的洗脫餾分，并在含有10％甘油的10mM三乙醇胺-HCl(pH7.0)中透析并加到直接與用緩沖液D(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，和10％甘油)平衡過的HiTrap3’，5’-二磷酸腺苷酸(PAP)柱相連的PLP-瓊脂糖柱上。用緩沖液D和緩沖液B連續(xù)洗柱直到洗出液基本無(wú)蛋白，然后用緩沖液D中的0-0.3mM PAP的線性梯度洗脫磺基轉(zhuǎn)移酶。
合并HiTrap PAP層析的酶活性餾分，直接在用緩沖液D平衡過的肝素-瓊脂糖柱上進(jìn)行第二次層析。在用緩沖液D洗柱后，用含有0.3M NaCl的緩沖液C以0.3ml的每個(gè)餾分洗脫本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶。通過這一步，酶制劑被濃縮到約為起始體積的五分之一，并且在無(wú)逆流餾分中回收包含于前面的層析得到的酶制劑中的PAP。合并純化的酶活化餾分并在存在20％甘油時(shí)儲(chǔ)存于-80℃。
然后，獲取純化的磺基轉(zhuǎn)移酶的部分氨基酸序列的信息。為了測(cè)定部分氨基酸序列，用Edman分解方法[生化雜志，256，7990-7997(1981)將磺基轉(zhuǎn)移酶直接用于氨基酸序列儀(蛋白質(zhì)序列儀476A，Appl ied Biosystems生產(chǎn))以測(cè)定磺基轉(zhuǎn)移酶中10-20個(gè)N-末端的氨基酸殘基?？商娲?，可以通過高底物特異性的蛋白酶，例如，無(wú)色桿菌蛋白酶I或N-對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶的作用有限水解磺基轉(zhuǎn)移酶，通過反相HPLC分離和純化得到的肽片段，在這之后，對(duì)純化的肽片段進(jìn)行氨基酸序列分析，有效地測(cè)定需要的氨基酸序列。
在本發(fā)明中，測(cè)定了七個(gè)肽片段的氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)，P2(SEQID NO4).P3(SEQ ID NO5)，P4(SEQ ID NO11)，P5(SEQ ID NO12)，P6(SEQ IDNO13)和P7(SEQ ID NO14)。
在這樣測(cè)定的部分氨基酸序列的基礎(chǔ)上，克隆本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因。為此，利用了通常使用的PCR方法或雜交方法。根據(jù)PCR技術(shù)，Erhich，HA，ed.，Stockton出版社出版，1989敘述的方法可以完成PCR方法。根據(jù)例如，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989年出版的分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，T.Maniatis et al.，eds.敘述的方法可以完成雜交方法。
但是，用下面的使用混合引物(SEQ ID NO22-27)(MOPAC方法)的PCR方法，使用含有肌苷的混合引物(SEQ ID NO28-33)的MOPAC方法或使用合成的低聚核苷酸(SEQ ID NO22和24)的雜交方法不能克隆本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因。1)使用混合引物的PCR方法(MOPAC方法)這一克隆方法包括選擇測(cè)定的氨基酸序列中兩個(gè)低簡(jiǎn)并性的區(qū)域，合成所有簡(jiǎn)并密碼子的可能的核苷酸序列的組合，并利用它們作為混合引物通過PCR擴(kuò)增需要的DNA片段。
用這一方法，已經(jīng)克隆了編碼尿酸氧化酶的基因[科學(xué)，239，1288-1291(1988)]。
本發(fā)明人曾試圖用這一方法獲得本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶。制備了各種合成的低聚核苷酸根據(jù)部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)合成的低聚核苷酸S1(SEQID NO22)和A1(SEQ ID NO23)，根據(jù)部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO4)合成的低聚核苷酸S2(SEQ ID NO24)和A2(SEQ ID NO25)，根據(jù)部分氨基酸序列P3(SEQ ID NO5)合成的低聚核苷酸S3(SEQ ID NO26)和A3(SEQ ID NO27)。利用這些合成的低聚核苷酸作為混合引物，用SMKT-R3細(xì)胞cDNA作為模板通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR。
用瓊脂糖凝膠電泳分離得到的PCR產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)大量的DNA片段已經(jīng)得到擴(kuò)增，將它們每個(gè)從凝膠上切下，萃取，摻入質(zhì)粒載體，在這之后用常規(guī)方法(雙脫氧鏈終止方法)測(cè)定它的核苷酸序列，雖然發(fā)現(xiàn)了用作混合引物的合成低聚核苷酸的核苷酸序列，但沒有發(fā)現(xiàn)類似來(lái)自所需的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的序列。
2)使用肌苷的MOPAC方法這一方法與上面項(xiàng)目1)敘述的方法相同，所不同的是使用了由用肌苷替代高簡(jiǎn)并性的密碼子的第三個(gè)堿基以減少混合引物的組合的數(shù)目[核酸研究，16(22)，10932(1988)]得到的引物。
制備了各種合成的低聚核苷酸根據(jù)部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)的合成的低聚核苷酸SI1(SEQ ID NO28)和AI1(SEQ ID NO29)，根據(jù)部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO4)的合成的低聚核苷酸SI2(SEQ ID NO30)和AI2(SEQ IDNO31)，和根據(jù)部分氨基酸序列P3(SEQ ID NO5)的合成的低聚核苷酸SI3(SEQID NO32)和AI3(SEQ ID NO33)。利用這些合成的低聚核苷酸作為含有肌苷的混合引物，用SMKT-R3細(xì)胞作模板通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR。
用相同于上面的方法測(cè)定得到的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，但沒有發(fā)現(xiàn)類似于來(lái)自所需基因的序列雖然發(fā)現(xiàn)了用作含有肌苷的混合引物的合成低聚核苷酸的核苷酸序列。
3)使用合成的低聚核苷酸的雜交方法另一個(gè)通常使用的方法包括通過在氨基酸序列信息基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成的低聚核苷酸克隆所需的DNA，和用常規(guī)方法與此進(jìn)行雜交。本發(fā)明人曾試圖用該方法檢測(cè)本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因。
從部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)和P2(SEQ ID NO4)分別制備推測(cè)的合成低聚核苷酸S1(SEQ ID NO22)和S2(SEQ ID NO24)，并用作噬菌斑雜交的探針。用常規(guī)方法將SMKT-R3細(xì)胞的cDNA插入噬菌體載體以便生成cDNA文庫(kù)。將用這一cDNA文庫(kù)感染的大腸桿菌散布于平板；將得到的每個(gè)噬菌斑影印在尼龍膜上。在常規(guī)使用的條件下進(jìn)行雜交。
結(jié)果是，在兩種合成低聚核苷酸S1和S2用作探針的情況中檢測(cè)到大量的陽(yáng)性噬菌斑。用常規(guī)方法測(cè)定這些陽(yáng)性噬菌斑的噬菌體載體中的插入DNA的核苷酸序列。雖然得到了同源于一個(gè)用作探針的合成的低聚核苷酸的核苷酸序列的序列，沒有發(fā)現(xiàn)類似于所需磺基轉(zhuǎn)移酶基因的序列；從噬菌體載體中的DNA插入物的核苷酸序列測(cè)定的氨基酸序列與上面提到的部分氨基酸序列沒有同源性。
如上所述，從SMKT-R3細(xì)胞的cDNA克隆本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因是非常困難的。由于聚合酶反應(yīng)的抑制，非特異性退火，或諸如此類而在PCR方法中擴(kuò)增了非特異DNA片段似乎是磺基轉(zhuǎn)移酶基因由于高G+C含量而采用二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)的結(jié)果。考慮到這些方面，本發(fā)明人做了廣泛的研究，試圖用PCR方法擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于已知氨基酸序列的一個(gè)肽片段的短基因片段。
