專利名稱：表達(dá)牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)被膜糖蛋白的復(fù)制型不致病病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及其治療疫苗的領(lǐng)域。文獻(xiàn)資料van Zijl，M.et al，Live Attenuated Pseudorabies Virus ExpressingEnvelope Glycoprotein E1 of Hog Cholera Virus Protects Swine a-gainst both Pseudorabies and Hog Cholera，Journal of Virology，Vol.65，No.5，pp.2761-2765(1991).U.S.patent 4,703,011，Kit，M.，and Kit，S.，Thymidine Kinase Deletion Mutants of Bovine Her-pesvirus-1，issued 27 October 1987.U.S.patent 4,824,667，Kit，M.，and Kit，S.Thymidine Kinase Deletion Mutants of Bovine Her-pesvirus-1，Vaccines Against Infectious Bovine Rhinotracheitis Con-taining Same and Methods for the Production and Use of Same，issued25 April，1989.Collett，M.S.，et al.，Proteins Encoded by BcvineViral Diarrhea VirusThe Genomic Organization of a Pestivirus，Vi-rology，Vol 165 PP·200-208(1988).Collett，M.S.，et al.，Molec-ular Cloning and NucleotideSequence of the Pestivirus Bovine Viral Di-arrhea Virus，Virology，Vol.165 PP.191-199(1988).
牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是屬于黃熱病病毒(Flaviviridae)科的鼠疫病毒。它在綿羊、山羊、特別是牛中引起許多不同的癥狀。該癥狀取決于動(dòng)物的年齡，生理學(xué)和病毒學(xué)狀態(tài)。在年幼的敏感性牛犢和年幼的成體中，它引起的疾病的特征為高發(fā)病率和低死亡率。癥狀可包括發(fā)燒、抑郁，環(huán)鼻分泌液體，腹瀉及偶爾口腔潰瘍。除了這些初級(jí)影響外，該病毒也引起免疫抑制。盡管初級(jí)BVDV感染一般相當(dāng)輕微，但該病毒可能加強(qiáng)或增強(qiáng)其它協(xié)同感染微生物的致病性。
在老齡或敏感動(dòng)物中，BVDV引起與上面在年幼敏感牛犢中所述的那些癥狀相似的癥狀。另外，在妊娠動(dòng)物中，病毒具有穿過胎盤并感染胎兒的能力。該感染的后果取決于胎齡以及它是否處于其免疫系統(tǒng)具有足夠能力的階段。感染的可能后果包括胎兒重吸收，流產(chǎn)，僵化，先天缺陷，分娩缺陷，生出持續(xù)感染BVDV的牛犢，和完全正常的牛犢。出生的持續(xù)感染BCDV的牛犢體現(xiàn)了該BVDV致病復(fù)合體中最重要的部分。持續(xù)感染的動(dòng)物將大量病毒排放到其環(huán)境中，可能感染敏感動(dòng)物。而且，即使持續(xù)感染的動(dòng)物對(duì)在子宮中感染它們的病毒具有免疫耐受性，但當(dāng)被其它親緣關(guān)系密切的BVDV生物型感染時(shí)，它們也會(huì)形成疾病。這些感染的特征是發(fā)病率低(因?yàn)橄鄬?duì)來說正好在妊娠期間感染而產(chǎn)生被BVDV持續(xù)感染的正常牛犢的妊娠動(dòng)物不會(huì)有許多)，但死亡率高。該疾病綜合癥稱為粘膜疾病，并且其自身表現(xiàn)通常為極急性癥狀，牛犢死于過多的含大量鮮血的水樣腹瀉。
該病毒的重要性和其在牛群中的廣泛存在在試圖預(yù)防BVDV感染的嘗試中導(dǎo)致形成了許多疫苗。這些疫苗根據(jù)滅活或減毒的傳統(tǒng)觀念形成，但由于BVDV的特性，它們有許多明顯的缺陷。
普遍承認(rèn)滅活的疫苗制品不如減毒的活疫苗有效。來自滅活疫苗制品的滅活抗原進(jìn)行外源性加工。注射到動(dòng)物體后，抗原成為動(dòng)物可溶性蛋白成份的一部分。通過胞飲機(jī)制抗原進(jìn)入抗原呈遞細(xì)胞并通常產(chǎn)生抗體。令人遺憾的是，由于抗體不能進(jìn)入細(xì)胞，它們一般僅能在成熟病毒從細(xì)胞中釋放時(shí)打斷病毒生活史。另一方面，來自在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的活病毒的抗原進(jìn)行內(nèi)源性加工且該機(jī)制產(chǎn)生優(yōu)選的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可識(shí)別被病毒感染的細(xì)胞且具有在較早階段打斷病毒生活史的能力。因此，在對(duì)許多病毒感染的免疫防御中認(rèn)為細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答極其重要。
由于細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，因此諸如疫苗的減毒活產(chǎn)品應(yīng)誘導(dǎo)有效的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。對(duì)于BVDV，為產(chǎn)生活疫苗而對(duì)病毒的減毒通常不阻止疫苗病毒引起正常情況下與野外分離物相關(guān)的免疫抑制(Roth J.A.and Kaeberle M.L.，Suppression of Neutrophil and Lym-phocyte Function Induced by a Vaccinal Strain of Bovine Viral Diar-rhea Virus With or Without the Adninistration of ACTH，AmericamJournal of Veterinarg Research，Vol.44 PP·2366-2372(1983))。疫苗阻止免疫抑制反應(yīng)的失敗使疫苗產(chǎn)生了嚴(yán)重的缺陷。動(dòng)物擁有者可能接種動(dòng)物以使其抵抗疾病，但由于疫苗的該特性，擁有者反而給其它疫病感染動(dòng)物提供了機(jī)會(huì)。這就通使擁有者使用滅活的BVDV疫苗，但由于免疫系統(tǒng)的作用方式，該疫苗并不特別有效。
總之，滅活的疫苗安全但不特別有效，而減毒的活疫苗較有效，但在某些情況下可能不很安全。
本發(fā)明結(jié)合了減毒活疫苗的有效性和滅活疫苗的安全性。牛泡疹病毒1型(BHV—1)是另一種主要的牛病原體，它產(chǎn)生呼吸道疾病。因此，與BVDV共同的是，BHV—1也在粘膜表面復(fù)制。我們?nèi)〉昧司幋agp53的基因，gp53是BVDV病毒的主要糖蛋白，宿主對(duì)它產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，在牛泡疹病毒—1(BHV—1)中表達(dá)了該蛋白，這一重組病毒(BHV/BVDV gp53)用作抗，BVDV的疫苗。(Do-nis，R.O.and Dubovi，E.J.，Glycoproteins of BovineViral Diar-rhoea Mucosal Disease Virus in Infected Bovine Cells，Journal of Gen-eral Virology，Vol.68，pp.1607-1616(1987)和Magar，R.，et al.，Bovine Viral Diarrhea Virus ProteinsHeterogeneity of Cy-topathogenic and Noncytopathogenic Strains and Evidence of 53KGlycoprotein Neutralization Epitope，Veterinary Microbiology.Vol.16，pp.303-314.引用的參考文獻(xiàn)列入本文以供參考)。
一種用于預(yù)防由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的疾病的復(fù)制型不致病病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒包括取自BVDV病毒的基因或基因組合，所說的復(fù)制型不致病病毒在功能上可表達(dá)所說的基因或基因組合。本發(fā)明包括下列實(shí)施例一種病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒是減毒的，選自減毒的牛泡疹病毒1型(BHV—1)，減毒的腺病毒，減毒的牛乳頭炎病毒，減毒的牛乳頭狀瘤病毒，或減毒的假狂犬病病毒。一種病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒是減毒的并含有且表達(dá)下列基因的任意組合編碼gp48，gp25，p14衣殼蛋白，p20N—末端蛋白酶和p125/p80蛋白質(zhì)的基因。一種病毒，其中的減毒經(jīng)過使胸苷激酶(tk)基因失去功能來實(shí)現(xiàn)。
一種病毒，其中的信號(hào)肽在所說的牛泡疹病毒1型(BHV—1)中插入到編碼gp53的基因或基因組合的前面。一種病毒，其中所說的編碼gp53的基因插入到滅活的胸苷激酶(tk)基因位點(diǎn)。一種病毒，其中用于產(chǎn)生該病毒的在功能上表達(dá)的基因或基因組合包含具有完整病毒DNA的重組質(zhì)粒，所說的質(zhì)粒包含a)含有胸苷激酶(tk)基因且胸苷激酶(tk)基因具有缺失的BHV—1基因組DNA片段，b)插入胸苷激酶(tk)基因缺失位置的啟動(dòng)子/多聚腺苷化信號(hào)，c)位于gp53基因或基因組合之前的信號(hào)肽基因序列，將它們?nèi)坎迦氲絾?dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間。一種病毒，其中所說的質(zhì)粒由具有質(zhì)粒pHAS4特征的質(zhì)粒構(gòu)成。一種病毒，其中所說的信號(hào)肽基因序列取自任意充分鑒定的信號(hào)肽序列，如見于Perlman，D.，etal.，J.Mol.Biol.Vol.167pp.391-409(1983)(以參考文獻(xiàn)引用)的充分鑒定的39個(gè)信號(hào)肽序列例子中的任意序列。一種病毒，其中所說的信號(hào)肽基因序列取自假狂犬病病毒gIII基因(PRV)和/或中生長激素(BGH)。
一種病毒，其中的質(zhì)粒選自下列質(zhì)粒、a).pBHVtK ex-1∷BGH/p53；b)pBHVtK ex-1∷gIII/p53；c)pBHVtKex-3∷BGH/p53；或d)pBHVtKex-3∷gIII/p53。一種生產(chǎn)在功能上表達(dá)的基因或基因組合的產(chǎn)物的病毒，選自下列病毒中的一種T11—3，T11—6或T11—8。一種病毒，其中用于產(chǎn)生該病毒的在功能上表達(dá)的基因或基因組合包括具有完整病毒DNA的重組質(zhì)粒，所說的質(zhì)粒包含a)含有胸苷激酶(tk)基因和具有胸苷激酶(tk)基因缺失的BHV—1基因組DNA片段，b)在胸苷激酶(tk)基因缺失處插入的啟動(dòng)子/多聚腺苷化信號(hào)，c)在啟動(dòng)子和多聚腺苷化信號(hào)之間插入的gp53基因或基因組合。一種病毒，其中的質(zhì)粒是pBHVtK ex-3∷p53.選自下列病毒之一的病毒T2—3#3或T2—2#5。一種用于預(yù)防由牛病毒性腹瀉病毒(BDVD)引起的疾病的疫苗，包含本文所述的藥用上有效量的病毒和一種載體。
上述用于預(yù)防由牛病毒性腹瀉病毒(BDVD)引起的疾病的疫苗，包含上述藥用上有效量的病毒和一種載體，所說的載體包含任意生理緩沖介質(zhì)，即、含2.5到15％的無抗BHV抗體的血清之介質(zhì)(PH大約為7.0到7.4)。
一種免疫動(dòng)物抵抗由牛病毒性腹瀉病毒(BDVD)引起的感染性疾病的方法，包含給動(dòng)物施用本文所述的藥用上有效量的病毒或疫苗。
一種制備本文所述的病毒的方法，包括a)分離引起B(yǎng)VDV的在功能上表達(dá)的基因或基因組合，b)將所說的基因或基因組合插入到復(fù)制型不致病病毒中，c)選擇在功能上可表達(dá)所說的基因或基因組合之產(chǎn)物的活病毒。