優(yōu)選的是將PCR方法的引物設(shè)計(jì)為含有肌苷以減少混合的引物組合的數(shù)目，和更優(yōu)選的是對(duì)于亮氨酸選擇經(jīng)常使用的密碼子，和通過提供大量的絲氨酸密碼子的組合減少核苷酸序列的簡(jiǎn)并性后合成引物。因此擴(kuò)增部分本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因是可能的。其次，本發(fā)明人用這一擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為探針進(jìn)行Southern雜交，并成功地在得到的非特異的DNA片段中發(fā)現(xiàn)了起源于所需的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的DNA片段。
更具體地說(shuō)，根據(jù)部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)新制備合成的低聚核苷酸1Sd(SEQ ID NO6)和1A(SEQ ID NO7)作為PCR方法的引物，用SMKT-R3細(xì)胞的cDNA作模板進(jìn)行PCR。
用例如，雙脫氧鏈終端方法[美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)程，74(12)，5463-5467(1977)]測(cè)定得到的每個(gè)PCR產(chǎn)物的核苷酸序列；發(fā)現(xiàn)了編碼部分氨基酸序列P1的核苷酸序列，即，得到了所需要的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的一部分。根據(jù)這一核苷酸序列，制備合成的低聚核苷酸OP1(SEQ ID NO8)，并用常規(guī)方法標(biāo)記3’末端，用作雜交的探針。
同時(shí)，分別根據(jù)部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO4)和P3(SEQ ID NO5)新制備合成的低聚核苷酸2Sa(SEQ ID NO9)和3A(SEQ ID NO10)作為PCR方法的引物，用SMKT-R3細(xì)胞cDNA作模板進(jìn)行PCR。
用瓊脂糖凝膠電泳分離得到的PCR產(chǎn)物，之后用常規(guī)方法[冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1989年出版的分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，T.Maniatis etal.，eds.]將它影印到尼龍膜上，接著用3’末端標(biāo)記的合成的低聚核苷酸OP1雜交。如上所述，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，用適用于標(biāo)記物的檢測(cè)方法檢測(cè)與所述探針雜交的DNA片段。
結(jié)果是，在對(duì)應(yīng)于約600bp位置得到與合成的低聚核苷酸OP1雜交的帶。用同樣于上面的方法測(cè)定該片段的核苷酸序列；發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于磺基轉(zhuǎn)移酶的部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)和P4(SEQ ID NO11)的序列，證明得到了所需的磺基轉(zhuǎn)移酶基因部分。
單獨(dú)地，制備了起源于SMKT-R3細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。用冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1989年出版的分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，T.Maniatiset al.，eds.，第八章敘述的方法可以制備cDNA文庫(kù)。
此外，通過用上述約600bpDNA片段作探針篩選起源于SMKT-R3細(xì)胞的上述cDNA文庫(kù)，可以克隆編碼磺基轉(zhuǎn)移酶的全長(zhǎng)基因。同時(shí)，通過篩選起源于SMKT-R3細(xì)胞的基因組DNA文庫(kù)，也可以得到本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶的基因組DNA。
這樣得到的人腎癌細(xì)胞系SMKT-R3細(xì)胞產(chǎn)生的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的整個(gè)核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO2所示的序列，而整個(gè)氨基酸序列是序列表的SEQ ID NO1所示的序列。同時(shí)，該氨基酸序列和核苷酸序列是新序列，缺乏與任何已知的不同底物特異性的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的同源性。
由于本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的整個(gè)核苷酸序列已經(jīng)闡明，利用本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的全部或部分作為雜交的探針，通過篩選起源于除了SMKT-R3細(xì)胞的有機(jī)體的基因組DNA或cDNA，或基因組DNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)可以克隆與本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因高度同源的DNA。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，可以設(shè)計(jì)用于PCR的引物。利用這一引物，可以檢測(cè)與來(lái)自起源于除了SMKT-R3細(xì)胞的基因組DNA或cDNA，或基因組DNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)的本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因高度同源的DNA片段，或獲得全長(zhǎng)基因。
為了證實(shí)是否得到的基因是編碼具有所需的磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因，分別根據(jù)測(cè)定的核苷酸序列或測(cè)定的氨基酸序列與本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列或氨基酸序列的同源性進(jìn)行估計(jì)是可能的。另外，在用上述方法得到該基因產(chǎn)物后，用上述測(cè)定方法測(cè)定磺基轉(zhuǎn)移酶的活性；如果活性不低于1×10-7毫單位，判定該基因編碼了本發(fā)明的多肽。
為了生產(chǎn)具有同樣的磺基轉(zhuǎn)移酶活性的功能相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物，可以利用下面的方法。通過在本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因中導(dǎo)入隨機(jī)突變或位點(diǎn)特異性突變，得到了在天然存在的磺基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列中引起一個(gè)到幾個(gè)氨基酸殘基的缺失，疊加，插入或替代的基因。從而可能得到編碼具有與天然存在的磺基轉(zhuǎn)移酶相同活性但具有稍微不同特性，如最適溫度，穩(wěn)定溫度，最適pH和穩(wěn)定pH的磺基轉(zhuǎn)移酶的基因，并用基因工程生產(chǎn)這樣的磺基轉(zhuǎn)移酶。
隨機(jī)突變的方法包括，例如，化學(xué)DNA處理方法，其中通過亞硫酸氫鈉的作用引起易位突變[美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)程，79，1408-1412(1982)]將胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)換成尿嘧啶堿基，生化方法，其中在存在[α-S]dNTP時(shí)在雙鏈合成的過程中引起堿基取代[基因，64，313-319(1588)]，根據(jù)PCR的方法，其中在存在加到反應(yīng)系統(tǒng)的錳時(shí)進(jìn)行PCR以致減弱核苷酸摻入的精確度[分析生化，224，347-353(1995)]。
已知的位點(diǎn)特異性誘變方法，例如，琥珀樣突變基礎(chǔ)上的方法[豁口雙聯(lián)方法，核酸研究，12，(24)，9441-9456(1984)]，利用限制酶位點(diǎn)的方法[分析生化，200，81-88(1992)；基因，102，67-70(1991)]，dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖基化酶)突變基礎(chǔ)上的方法[Kunkel方法，美國(guó)國(guó)立科學(xué)院進(jìn)程，82，488-492(1985)]，利用DNA聚合酶和DNA連接酶的琥珀樣突變基礎(chǔ)上的方法[低聚核苷酸指導(dǎo)的雙重琥珀(ODA)方法，基因152，271-275(1995)]，和利用兩種加入限制酶識(shí)別位點(diǎn)的誘變引物進(jìn)行的PCR基礎(chǔ)上的方法(USP5,512,463)。
同樣，利用商業(yè)途徑獲得的試劑盒，可以容易地引入位點(diǎn)特異性突變。商業(yè)途徑獲得的試劑盒的例子包括基于缺口豁口雙聯(lián)體方法的MutanR-G(TakaraShuzo生產(chǎn))，基于Kunkel方法的MutanR-K(Takara Shuzo生產(chǎn))，基于ODA方法的MutanR-Express Km(Takara Shuzo生產(chǎn))，利用誘變引物和起源于激烈熱球菌的DNA聚合酶的QuikChangTM位點(diǎn)特異性的誘變?cè)噭┖?STRATAGENE生產(chǎn))。PCR基礎(chǔ)的方法還包括Takara LA-PCR體外誘變式劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))和MutanR-Super Express Km(Takara Shuzo生產(chǎn))。
如上所述，本發(fā)明闡明了起源于人腎癌細(xì)胞系SMKT-R3的磺基轉(zhuǎn)移酶的初級(jí)結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)，以及允許通過基因工程手段低成本高純度地生產(chǎn)具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的方法。
此外，將與本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因特異地雜交的合成的低聚核苷酸探針或引物用于本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶基因的研究，檢測(cè)，擴(kuò)增等等。與本發(fā)明的多肽或其片段特異地結(jié)合的抗體可用于本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶的研究，檢測(cè)，純化，等等。
偶爾，通過利用編碼具有本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因的基因技術(shù)制備的本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶具有下面的最適pH，最適溫度，穩(wěn)定pH，和穩(wěn)定溫度，對(duì)于生化雜志，119(3)，421-427(1996)公開的天然磺基轉(zhuǎn)移酶，得到同樣的表示如下的結(jié)果。
(1)最適pH如圖1所示，本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的最適pH約是6-8，在這一范圍內(nèi)獲得最高活性。
(2)最適溫度如圖2所示，本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度在40℃左右，在這一溫度獲得最大活性。
(3)穩(wěn)定pH如圖3所示，本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定pH是6-10。
(4)穩(wěn)定溫度如圖4所示，本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定溫度是在30℃時(shí)顯示穩(wěn)定，而在40℃處理30分鐘后失去了85％的酶活性。
實(shí)施例下面的實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1從SMKT-R3細(xì)胞純化磺基轉(zhuǎn)移酶收集用50ng/ml的EGF處理12到24小時(shí)的SMKT-R3細(xì)胞，用PBS洗滌，儲(chǔ)存于-80℃直到使用。使用時(shí)，凍融2.5×109個(gè)細(xì)胞，懸浮于等體積的TBS中，用Potter型勻漿器簡(jiǎn)單地勻漿。用等體積的2×溶解緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.4，10mM MgCl2，2mM β-巰基乙醇，2％Lubrol PX，40％甘油，0.5mM氟化苯甲砜，和0.02mM E-64)補(bǔ)充到勻漿，并在冰上聲處理10分鐘，在100,000×g離心1小時(shí)后，在緩沖液A(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，10％甘油，和5mM MnCl2)中透析得到的上清液過夜。
在10,000×g離心透析物質(zhì)30分鐘除去透析過程中出現(xiàn)的沉淀。在沉淀中沒有檢測(cè)到磺基轉(zhuǎn)移酶活性。將上清液加到出口直接與用緩沖液B(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，10％甘油，和5mM MnCl2)平衡過的肝素-瓊脂糖CL6B柱(2×10cm，Pharmacia Biotech生產(chǎn))連接的DE-52柱(3×20cm，Whatman生產(chǎn))上。然后用緩沖液B以40ml/小時(shí)的流速洗柱直到在280nm處流出物的吸光值小于0.02。在脫離DE-52柱后，用溶解于緩沖液C(20mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.1％Lubrol PX，20％甘油，和10mM MnCl2)中的0.2M NaCl洗脫肝素-瓊脂糖CL6B柱上的酶。
合并肝素-瓊脂糖層析中的酶活性餾分并在緩沖液B中透析。將滲析液以5ml/小時(shí)的流速加到用緩沖液B平衡過的GalSph-瓊脂糖柱(1×10cm，Pharmacia Biotech生產(chǎn))上。然后用緩沖液B洗柱直到洗脫液基本無(wú)蛋白并用含有0.1M NaCl的緩沖液C洗脫磺基轉(zhuǎn)移酶。
合并Ga lSph-瓊脂糖上的洗脫餾分，并在含有10％甘油的10mM三乙醇胺-HCl(pH7.0)中透析并以5ml/小時(shí)的流速加到直接與用緩沖液D(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，和10％甘油)平衡過的HiTrapPAP柱(5ml床體積，Pharmacia Biotech生產(chǎn))相連的PLP-瓊脂糖柱(1×10cm，PhaemaciaBiotech)上。用緩沖液D和緩沖液B連續(xù)洗柱直到洗脫液基本無(wú)蛋白，然后用緩沖液D中的0-0.3mM PAP的線性梯度洗脫磺基轉(zhuǎn)移酶。
合并HiTrap PAP層析的酶活性餾分，直接在用緩沖液D平衡過的肝素-瓊脂糖柱(0.3cm床體積)上進(jìn)行二次層析。在用緩沖液D洗柱后，用含有0.3MNaCl的緩沖液C以0.3ml的餾分洗脫本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶。通過這一步，酶制劑被濃縮到約為起始體積的五分之一，并且在無(wú)逆流餾分中回收包含于前面的層析得到的酶制劑中的PAP。合并純化的酶活性餾分并在存在20％甘油時(shí)儲(chǔ)存于-80℃。如下面實(shí)施例2的描述進(jìn)行測(cè)定，純化的酶的比活性為1.2單位./mg。
實(shí)施例2純化的磺基轉(zhuǎn)移酶的作用，底物特異性和物理-化學(xué)特性如分析生化182，9-15(1989)所述，經(jīng)稍微修改測(cè)定實(shí)施例1得到的磺基轉(zhuǎn)移酶的活性。反應(yīng)混合物含有5nmol GalCer，0.5μmol MnCl2，1nmol[35S]PAPS(100cpm/pmol)，0.5mg Lubrol PX，12.5nmol二硫蘇糖醇，0.25μmolNaF，0.1μmol ATP，20μg BSA，和溶解于25mM二甲胂酸鈉-HCl的酶蛋白，pH6.5，總體積50μl。在測(cè)試底物特異性的實(shí)驗(yàn)中，使用25nmol的測(cè)試糖脂替代5nmol GalCel作受體。在37℃溫育30分鐘后，用1ml的氯仿/甲醇/水(30∶60∶8)終止反應(yīng)。在DEAE-瓊脂糖A-25柱上分離反應(yīng)產(chǎn)物，并用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。用空白值校正該值，空白值是利用沒有受體的上述反應(yīng)混合物得到的。將一個(gè)單位的活性定義為在上面提到的測(cè)定條件下每分鐘轉(zhuǎn)移1μmol硫酸的酶量。