一種制備本文所述的病毒的方法，其中用于產(chǎn)生該病毒的在功能上表達(dá)的基因或基因組合物經(jīng)過包括將質(zhì)粒與完整病毒DNA組合的方法來生產(chǎn)，所說的質(zhì)粒包含a).含有胸苷激酶(tk)基因且具有胸苷激酶(tk)基因缺失的BHV—1基因組DNA片段，b)將啟動(dòng)子/多聚腺苷酸化信號(hào)插入所說質(zhì)粒的胸苷激酶(tk)基因缺失處，c)在啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間插入gp53基因或基因組合物，d)用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生含有插入活病毒中的所說的功能性基因或基因組合物的重組病毒，該活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并表達(dá)所說的功能性基因或基因組合物。
一種制備本文所述的病毒的方法，其中用于產(chǎn)生該病毒的在功能上表達(dá)的基因或基因組合物由包括將質(zhì)粒與完整病毒DNA組合的方法來生產(chǎn)，所說的質(zhì)粒包含a)含有胸苷激酶(tk)基因且該胸苷激酶(tk)基因具有缺失的BHV—1基因組DNA片段，b)將啟動(dòng)子/多聚腺苷酸化信號(hào)插入所說質(zhì)粒的胸苷激酶(tk)基因缺失處，c)將前面帶有信號(hào)肽基因序列的gp53基因或基因組合插入啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間，d)用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生含有插入活病毒中的所說的功能性基因或基因組合物的重組病毒，該活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并表達(dá)所說的功能性基因或基因組合物。


圖1、用于將外源基因插入BHV—1的穿梭載體的構(gòu)建。
圖2、在BVDV gp53基因上加上信號(hào)肽序列的方法。
圖3、用于將gp53插入BHV—1中的5個(gè)穿梭質(zhì)粒的圖譜a.實(shí)施例1pBHVtKex-3∷p53b.實(shí)施例2pBHVtKex-1∷BGH/p53c.實(shí)施例3pBHVtKex-1∷gIII/p53d.實(shí)施例4pBHVtKex-3∷BGH/p53e.實(shí)施例5pBHVtKex-3∷gIII/p53圖4.BHV-1/gp53重組病毒預(yù)期的轉(zhuǎn)錄圖譜。
圖5.Northem印跡顯示了gp53信使RNA在BHV-1重組體中的轉(zhuǎn)錄。
圖6.免疫沉淀顯示了gp53蛋白質(zhì)在BHV-1重組體中的表達(dá)。
下面所用的全部術(shù)語是本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于理解的。在許多處，裝置或試劑的廠商名稱在命名的裝置或試劑后的圓括號(hào)中提供。通常使用的術(shù)語，試劑和緩沖液，如“質(zhì)?！?，“Klenow片段”，“再連接鈍末端”，“Tris”，螯合緩中液，如EDTA和EGTA，以及通常使用的色譜柱在提及時(shí)不作進(jìn)一步的解釋。
在對(duì)用于本發(fā)明的化合物的構(gòu)建的描述中，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)并在此簡要命名或描述。這些技術(shù)的詳細(xì)解釋可見標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，如“Molecular Cloninga Laboratory Manual”(1989)，Sam-brook，et，al.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork，或“Current Protocols in Molecwlar Biology”(l991)，Ausubel，F(xiàn).M.，et.al.，eds.，Wiley Interscience，New York.
本發(fā)明結(jié)合了減毒活疫苗的有效性和滅活疫苗的安全性。我們獲取了編碼pg53的基因，它是BVDV病毒的主要糖蛋白，針對(duì)該蛋白宿主可產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，在牛泡疹病毒—1(BHV)中表達(dá)該蛋白，該重組病毒(BHV/BVDV pg53)用作抗BVDV的疫苗。
牛泡疹病毒(BHV)是產(chǎn)生呼吸疾病的另一類主要的牛病原體。因此，與BVDV相同的是，BHV也在粘膜表面復(fù)制。對(duì)于BVDV，復(fù)制主要在消化道粘膜界面，在呼吸道界面的復(fù)制較少。對(duì)于BHV，在呼吸道界面的復(fù)制占優(yōu)勢(shì)。共同的粘膜免疫系統(tǒng)保證了在一個(gè)表面產(chǎn)生的免疫反應(yīng)在其它表面仍具有效力。因此，本發(fā)明的重組病毒BHV/BVDV gp53在給奶牛、綿羊或山羊施用時(shí)(優(yōu)選經(jīng)過鼻內(nèi)途經(jīng))，在呼吸道粘膜進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
BVDV gp53基因在BHV中表達(dá)前，使用已知的方法使BHV病毒的胸苷激酶基因缺失以減毒病毒。BHV(一種活的減毒病毒)可復(fù)制并產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。作為復(fù)制過程的一部分，還會(huì)表達(dá)BVDV pg53基因，由于病毒在細(xì)胞內(nèi)，用于針對(duì)重組病毒BVDVgp53部分的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)之正確加工也會(huì)發(fā)生。最重要的是，該反應(yīng)的發(fā)生沒有可能引起免疫抑制的副作用，因?yàn)閮H存在一部分BVDV病毒。因此，本發(fā)明結(jié)合了BVDV減毒活病毒疫苗的有效性和滅活制品的安全性。
方法部分所提供的實(shí)施例只用于解釋的目的，不是為了以任何方式限制本發(fā)明的范圍。所有的介質(zhì)和緩沖溶液都在玻璃蒸餾水中配制，除非另有說明。組合物和用藥本發(fā)明的藥用有效量的疫苗可以與藥用上可接受的載體或稀釋劑一起使用，作為在動(dòng)物，如牛、綿羊或山羊中抗BHV-1和BVDV的疫苗。
在本發(fā)明中有用的藥用上可接受的載體或稀釋劑的例子包括任何生理緩沖介質(zhì)，即、pH大約為7.0至7.4，含大約2.5至15％血清，血清中不含抗BHV抗體(即BHV血清陰性)。不含γ球蛋白的血清優(yōu)于含γ球蛋白的血清。本發(fā)明中所使用的血清的例子包括胎牛血清，羔羊血清，馬血清，豬血清，和山羊血清。含量從大約0.5至3.0％的血清蛋白，如豬白蛋白或牛血清白蛋白(下文稱為“BSA”)可用于代替血清。然而，需要避免使用在接種動(dòng)物時(shí)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的存在于載體或稀釋劑中的外源蛋白質(zhì)。
病毒可在任何常規(guī)含磷酸鹽緩沖液，谷氨酸鹽，酪蛋白胨及蔗糖或山梨糖，或含磷酸鹽緩沖液，乳糖，葡聚糖和谷氨酸鹽的穩(wěn)定溶液中稀釋。
優(yōu)選本發(fā)明的疫苗病毒以至少105到106PFV/ml的滴度貯存于-70℃到-90℃或以凍干狀態(tài)貯存于2℃至7℃。凍干病毒可用無菌蒸餾水或使用含保存劑如慶大霉素和兩性霉素B或青霉素和鏈霉素的水稀釋劑重新配制備用。
給藥的有用劑量的變化取決于接種動(dòng)物的年齡，重量和種類以及給藥的方式。例如，合適的劑量可以是大約104.5到107PFV/動(dòng)物，優(yōu)選大約104.5至105.5PFV。
本發(fā)明的疫苗可經(jīng)鼻內(nèi)，陰道內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥，鼻內(nèi)途徑是優(yōu)選的給藥方式。
本發(fā)明的用途本發(fā)明試圖給用戶提供一種用于預(yù)防BVDV引起的疾病的有效疫苗，其中的疫苗可安全地和有效地經(jīng)肌肉內(nèi)，鼻內(nèi)或陰道內(nèi)給藥。經(jīng)鼻內(nèi)是優(yōu)選的給藥途徑。
生產(chǎn)本發(fā)明的疫苗的目的是治療疾病，優(yōu)選通過預(yù)防達(dá)到治療目的。預(yù)防或預(yù)防應(yīng)用指防止宿主形成疾病的癥狀或減輕該疾病的影響，即防止典型的疾病癥狀。預(yù)防的意思是終止，阻止或延緩疾病發(fā)作的決定性行為。預(yù)防可包括下列概念妨礙、挫敗、阻塞、攔截、很可能還有禁止、阻止或排除。排除表明不發(fā)生疾病狀態(tài)的發(fā)作或在導(dǎo)致疾病狀態(tài)中病原體大量失效。防止或預(yù)防可指疾病狀態(tài)被拖延，意思是阻止或防止疾病的預(yù)期行為已發(fā)生但產(chǎn)生疾病的癥狀未消除。
該疫苗在對(duì)BVDV疾病各種表現(xiàn)形式的傳播中提供有效保護(hù)的能力證實(shí)了本發(fā)明的有用性。由于疫苗使用gp53(一種主要的BVDV糖蛋白)，針對(duì)gp53宿主產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，因此對(duì)于所治療的潛在的宿主，該疫苗將提供大量的益處。本發(fā)明的另一目的是提供一種BVDV疫苗，它能安全地給牛犢和在妊娠全部階段的妊娠母牛用藥。
活性的測(cè)量該疫苗使用gp53，它是BVDV的一種主要的糖蛋白，針對(duì)它宿主可產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。其他作者已揭示了gp53具有高度免疫原性(Donis，R.O.和Dubori，E，J.，Glycoproteins of BovineViral Diarrhoea-Mucosal Disease Virus in Infected Borine Cell，Jour-nal of General Virology，Vol.68，pp.1607-1616(1987))。產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)的試劑可制成有效的疫苗，這是人們所熟知的(Magar.R.，et al.，Borine Viral Diarthea Virus ProteinsHeterogeneity of Cy-topathogenil and Noncytopathogenil Strains and EVidence of 53K Gly-coprotein Neutrali2tion Epitope.Veterinary Microbiology，Vol.16，pp.303-314)。本發(fā)明的疫苗含表達(dá)大量gp53的基因，如圖5所示。由于大量gp53的表達(dá)，本發(fā)明的疫苗可給所治療的潛在的宿主提供大量益處。
優(yōu)選的復(fù)合物任何以tk缺失減毒的并攜帶gp53基因，gp53基因前有信號(hào)肽的且表達(dá)是夠量gp53的BHV-1病毒是優(yōu)選合適的候選疫苗。似乎信號(hào)肽序列可取自任何合適的來源。我們選擇檢查了兩種不同的信號(hào)肽以保證gp53蛋白質(zhì)在體內(nèi)的最佳定位。我們選擇了兩種候選信號(hào)肽，稱之為“T11-6”(在實(shí)施例2中使用)和“T11-3”(在實(shí)施例3中使用)，以便進(jìn)行疫苗試驗(yàn)。前一種病毒命名為VC VR-58保藏于ATCC。后一種“T11-3”質(zhì)粒也進(jìn)行了保藏。我們標(biāo)記為“T11-8”的病毒可能含tk轉(zhuǎn)錄子的截短形式，這可能表明(但是未必一定是指)它作為候選疫苗具有較小的吸引力。在含有取自感染的牛犢的胎牛血清之培養(yǎng)基中傳代時(shí)，大量現(xiàn)存的細(xì)胞系被非細(xì)胞致病性BVDV持續(xù)感染。對(duì)于本發(fā)明，用作活的減毒疫苗的病毒不合污染的BVDV是絕對(duì)必要的。
復(fù)合物的制備用于將基因插入牛泡疹病毒1型(BHV-1)中的表達(dá)穿梭載體的構(gòu)建。