表1
如表1測(cè)定，在使用條件下，GalCer是最好的，LacCer是第二好的受體。一定程度上GalAAG和GalDG也可作為受體。純化的磺基轉(zhuǎn)移酶確實(shí)作用于GlcCer，Gb4Cer，Gg3Cer，Gg4Cer，和nLc4cer，雖然與對(duì)GalCer的活性相比，相對(duì)活性小于10％，但不作用于Gb3Cer。
本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶的其它特性包括NaCl濃度高達(dá)0.1M時(shí)增強(qiáng)磺基轉(zhuǎn)移酶活性，但高濃度時(shí)抑制活性，和對(duì)于GalCer和PAPS，純化的磺基轉(zhuǎn)移酶的表觀的Km值分別為27和25μM。在pH6.5和7.2之間時(shí)酶顯示最大活性。可以在存在20％甘油時(shí)將純化的酶儲(chǔ)存于-80℃，至少3個(gè)月活性沒有可檢測(cè)的損失。
根據(jù)Laemmli的方法[自然學(xué)227，680-685(1970)]對(duì)本發(fā)明的純化的磺基轉(zhuǎn)移酸進(jìn)行SDS-PAGE。在用含有5％β-巰基乙醇的樣品緩沖液處理純化酶的情況下，顯示了—個(gè)分子量約為54kDa的單—蛋白帶。
實(shí)施例3磺基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆(1)構(gòu)建cDNA文庫(kù)從上述SMKT-R3細(xì)胞系[泌尿?qū)W研究，17，317-324(1989)]中，提取總RNA[分析生化，162，156-159(1987)]，之后，用OligotexTM-dT30(Takara Shuzo生產(chǎn))純化poly(A)+RNA。用SUPERSCRIPTM選擇系統(tǒng)(LiftTechnologies生產(chǎn))，從純化的poly(A)+RNA合成雙鏈cDNA。將得到的雙鏈cDNA與EcoRI銜接子(Life Technologies生產(chǎn))結(jié)合。將這一cDNA片段與預(yù)先用限制酶EcoRI消化的λgt10噬菌體載體(Pharmacia Biotech生產(chǎn))連接，之后，用Ready-To-GoTMλ包裝試劑盒(Pharmacia Biotech生產(chǎn))進(jìn)行體外包裝以便生產(chǎn)起源于SMKT-R3細(xì)胞系的λgt10 cDNA文庫(kù)。
(2)磺基轉(zhuǎn)移酶的部分氨基酸序列的測(cè)定將10微克實(shí)施例1中純化的磺基轉(zhuǎn)移酶溶解于含有6M鹽酸胍的1mMEDTA溶液(1ml)中。在加入2μl 2-巰基乙醇后，在測(cè)試管中充滿氮并封口，然后在37℃溫育2小時(shí)還原。然后加入10微升4-乙烯基吡啶，之后，在測(cè)試管中充滿氮并封口，在37℃溫育2小時(shí)S-吡啶乙基化。
用反相HPLC(RP-HPLC)[系統(tǒng)Waters 625LC，Millipore生產(chǎn)；柱Cosmosil 5C4-AR-300，4.6×50mm，Nacalai Tesque生產(chǎn)；流速0.4ml/min；洗脫液A0.1％三氟醋酸溶液(IFA)；洗脫液B含有0.1％TFA的70％乙腈；洗脫從使用樣品開始55分鐘期間在0％到70％的洗脫液B的線性密度梯度上進(jìn)行]純化這樣得到的吡啶乙基化酶蛋白。
將純化的S-吡啶乙基化酶蛋白(約2μg/ml)溶解于400μl含有3M脲的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)并用0.3μg賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(Wako Pure化學(xué)工業(yè)生產(chǎn))在37℃消化12小時(shí)。
用RP-HPLC從得到的消化物中分離純化肽片段[系統(tǒng)130A型，Applied Biosystems生產(chǎn)；柱OD-300C，Aquapore，7μm，1.0×250mm，Applied Biosystems生產(chǎn)；流速0.1ml/min；洗脫液A0.1％TFA溶液；洗脫液B70％含有0.1％TFA的乙腈，洗脫從使用樣品開始85分鐘期間在0％到70％的洗脫液B的線性密度梯度上進(jìn)行]。
用氣相Edman分解通過常規(guī)方法將這樣分離的肽片段用于氨基酸序列儀(492型蛋白質(zhì)序列儀，Applied Biosystems生產(chǎn))測(cè)序測(cè)定部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)，P2(SEQ ID NO4)，P3(SEQ ID NO5)，P4(SEQ IDNO11)，P5(SEQ ID NO12)，P6(SEQ ID NO13)和P7(SEQ ID NO14)。
(3)引物的合成從上述(2)項(xiàng)測(cè)定的部分氨基酸序列制備合成的核苷酸(392型DNA合成儀，Applied Biosystems生產(chǎn))以便生產(chǎn)合成的核苷酸引物根據(jù)部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO3)的合成的核苷酸1Sa(SEQ ID NO15)，1Sb(SEQ IDNO16)，1Sc(SEQ ID NO17)，1Sd(SEQ ID NO6)和1A(SEQ ID NO7)，根據(jù)部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO4)的合成的核苷酸2Sa(SEQ ID NO9)，2Sb(SEQ IDNO18)，2Aa(SEQ ID NO19)，和2Ab(SEQ ID NO20)，和根據(jù)部分氨基酸序列P3(SEQ ID NO5)的合成的核苷酸3S(SEQ ID NO21)和3A(SEQ ID NO10)。
合成的低聚核苷酸引物1Sa，1Sb，1Sc，1Sd，2Sa，2Sb，和3S是有意義方向的引物，而合成低聚核苷酸引物1A，2Aa，2Ab，2A和3A是反義方向的引物。
為了防止雜交過程中引物相互結(jié)合，在合成所有低聚核苷酸時(shí)用脫氧肌苷替代堿基。在密碼子簡(jiǎn)并性超過2的位置用脫氧肌苷替代。對(duì)于編碼絲氨酸殘基的部分，制備了兩類密碼子TCX和AG(T/C)的引物組合。
(4)用RT-PCR方法篩選磺基轉(zhuǎn)移酶基因在20μl含有從SMKT-R3細(xì)胞提取的2μg poly(A)+RNA，40pmol寡聚(dT)12-18引物(Life Technologies生產(chǎn))，0.25mM(每種)dNTP，50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)，75mM氯化鉀，3mM氯化鎂，10mM二硫蘇糖醇和200單位的起源于莫洛尼氏鼠白細(xì)胞病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶[SUPERSCRIPTTMII RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶，Life Technologies生產(chǎn)]的反應(yīng)系統(tǒng)中，在37℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1小時(shí)。用4μl這一反應(yīng)混合物的等分試樣作模板，在50μl含有100pmol每種上述合成的低聚核苷酸引物(有意義方向引物和反義方向引物)，0.25mM(每種)dNTP混合物，10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)，50mM氯化鉀，1.5mM氯化鎂和1.25單位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer生產(chǎn))(RT-PCR)的反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行PCR。通過以94℃30秒(變性)，45-55℃30秒(引物退火)和72℃1-2分鐘(合成反立)的順序處理重復(fù)35個(gè)循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)。
在這次PCR之后，將全部反應(yīng)混合物在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。然后從凝膠上切下一個(gè)DNA片段，并亞克隆進(jìn)pT7Blue載體(Novagen生產(chǎn))。用Taq DNA聚合酶通過二脫氧鏈終止方法測(cè)定這些DNA片段的核苷酸序列[Dye終止循環(huán)測(cè)序試劑盒，Perkin Elmer生產(chǎn)；373A型DNA序列儀，AppliedBiosystems生產(chǎn)]。