我們構(gòu)建了2個(gè)穿梭載體來將外源基因插入BHV-1中。盡管本發(fā)明顯示了BHV-1用作BVDV基因之載體的用途，但許多其它病毒也可充當(dāng)相同的角色。其它來自牛、綿羊和山羊的例子可包括牛、山羊和綿羊痘病毒，腺病毒，牛乳頭炎病毒，牛乳頭狀瘤病毒和假狂犬病病毒。不致病的病毒指任何具有在其一種宿主物種中復(fù)制之能力但在該物種中不產(chǎn)生任何疾病癥狀的病毒。這類不致病的病毒可能經(jīng)自然突變以致病性親本病毒產(chǎn)生，可經(jīng)諸如化學(xué)品或光進(jìn)行誘變以產(chǎn)生不致病的病毒，或可通過使用重組DNA技術(shù)導(dǎo)致不致病。見1)病毒中和區(qū)定位，E.wimmer，E.A.Emini，和D.C.Dia-mondand.2).疫苗產(chǎn)品的免疫原性和中和抗體，E Norrby。兩篇文章都由Notkins和Oldstone編輯，由Springer-Verleg New YorkInc，于1986年出版。
由于我們?cè)噲D通過滅活病毒胸苷激酶(tk)來減毒BHV-1(M.Kit，et al.，美國專利4,703,011(1983))，所以我們決定使用BHV-1tk基因作為插入位點(diǎn)。這一試驗(yàn)不僅保證了使病毒tk完全失活，還使我們能夠以建立的方法來選擇重組體，即tk-陰性病毒(M，F(xiàn).Shih，et al.，Proe Natl Acad Sci VSA，81；5867-5870(1948))。其它減毒BHV-1的方法，如其它非必需基因的缺失也可用于本發(fā)明。我們以質(zhì)粒pHAS4開始，它含2.7kb的BHV-1 Sal I亞片段，克隆進(jìn)質(zhì)粒pVC18的HindIII-A片段。E.PetrovKis，資料未出版。M.Engels，etal.，Virus Res，657-73(1986)；J.E.Mayfield，et al.，J.Virol，47259-264(1983)；A.L.Meyer，et al.，BiochimBiophys Acta，1090267-9(1991)。如圖1所示，該SalI片段含完整的tk基因，以及與HSV-1 VL24基因同源的部分上游基因和部分糖蛋白H基因。L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992)；J.G.Jacobson，et al.，J.Virol，631839-1843(1989)；M.Kit，et al.，美國專利4,703,011，(1983)；A.L.Meyet，et al.，Biochim Biophys Acta，1090267-9(1991)。
經(jīng)過用BglII和XhoI消化pHSA4將424bP的缺失導(dǎo)入tk基因中，用DNA聚合酶I的Klenow片段(Klenow)補(bǔ)齊末端并重新連接所得的鈍端片段。這一操作恢復(fù)了BglII識(shí)別位點(diǎn)，但失去了XhoI位點(diǎn)(圖1)。所得的質(zhì)粒命名為pHAS4ΔBX。選擇該缺失是因?yàn)樗环恋K以前鑒定的在tk基因5’端重疊的VL24同系物轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992)；J.G.Jacobson，et al.，J.Virol.631839-1843(1989)。在BHV-1 tk基因內(nèi)的許多其它缺失也是可能的。為了利于隨后的克隆操作，我們經(jīng)過用HindIII消化pHAS4ABX，用Klenow補(bǔ)齊粘性未端并重新連接鈍端從而去掉了pVC18中的HindIII位點(diǎn)。
我們獲得了含人細(xì)胞肥大病毒(cmv)主要立即早期啟動(dòng)子和牛生長激素多聚腺苷酸化序列的1775bp序列盒。R.J.Brideau，etal.，J.Gen Virol，74；471-477(1993)。在許多不同系統(tǒng)中這些基因表達(dá)信號(hào)通常用于外源基因的高水平表達(dá)，但其它啟動(dòng)子/多聚腺苷酸化信號(hào)對(duì)也可在此使用。在載體p3CL-DHFR中的該序列盒以單個(gè)EcoRI和BglII位點(diǎn)為邊界，并在啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間含單個(gè)HindIII和SalI限制性位點(diǎn)以便克隆外源基因。用EcoRI消化p3CL-DHFR載體，然后補(bǔ)齊并連接到BamHI接頭(New England Biolabs，Bererly，Massachusetts)上。這一操作重新產(chǎn)生EcoRI位點(diǎn)。然后用BamHI和BglII消化構(gòu)建體并將釋放的序列盒連接到pHAS4ΔBX的BglII位點(diǎn)上(圖1)。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α菌株。經(jīng)過非對(duì)稱的限制性位點(diǎn)定位，我們分離了含有相對(duì)于BHV-1tK基因以兩種取向存在的p3CL插入片段之重組質(zhì)粒。于是這兩種稱為pHAS4ΔBXex-1和pHAS4ΔBXex-3(圖1)的構(gòu)建體在BHV-1 tK基因和側(cè)翼區(qū)的邊界上含有強(qiáng)啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)以便能同源重組進(jìn)BHV-1基因組。
圖1，用于將外源基因插入BHV-1的穿梭載體的構(gòu)建。PHAS4是來自BHV-1 HindIII-A片段的2.7kb的亞片段。顯示了所要缺失的BglII/xhoI亞片段。pHAS4的缺失衍生物是pHAS4ΔBX。缺失的胸苷激酶(tK)基因以黑色帶點(diǎn)方框表示。含啟動(dòng)子和多聚腺苷化信號(hào)的序列盒在pHAS4ΔBX的正下方顯示。CMV立即早期啟動(dòng)子以白色帶點(diǎn)方框表示，牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸化信號(hào)以帶條紋的方框表示。最后顯示了兩個(gè)表達(dá)穿梭質(zhì)粒pHAS4ΔBXex1和pHAS4ΔBXex3的插入片段。