用有意義方向的合成的低聚核苷酸引物1Sa，1sB，1Sc和1Sd和反義方向的合成的低聚核苷酸引物1A首先進(jìn)行RT-PCR，導(dǎo)致擴(kuò)增了來(lái)自1Sd和1A的組合的47bp cDNA片段和來(lái)自2Sa和3A的組合的約600bp cDNA片段。
在這些cDNA片段中，將47bp cDNA片段亞克隆并進(jìn)行核苷酸序列分析；從測(cè)定的核苷酸序列推測(cè)的氨基酸序列與部分氨基酸序列P1一致。
接著，根據(jù)47bp cDNA片段的核苷酸序列合成混合低聚核苷酸OP1(SEQ IDNO8)，利用毛地黃毒苷(DIG)低聚核苷酸加尾試劑盒(Boehringer Mannheim生產(chǎn))用終端轉(zhuǎn)移酶以DIG標(biāo)記它的3’末端。
用DIG標(biāo)記的混合低聚核苷酸OP1作探針，對(duì)如上所述通過RP-PCR擴(kuò)增的約600bp cDNA片段進(jìn)行Southern印跡雜交。
首先，在1.5％瓊脂糖凝膠上對(duì)RT-PCR得到的約600bp cDNA片段進(jìn)行電泳。之后，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Boehr inger Mannheim生產(chǎn))。利用這一尼龍膜，在55℃在含有2pmol/ml DIG標(biāo)記的混合低聚核苷酸OP1，5×SSC，2％封閉劑(Boehringer Mannheim生產(chǎn))，0.1％N-月桂酰肌氨酸和0.02％SDS的溶液中進(jìn)行雜交。利用DIG發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim生產(chǎn))完成檢測(cè)。
結(jié)果是，OP1探針與用合成的低聚核苷酸引物2Sa和3A通過RT-PCR擴(kuò)增的約600bp的cDNA片段雜交。
將該約600bp的cDNA片段亞克隆并進(jìn)行核苷酸序列分析；在該約600bp的cDNA片段中發(fā)現(xiàn)了編碼部分氨基酸序列P1和P4的序列。
(5)含有磺基轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA片段的克隆為了分離來(lái)自實(shí)施例3(1)制備的起源于SMKT-R3細(xì)胞系的λgt10 cDNA文庫(kù)的cDNA克隆，通過噬菌斑雜交進(jìn)行篩選。
利用實(shí)施例3(3)中得到的約600bp cDNA片段作模板，用T7 RNA聚合酶合成預(yù)先DIG標(biāo)記(DIG RNA標(biāo)記試劑盒，Boehringer Mannheim生產(chǎn))的RNA探針。
混合約2×105個(gè)重組λ噬菌體和大腸桿菌LE392，在10個(gè)矩形平板(9×13cm)的每個(gè)平板上形成2×104個(gè)噬菌斑。將得到的噬菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer Mannheim生產(chǎn))上。在4℃溫育膜1小時(shí)，在堿性條件(0.5NNaOH，1.5M NaCl，5分鐘)下變性并且隨后中和(在含有1.5M NaCl的0.5MTris-HCl緩沖液(pH7.4)中，3分鐘，兩次；然后在2×SSC，2分鐘，一次)。在含有每cm2膜上1ng毛地黃毒苷標(biāo)記的RNA探針，50％甲酰胺，5×SSC，2％封閉劑(Boehr inger Mannheim生產(chǎn))，0.1％N-月桂酰肌氨酸，和0.02％SDS的雜交緩沖液中與尼龍膜在50℃進(jìn)行雜交過夜。利用DIG發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。從陽(yáng)性噬菌斑中挑出六個(gè)λ噬菌體克隆并通過EcoRI消化將插入的cDNA亞克隆進(jìn)pBluescript載體(Stratagene生產(chǎn))。
結(jié)果是，得到了具有最大約1.8bp長(zhǎng)度的cDNA片段的質(zhì)粒并命名為pBS-hCST1。測(cè)定它的核苷酸序列；發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼含有432個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的開放讀碼框架(ORF)。這一ORF含有部分氨基酸序列儀測(cè)定的上述純化磺基轉(zhuǎn)移酶的全部氨基酸序列。
根據(jù)上述結(jié)果，測(cè)定了磺基轉(zhuǎn)移酶基因的全部核苷酸序列和初級(jí)結(jié)構(gòu)。序列表的SEQ ID NO2顯示了編碼磺基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，而序列表的SEQ IDNO1表示了由此編碼的氨基酸序列。
實(shí)施例4表達(dá)磺基轉(zhuǎn)移酶多肽的質(zhì)粒的構(gòu)建用限制酶EcoRI消化實(shí)施例3得到的質(zhì)粒pBS-hCST1；將得到的DNA片段插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pSVK3(Pharmacia Biotech生產(chǎn))的EcoRI位點(diǎn)。根據(jù)限制酶切割圖譜測(cè)定DNA插入方向。將插入方向相反的兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pSV-hCST和pSV-hCSTR。
在這些質(zhì)粒中，將pSV-hCST轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。已經(jīng)將此命名為大腸桿菌JM109/pSV-hCST的轉(zhuǎn)化體以登記號(hào)大腸桿菌JM109/pSV-hCST FERM BP-5811保存于國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部，國(guó)立生物科學(xué)和人技術(shù)研究院。
實(shí)施例5在COS-1細(xì)胞中表達(dá)重組磺基轉(zhuǎn)移酶基因用1μg表達(dá)質(zhì)粒pSV-hCST或pSV-hCSTR和5μl LipofectamineTM(LifeTechnologies生產(chǎn))轉(zhuǎn)染在35mm直徑的盤中預(yù)培養(yǎng)1天的2×105個(gè)COS-1細(xì)胞(ATCC CRL 1650)。在37℃溫育72小時(shí)后，用冷TBS(20mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH7.4)洗滌得到的轉(zhuǎn)化COS-1細(xì)胞兩次，用硅刮刀(Falcon生產(chǎn))和0.2ml含有0.1％Triton X-100的TBS收獲，在冰上聲處理破碎細(xì)胞，通過離心回收上清液。
結(jié)果測(cè)定用pSV-hCST轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞的細(xì)胞提取液組分的特異活性是1.8×10-5U/mg(蛋白質(zhì))，是作為對(duì)照的導(dǎo)入了pSVK3的COS-1細(xì)胞的細(xì)胞提取液組分的活性的16倍的水平，和約為用pSV-hCSTR轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞的細(xì)胞提取液組分的活性的8倍。
其次，檢測(cè)了用pSV-hCST轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞是否表達(dá)硫酸脂。在Lab-Tek室滑板(Nunc Inc.生產(chǎn))上用1μg pSV-hCST和1μl Lipofectamine轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞(1×104)。在37℃溫育48小時(shí)后，用PBS(pH7.4)洗滌轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞，在溶解于PBS(pH7.4)的1％多聚甲醛中固定，用溶解于PBS(pH7.4)的1％BSA封閉，用抗-硫酸脂單克隆抗體，Sulph1[生化雜志，251，17-22(1988)]溫育，接著用與FITC共軛的山羊-鼠IgG抗體(Zymed實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))溫育。每次溫育時(shí)間為45分鐘。在Vectashield裝置培養(yǎng)基(載體實(shí)驗(yàn)室產(chǎn))中裝置標(biāo)記細(xì)胞，并用熒光和相顯微鏡觀察。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在用pSV-hCST轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞中，細(xì)胞表面被免疫熒光染色，而未轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞完全沒有染色，證明磺基轉(zhuǎn)移酶具有在轉(zhuǎn)化COS-1細(xì)胞中合成硫酸脂的活性。
實(shí)施例6重組磺基轉(zhuǎn)移酶的物理-化學(xué)特性在冰上聲處理實(shí)施例5中得到的轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞以破碎細(xì)胞。根據(jù)生化雜志119(3)，421-427(1996)敘述的方法利用離心破碎細(xì)胞得到的上清液作為重組磺基轉(zhuǎn)移酶的酶溶液以便測(cè)定它的物理-化學(xué)特性。結(jié)果如下。
(1)最適pH如圖1所示本發(fā)明的磺基轉(zhuǎn)移酶的最適pH約為6-8，在此范圍內(nèi)得到最大活性。換句話說(shuō)，圖1是表示本發(fā)明重組磺基轉(zhuǎn)移酶的最適pH圖，其中縱坐標(biāo)表示相對(duì)活性(％)，橫坐標(biāo)表示pH。下面的緩沖液用于下面測(cè)定相對(duì)活性的相關(guān)的pH范圍pH3.0-6.050mM乙酸鹽緩沖液；pH6.0-7.050mM二甲胂酸鹽緩沖液；pH7.0-8.050mM三乙醇胺緩沖液；和pH8.0-10.050mM tris緩沖液。
在圖中，實(shí)心方塊標(biāo)記是指乙酸鹽緩沖液，實(shí)心圓形標(biāo)記是指二甲胂酸鹽緩沖液，實(shí)心三角標(biāo)記是三乙醇胺緩沖液，和×標(biāo)記是tris緩沖液。
(2)最適溫度如圖2所示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度約為40℃，在此溫度得到最大活性。換句話說(shuō)，圖2是表示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度的圖，其中縱坐標(biāo)表示相對(duì)活性(％)，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)溫度(℃)。
(3)穩(wěn)定pH通過測(cè)定在6℃在相關(guān)的pH保持16小時(shí)，然后回到pH7.0得到的每種本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的酶活性對(duì)穩(wěn)定pH進(jìn)行評(píng)估。下面的緩沖液用于下面每個(gè)相關(guān)的pH范圍以便測(cè)定殘留的活性pH3.0-6.050mM乙酸鹽緩沖液；pH6.0-7.050mM二甲胂酸鹽緩沖液；pH7.0-8.050mM三乙醇胺緩沖液；和pH8.0-10.050mM tris緩沖液。
如圖3所示在6-10的pH范圍內(nèi)本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶是穩(wěn)定的。換句話說(shuō)，圖3是顯示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定pH的圖，其中縱坐標(biāo)表示殘留的活性(％)，橫坐標(biāo)表示pH。在圖中，實(shí)心方塊標(biāo)記是乙酸鹽緩沖液，實(shí)心圓形標(biāo)記是二甲胂酸鹽緩沖液，實(shí)心三角標(biāo)記是三乙醇胺緩沖液，和×標(biāo)記是tris緩沖液。
(4)穩(wěn)定溫度對(duì)本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定溫度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30℃重組磺基轉(zhuǎn)移酶是穩(wěn)定的，但如圖4所示在40℃處理30分鐘時(shí)失去了85％的活性。換句話說(shuō)，圖4是表示本發(fā)明的重組磺基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定溫度的圖，其中縱坐標(biāo)表示殘留活性(％)，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)溫度(℃)。
序列表(1)總的資料(iii)序列數(shù)33(2)SEQ ID N01的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度423個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Leu Pro Pro Gln Lys Lys Pro Trp Glu Ser Met Ala Lys Gly1 5 10 15Leu Val Leu Gly Ala Leu Phe Thr Ser Phe Leu Leu Leu Val Tyr20 25 30Ser Tyr Ala Val Pro Pro Leu His Ala Gly Leu Ala Ser Thr Thr35 40 45Pro Glu Ala Ala Ala Ser Cys Ser Pro Pro Ala Leu Glu Pro Glu50 55 60Ala Val Ile Arg Ala Asn Gly Ser Ala Gly Glu Cys Gln Pro Arg65 70 75Arg Asn Ile Val Phe Leu Lys Thr His Lys Thr Ala Ser Ser Thr80 85 90Leu Leu Asn Ile Leu Phe Arg Phe Gly Gln Lys His Arg Leu Lys95 100 105Phe Ala Phe Pro Asn Gly Arg Asn Asp Phe Asp Tyr Pro Thr Phe110 115 120Phe Ala Arg Ser Leu Val Gln Asp Tyr Arg Pro Gly Ala Cys Phe125 130 135Asn Ile Ile Cys Asn His Met Arg Phe His Tyr Asp Glu Val Arg140 145 150Gly Leu Val Pro Thr Asn Ala Ile Phe Ile Thr Val Leu Arg Asp155 160 165Pro Ala Arg Leu Phe Glu Ser Ser Phe His Tyr Phe Gly Pro Val170 175 180Val Pro Leu Thr Trp Lys Leu Ser Ala Gly Asp Lys Leu Thr Glu185 190 195Phe Leu Gln Asp Pro Asp Arg Tyr Tyr Asp Pro Asn Gly Phe Asn200 205 210Ala His Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Phe Phe Asp Leu Gly Tyr Asp215 220 225Asn Ser Leu Asp Pro Ser Ser Pro Gln Val Gln Glu His Ile Leu
230 235 240Glu Val Glu Arg Arg Phe His Leu Val Leu Leu Gln Glu Tyr Phe245 250 255Asp Glu Ser Leu Val Leu Leu Lys Asp Leu Leu Cys Trp Glu Leu260 265 270Glu Asp Val Leu Tyr Phe Lys Leu Asn Ala Arg Arg Asp Ser Pro275 280 285Val Pro Arg Leu Ser Gly Glu Leu Tyr Gly Arg Ala Thr Ala Trp290 295 300Asn Met Leu Asp Ser His Leu Tyr Arg His Phe Asn Ala Ser Phe305 310 315Trp Arg Lys Val Glu Ala Phe Gly Arg Glu Arg Met Ala Arg Glu320 325 330Val Ala Ala Leu Arg His Ala Asn Glu Arg Met Arg Thr Ile Cys335 340 345Ile Asp Gly Gly His Ala Val Asp Ala Ala Ala Ile Gln Asp Glu350 355 360Ala Met Gln Pro Trp Gln Pro Leu Gly Thr Lys Ser Ile Leu Gly365 370 375Tyr Asn Leu Lys Lys Ser Ile Gly Gln Arg His Ala Gln Leu Cys380 385 