將信號(hào)肽序列加到BVDV gp53基因上以前已描述了含有來自病毒株2724(一種非細(xì)胞致病性病毒株)之BVDV gp53基因的cDNA(Kennedy，M.et al，abstracts of theAmerican College of Veterinary Microbiologists，1992 workshop)。由于BVDV RNA基因組一般翻譯成一條長的多蛋白，然后經(jīng)翻譯后修飾成各種病毒蛋白質(zhì)，故BVDV基因組的gp53部分不含將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上所需的常用信號(hào)肽，其中該蛋白質(zhì)在膜上正常表達(dá)。盡管如此，cDNA在無細(xì)胞系統(tǒng)和桿狀病毒中都能成功地表達(dá)，雖然缺乏常規(guī)信號(hào)肽，該蛋白質(zhì)似乎在兩種系統(tǒng)中都能轉(zhuǎn)位，糖基化和錨著。然而，我們決定使用和不使用各種信號(hào)肽來評(píng)價(jià)gp53在BHV-1中的表達(dá)。
為了將編碼信號(hào)肽的核苷酸序列加到gP53基因上，我們經(jīng)定點(diǎn)誘變將BamHI位點(diǎn)導(dǎo)入p53基因的5′端，操作如下將p53基因以鈍端連接到質(zhì)粒pSP72(Promega Corp.，Madison，Wisconsin)補(bǔ)齊的BamHI位點(diǎn)上，于是從所得的質(zhì)粒上去掉全部BamHI位點(diǎn)。使用合成的寡核苷酸和“Double Take”定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla CA)根據(jù)廠家說明書從cDNA所用的起始密碼子11堿基處導(dǎo)入單個(gè)堿基的改變，即從C變?yōu)镚。該堿基的改變將單個(gè)BamHI位點(diǎn)導(dǎo)入基因中而不改變gp53氨基酸序列(圖2 B部分)。經(jīng)過核苷酸測(cè)序證實(shí)了堿基的改變，所得的質(zhì)粒稱為pP53mut。我們將編碼來自PRV gIII基因(A.K.Robbins，et al.，J.Virol，58339-347(1986))和來自牛生長激素(R.P.Woychik，et al.，Nucl.Acids Res，107197-7210(1982))的信號(hào)肽的核苷酸插入pP53mut序列中(圖2 A部分)。合成編碼兩信號(hào)肽的互補(bǔ)寡核苷酸以便退火的寡核苷酸具有SalI5′粘性末端和BamHI3′粘性末端(圖2 A部分)。將這些信號(hào)肽序列盒連接到用BamHI和SalI消化的pP53mut上并轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α。經(jīng)過核苷酸測(cè)序證實(shí)信號(hào)肽序列盒的正確插入。
本發(fā)明可使用編碼任意充分鑒定的信號(hào)肽的互補(bǔ)寡核苷酸。充分鑒定的信號(hào)肽序列的39個(gè)例子見Perlman，D，et al.，J.Mol.Biol.Vol.167 pp.391-409(1983)(引用以供參考)。這些和任意其它充分鑒定的信號(hào)肽可適用于實(shí)施本發(fā)明。
圖2.在BVDV gp53基因上加上信號(hào)肽序列的方法。A部分合成的與牛生長激素(BGH)和假狂犬病病毒gIII(PRV gIII)的信號(hào)肽序列相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸。合成互補(bǔ)的寡核苷酸以便退火對(duì)具有5′端的SalI位點(diǎn)和3′端的BamHI位點(diǎn)。還顯示了推斷的信號(hào)肽氨基酸序列。在每種情況下，信號(hào)肽預(yù)期的切割位點(diǎn)正好位于丙氨酸(A)(末端的3個(gè)氨基酸)之后。原始天然蛋白質(zhì)的2個(gè)氨基酸殘基(BGH中是F.P；gIII中是P.S)的密碼子位于信號(hào)肽序列的左側(cè)以保證正確切割。
B部分編碼BVDV gp53基因的cDNA之定點(diǎn)誘變。顯示了gp53 cDNA的前60個(gè)核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列。改變箭頭所示的單個(gè)堿基對(duì)以便在序列中產(chǎn)生BamHI限制性位點(diǎn)，在方框中顯示。這一變化不改變氨基酸序列。然后如圖所示用BamHI消化cDNA，使其在閱讀框中與A部分所示的信號(hào)肽序列之一連接。
除了gp53之外的其它表達(dá)基因片段。
其它BVDV基因或基因組合在活病毒載體中的表達(dá)也是本發(fā)明的實(shí)施方案。這包括接種動(dòng)物轉(zhuǎn)對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的任何和全部BVDV蛋白質(zhì)。該例子包括(但不限于)其它兩種BVDV表面糖蛋白，gp48和gp45(Collett，M.S.，et al.，Virology 165200-208(1988))，p14衣殼蛋白質(zhì)(Thiel，H.，J，et al.，J.Virol.654705-4712(1991))和p20 N-末端蛋白酶(Wiskerchen，M.，et al.，J.Vi-rol.654508-4514(1991))。這一組蛋白質(zhì)可與gp53基因一起從單一cDNA分子上表達(dá)，表達(dá)的多蛋白可正確地自我加工成分開的蛋白質(zhì)。在疫苗中表達(dá)的另一BVDV侯選蛋白質(zhì)是非結(jié)構(gòu)p125/p80蛋白質(zhì)(Deregt，D.，et al.，Can.J.Microbiol.37815-122(1991))，它在感染的母牛中誘導(dǎo)明顯的抗體反應(yīng)。
將BVDV gp53基因插入BHV-1表達(dá)載體中。
經(jīng)過補(bǔ)齊載體和插入片段各自的粘性末端接著將鈍端連接來將加有或未加信號(hào)肽序列的p53基因連接到pHAS4ΔBXex-1和pHAS4ΔBXex-3的HindIII插入位點(diǎn)上。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α菌株。我們想最終評(píng)價(jià)gp53在BHV-1中以各種取向和具有至少2個(gè)不同信號(hào)肽的表達(dá)情況以保證獲得最有效的表達(dá)。使用以洋地黃毒苷-dVTP標(biāo)記的p53插入片段作探針經(jīng)菌落雜交篩選轉(zhuǎn)化的菌落?！氨举|(zhì)”DNA雜交系統(tǒng)(Boeringer Mannheim Bio-chemicals(BMB)，Indianapolis，IN)可用于該雜交和在本發(fā)明的鑒定中描述的全部其它DNA雜交。然后經(jīng)過限制性分析那些相對(duì)于CMV啟動(dòng)子和BgH多聚腺苷酸化信號(hào)以合適取向攜帶gp53基因的重組體來篩選陽性重組體。分離出5個(gè)質(zhì)粒，將它們以圖解的形式在圖3A-E中描述。其描述如下實(shí)施例1pBHVtKex-3∷p53含有在pHAS4ΔBXex-3 CMV啟動(dòng)子和BGH多聚腺苷酸化信號(hào)之間插入的BVDV gp53基因，不加信號(hào)肽。在該構(gòu)建體中，原始gp53基因在定點(diǎn)誘變前插入，見圖3A。然后該質(zhì)粒用于構(gòu)建病毒T2-3#。
實(shí)施例2pBHVtKex-1∷BGH/P53含在BGH信號(hào)肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-1的突變的gP53基因，見圖3B。該質(zhì)粒用于構(gòu)建病毒T11-6。該病毒已保藏。
實(shí)施例3pBHVtKex-1∷gIII/p53含有在PRV gIII信號(hào)肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-1的誘變的gp53基因。見圖3C。該質(zhì)粒用于構(gòu)建病毒T11-3。該質(zhì)粒已保藏。
實(shí)施例4pBHVtKex-3∷BGH/P53含有在BGH信號(hào)肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-3的誘變的gp53基因。見圖3D。
實(shí)施例5pBHVtKex-3∷gIII/p53含有在PRV gIII信號(hào)肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-3的誘變的gp53基因。見圖3E。該質(zhì)粒用于產(chǎn)生病毒T11-8。該質(zhì)粒已保藏。
圖3A-E用于將gp53插入BHV-1的五個(gè)穿梭質(zhì)粒的完全圖譜。gp53基因以實(shí)心帶表示，BHV-1序列以黑色帶點(diǎn)帶表示，CMV啟動(dòng)子區(qū)域以白色帶點(diǎn)帶表示，BGH多聚腺苷酸化信號(hào)區(qū)以條紋帶表示。質(zhì)粒載體pVC18以單條線表示。顯示了每種情況下相對(duì)于BHV-1 tK原始轉(zhuǎn)錄方向的gp53的轉(zhuǎn)錄方向。顯示了各種信號(hào)肽序列。
a.實(shí)施例1.pBHVtKex-3∷p53。
b.實(shí)施例2.pBHVtKex-1∷BGH/p53c.實(shí)施例3.pBHVtKex-1∷gIII/p53d.實(shí)施例4.pBHVtKex-3∷BGH/p53e.實(shí)施例5.pBHVtKex-3∷gIII/p53這些和所有其它可能的將BVDV gp53基因插入BHV-1tK基因的方式都是本發(fā)明的實(shí)施方案。這些質(zhì)粒和以這種方式產(chǎn)生的任何質(zhì)粒稱為“主要質(zhì)粒載體”，它們是用于產(chǎn)生本發(fā)明的病毒疫苗的質(zhì)粒載體。
將gp53基因?qū)隑HV-1“Iowa”使用XbaI將攜帶gp53的5種表達(dá)穿梭質(zhì)粒線型化并按Cai修改的(w.cai，et al.，J Virol，61714-721(1987))標(biāo)準(zhǔn)CaPO4方法(R.I.Graham，et al.，Virology，52456-467(1973))將它們共轉(zhuǎn)染進(jìn)具有來自BHV—1病毒株Iowa(tK陽性)單位長度DNA的牛鼻甲(BT)細(xì)胞中。該細(xì)胞從ATCC獲得。然后在100Mg/ml5-溴-2′-脫氧尿苷(BDVR，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)存在的條件下對(duì)143tK-細(xì)胞(S.K.Mittal，et al.，J.Gen Virol，70(1989))或?qū)ab(RV)細(xì)胞(S.Kit，et al.，Virology，130381-389(1983))進(jìn)行兩輪選擇染子以分離不再表達(dá)tK的病毒。這是以前描述的標(biāo)準(zhǔn)程序(M.Kit，et al.，美國專利4,703,011(1983))。也可使用允許BHV—1生長的其它tK-細(xì)胞系。經(jīng)過兩輪BDVR傳代后，在含1％低熔點(diǎn)瓊脂糖的完全培養(yǎng)基中將仍表現(xiàn)為細(xì)胞致病效應(yīng)的轉(zhuǎn)染子感染到BT細(xì)胞上以獲得單個(gè)噬菌斑，從每個(gè)轉(zhuǎn)染子中挑出許多的單個(gè)噬菌斑并經(jīng)點(diǎn)印跡DNA雜交篩選病毒DNA中的p53基因。盡管不是全部轉(zhuǎn)染子在BDVR傳代中存活(特別是那些在143tK-細(xì)胞上進(jìn)行的傳代，因?yàn)檫@些細(xì)胞僅在邊緣上允許BHV-1病毒生長)，但那些存活的轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生100％的重組病毒。分離了4種不同的重組病毒并作了進(jìn)一步的鑒定實(shí)施例1.T2-3#3和T2-2#5(兩種相同但獨(dú)立分離出的病毒克隆)在pBHVtKex-3∷p53中包含的插入序列重組進(jìn)BHV-1“Iowa”。含有未加信號(hào)肽序列、位于CMV啟動(dòng)子和BGH多聚腺苷酸化信號(hào)之間，轉(zhuǎn)錄方向與BHV-1tK基因方向相同的BVDVgp53基因。
實(shí)施例2，T11-6(該病毒以UC VR-58命名提交給ATCC)pBHVtKex-1∷BGH/p53包含的插入序列重組進(jìn)BHV-1“Iowa”。含有具有位于CMV啟動(dòng)子和BGH多聚腺苷酸化信號(hào)之間的BGH信號(hào)肽序列且相對(duì)于BHV-1 tK基因轉(zhuǎn)錄方向相反的BVDV gp53基因。
實(shí)施例3，T11-3在pBHVtKex-1∷gIII/p53中包含的插入序列重組進(jìn)BHV-1“Iowa”。含有具有位于CMV啟動(dòng)子和BGH多聚腺苷酸化信號(hào)之間的PRV gIII信號(hào)肽序列且相對(duì)于BHV-1tK基因轉(zhuǎn)錄方向相反的BVDV gp53基因。