390Arg Arg Met Leu Thr Pro Glu Ile Gln Tyr Leu Met Asp Leu Gly395 400 405Ala Asn Leu Trp Val Thr Lys Leu Trp Lys Phe Ile Arg Asp Phe410 415 420Leu Arg Trp(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1269個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型由mRNA獲得的cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2ATGCTGCCAC CGCAGAAGAA GCCCTGGGAG TCCATGGCTA AGGGGCTGGT GCTGGGCGCG 60CTCTTCACTA GTTTCCTGCT GCTGGTGTAC TCCTATGCCG TGCCCCCGCT GCATGCCGGC120CTGGCCTCCA CGACCCCGGA GGCCGCAGCG TCCTGCTCTC CACCTGCACT CGAGCCAGAG180GCAGTGATCC GGGCCAACGG CTCGGCGGGG GAGTGCCAGC CGCGGCGCAA CATCGTGTTC240TTGAAGACGC ACAAGACGGC CAGCAGCACC CTGCTCAACA TCCTGTTCCG CTTCGGCCAG300AAGCACCGGC TCAAGTTCGC CTTCCCTAAC GGCCGCAATG ACTTCGACTA CCCGACCTTC360TTCGCCCGCA GCCTGGTGCA GGACTATCGG CCCGGGGCCT GCTTCAACAT CATCTGCAAC420CACATGCGCT TCCACTACGA CGAGGTGCGC GGCCTGGTGC CGACCAACGC CATCTTCATC480ACGGTGCTCC GCGACCCCGC CCGCTTGTTC GAGTCCTCCT TCCACTACTT CGGGCCGGTG540GTGCCCCTCA CGTGGAAGCT CTCGGCCGGC GACAAGCTGA CCGAGTTCCT GCAAGACCCG600GATCGCTACT ACGACCCCAA CGGCTTCAAT GCCCACTACC TCCGAAACCT GCTCTTCTTC660GACCTGGGCT ATGACAACAG CCTGGACCCC AGCAGCCCGC AGGTGCAGGA GCACATCCTG720GAGGTGGAGC GTCGCTTCCA CCTGGTGCTC CTTCAAGAGT ACTTCGACGA GTCGCTGGTG780CTGCTGAAGG ACCTGCTGTG CTGGGAGCTG GAGGACGTGC TCTACTTCAA GCTCAACGCC840CGCCGCGACT CGCCCGTGCC GCGGCTCTCG GGGGAGCTGT ATGGGCGCGC CACCGCCTGG900AACATGCTGG ACTCCCACCT CTACCGCCAC TTCAACGCCA GCTTCTGGCG CAAGGTGGAG960GCCTTCGGGC GGGAGCGCAT GGCCCGCGAG GTGGCCGCCC TGCGCCATGC CAACGAGCGC 1020ATGCGGACCA TCTGCATCGA CGGGGGCCAC GCCGTGGACG CCGCCGCCAT CCAGGACGAG 1080GCCATGCAGC CCTGGCAGCC GCTGGGCACC AAGTCCATCC TGGGCTACAA CCTCAAGAAG 1140AGCATCGGGC AGCGGCACGC GCAGCTCTGC CGGCGCATGC TCACGCCCGA GATCCAGTAC 1200CTGATGGACC TCGGCGCCAA CCTGTGGGTC ACCAAGCTCT GGAAGTTCAT TCGCGATTTC 1260CTGCGGTGG1269(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO3Thr Ala Ser Ser Thr Leu Leu Asn Ile Leu Phe Arg Phe Gly Gln Lys1 51015Lys(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO4Lys Pro Trp Glu Ser Met Ala Lys1 5(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO5Ser Ile Leu Gly Tyr Asn Leu Lys1 5(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征
(D)其它資料位置3，6和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO6ACNGCNAGYA GYACNCT(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置6和12的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO7TTYTGNCCRA ANCGRAA(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度47個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO8TTCTGGCCRA AGCGGAACAG GATGTTGAGC AGCGTRCTRC TCGCCGT(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置6，9和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO9AARCCNTGNG ARTCNATGG(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置6，15和18的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO10TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)L可結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO11Leu Ser Ala Gly Asp Lys1 5(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO12Leu Asn Ala Leu Asn Asp Xaa Pro Val1 5(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO13His Arg Leu Lys1(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO14Phe Ile Leu Asp Phe Leu Glu Xaa1 5(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置3，6，9，12和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO15ACNGCNTCNT CNACNCT(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置3，6，12和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO16ACNGCNAGYT CNACNCT(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)
(ix)特征(D)其它資料位置3，6，9和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO17ACNGCNTCNA GYACNCT(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置6和9的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO18AARCCNTGNG ARAGYATGG(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置2，8，14和17的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO19TNGCCATNGA YTCNCANGG(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置2，14和17的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO20TNGCCATRCT YTCNCANGG(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置6，15和18的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO21TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO21AAYATYYTNT TYCGNTTYGG(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO23TTYTGNCCRA ANCGRAA(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO24AARCCNTGGG ARWSNATGGC(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO25TTNGCCATNS WYTCCCANGG(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO26ATYYTNGGNT AYAAYYTNAA(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO27TTNARRTTRT ANCCNARRAT(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置9和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO28AAYATYYTNT TYCGNTTYGG(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)
(ix)特征(D)其它資料位置6和12的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO29TTYTGNCCRA ANCGRAA(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置6和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO30AARCCNTGGG ARWSNATGGC(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置3，6和18的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO31TTNGCCATNS WYTCCCANGG(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置6，9和18的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO32ATYYTNGGNT AYAAYYTNAA(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(合成的DNA)(ix)特征(D)其它資料位置3，12和15的N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO33TTNARRTTRT ANCCNARRAT
權(quán)利要求
1.編碼具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離基因，該多肽通過作用于Galβ1-R為代表的糖鏈將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到Gal的C-3-位置的羥基基團(tuán)上，其中Gal代表半乳糖，R代表碳水化合物，類脂或復(fù)合糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，它編碼含有SEQ ID NO1的氨基酸序列或其一部分的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，它具有SEQ ID NO2的核苷酸序列或其一部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，它編碼含有由氨基酸序列SEQ ID NO1的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失，疊加，插入或替代得到的氨基酸序列的多肽，其中多肽具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，它在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求2-4所述的基因的任何一個(gè)雜交并編碼具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
6.含有權(quán)利要求1所述的基因的重組DNA。
7.含有權(quán)利要求6所述的重組DNA的表達(dá)載體，對(duì)于該載體，微生物，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞可用作寄主細(xì)胞。
8.導(dǎo)入權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
9.生產(chǎn)具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的方法，包括步驟培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中收集具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
10.權(quán)利要求1所述的基因編碼的具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
11.與權(quán)利要求1所述的基因或其—部分互補(bǔ)的反義DNA。
12.與權(quán)利要求1所述的基因或其一部分互補(bǔ)的反義RNA。
13.含有權(quán)利要求11所述的反義DNA的表達(dá)載體。
14.與權(quán)利要求1所述的基因特異雜交的合成的低聚核苷酸探針或引物。
15.與權(quán)利要求10所述的多肽特異結(jié)合的抗體或其片段。
16.純化的磺基轉(zhuǎn)移酶，它作用于Galβ1-R為代表的糖鏈，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，類脂或復(fù)合糖，以便將硫酸基團(tuán)特異地轉(zhuǎn)移到Gal的C-3-位置的羥基基團(tuán)上，其中所述的純化磺基轉(zhuǎn)移酶與半乳糖神經(jīng)酰胺(GalCer)，乳糖神經(jīng)酰胺(LacCer)，半乳糖1-烷基-2-?；视?GalAAG)，半乳糖二?；视?GalDG)，葡糖神經(jīng)酰胺(GlcCer)，神經(jīng)酰胺四己糖苷(Gb4Cer)，gangliotriaosyl神經(jīng)酰胺(Gg3Cer)，gangliotetraosyl神經(jīng)酰胺(Gg4Cer)和neolactotetraosyl神經(jīng)酰胺(nLc4Cer)反應(yīng)，并與神經(jīng)酰胺三己糖苷(Gb3Cer)，半乳糖和乳糖不反應(yīng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的純化的磺基轉(zhuǎn)移酶，它的最適pH約為7.0。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的純化的磺基轉(zhuǎn)移酶，它的最適溫度約為37℃。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的純化的磺基轉(zhuǎn)移酶，在還原條件下SDS-PAGE所測(cè)定，它的分子量約為54kDa。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的純化的磺基轉(zhuǎn)移酶，它起源于人腎癌細(xì)胞系SMKT-R3。
全文摘要
編碼具有磺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離基因,該多肽通過作用于Ga1β1－R為代表的糖鏈將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到Gal的C－3－位置的羥基基團(tuán)上,其中Gal代表半乳糖;R代表碳水化合物,類脂或復(fù)合糖,和生產(chǎn)該多肽的方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1188806SQ9712141
公開日1998年7月29日 申請(qǐng)日期1997年9月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月23日
發(fā)明者本家孝一 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社