實(shí)施例5，T11-8pBHVtkex-3∷gIII/p53中包含的插入序列重組進(jìn)BHV-1“Iowa”。含有具有位于CMV啟動(dòng)子和BGH多聚腺苷酸化信號(hào)之間的PRV gIII信號(hào)肽序列且轉(zhuǎn)錄方向與BHV-1tK基因相同的BVDV gp53基因。
用“Iowa”DNA和質(zhì)粒pBHVtKex3∷BGH/p53共轉(zhuǎn)染時(shí)(實(shí)施例4)未分離出病毒，但這種預(yù)期的病毒易于構(gòu)建，該病毒和含有插入到胸苷激酶基因中之BVDV gp53基因的任何其它BHV-1病毒都是本發(fā)明的實(shí)施例。從這些病毒中分別純化了其DNA，使用gp53基因和CMV啟動(dòng)子/BgH多聚腺苷酸化序列盒作控針經(jīng)Southern雜交檢查以合適的取向存在的合適的插入序列(資料未顯示)。這四種病毒全部攜帶位于BHV-1tK基因中的完全啟動(dòng)子/基因/多聚腺苷酸化序列盒，其中tK基因根據(jù)限制性片段大小預(yù)測(cè)為已缺失。作為與這些轉(zhuǎn)染的對(duì)照，也用BHV-1“Iowa”單位長度DNA轉(zhuǎn)染了pHAS4ΔBX質(zhì)粒并分離出攜帶tK中424bp缺失的tK陰性后代(也用southern雜文證實(shí))。該病毒命名為IowaΔBX。這些病毒全部是在BT細(xì)胞上經(jīng)有限稀釋純化兩次的噬菌斑。
在含有取自感染的牛犢的胎牛血清之培養(yǎng)基中傳代時(shí)，大量的現(xiàn)存細(xì)胞系被非細(xì)胞致病性BVDV持續(xù)感染。對(duì)于本發(fā)明，用作活的減毒疫苗的病毒不合污染的BVDV病毒是絕對(duì)必要的。為了確保攜帶BVDV序列的BHV-1病毒不被非細(xì)胞致病性BVD病毒污染，我們從每種病毒中制備了DNA(包括親本病毒株Iowa和IowaΔBX)并使用克隆的RNAse(RNAse ONE，Promega Corporation，Madison，Wisconsin)對(duì)該DNA制品進(jìn)行徹底的RNAse處理。由于BVDV僅具有RNA作為其遺傳材料，該操作應(yīng)從病毒DNA制品中除去任何可能污染的BVDV序列。然后將這些RNAse處理的病毒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)證實(shí)為無BVD的MDBK細(xì)胞(ATCC)中并從轉(zhuǎn)染子中挑選病毒噬菌斑以用于進(jìn)一步的操作。
gp53重組體的轉(zhuǎn)錄分析。
從每個(gè)重組病毒和親本BHV-1病毒株Iowa中制備RNA并經(jīng)Northern雜交評(píng)價(jià)gp53的轉(zhuǎn)錄。可能的信使RNA種類和所用的探針如圖4所示。
圖4BHV-1/gp53重組病毒預(yù)期的轉(zhuǎn)錄子如后面圖5所示。兩種探針是1)gp53 cDNA和2)pHAS4的SalI/BglII部分(如上面圖譜所示)。第一個(gè)圖譜顯示了病毒T11-3和T11-6預(yù)期的轉(zhuǎn)錄子，第二個(gè)圖譜顯示了T11-8預(yù)期的轉(zhuǎn)錄子。顯示了tK和UL24的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以供參考。
全部gp53重組病毒產(chǎn)生一條1.6kb的信使RNA.它與32p標(biāo)記的gp53探針雜交，預(yù)計(jì)的大小便于在CMV啟動(dòng)子上起始轉(zhuǎn)錄和在BgH多聚腺苷酸化位點(diǎn)上終止，如圖5探針1。T2-3#3和T2-2#5病毒未顯示。作為另外的主要帶，T11-3和T11-6產(chǎn)生8.5kb的轉(zhuǎn)錄子，T11-8和T2-3#3產(chǎn)生5.6kb的轉(zhuǎn)錄子。對(duì)重組病毒而言這些轉(zhuǎn)錄子是單一的，并且分別與在CMV啟動(dòng)子處起始，通過BgH多聚腺苷酸化信號(hào)閱讀并在UL24或tK/gH多聚腺苷酸化信號(hào)處終止的信使RNA一致。
與上游和下游探針的雜交證實(shí)了這些較長的信使RNA的相同性。p53探針不與Iowa，IaΔBX或感染RNA的模擬物雜交。作為定量對(duì)照，我們使用探針pHAS6，它是位于tK開放閱讀框架下游并在gH基因內(nèi)部的一條867bp的SalI片段(A.L.Meyer，et al.，Biochim Biophys Acta，1090261-9(1991))。所有這些病毒產(chǎn)生相當(dāng)量的3.1kb的gH信使RNA(資料未顯示)。該探針還與T11-8和T2-3-3中較長的p53信使RNA和Iowa中4.3Kb tK的信使RNA(與gH轉(zhuǎn)錄子是有共同的3′末端，L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992))雜交。
為了檢查gp53插入序列上游的轉(zhuǎn)錄模式，使用由pHAS4，片段組成的探針，該片段從上游SalI位點(diǎn)到tK基因的BglII位點(diǎn)(重組病毒中的缺失起點(diǎn))(即探針2)。全部病毒都產(chǎn)生一條大約4.4Kb的信使RNA，推斷為UL24(圖5，探針2)。然而，該信使RNA比Bello等(L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992))描述的BHV-1病毒株Cooper中的5.2Kb UL24信使RNA要小并與野生型病毒型株Iowa中的tK信使RNA共同遷移。盡管沒有經(jīng)過使用單鏈探針進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些共同遷移的信使RNA，但用探針pHAS6僅在Iowa DNA中檢測(cè)到了4.2Kb的tK轉(zhuǎn)錄子并用上游探針在所有病毒RNA中檢測(cè)到了相同大小的轉(zhuǎn)錄子，即使其它病毒不可能產(chǎn)生野生型大小的tK轉(zhuǎn)錄子。在T11-3和T11-6中，上游探針未檢測(cè)到任何tK信使RNA的截短形式且僅與UL24信使RNA和8.5Kb p53信使RNA雜交。另一方面，在T11-8中，該探針與大約5.0，3.7，1.8和1.0Kb的四種增加的(次要的)帶雜交。
圖5，Northern印跡顯示了BHV-1重組病毒中g(shù)p53信使RNA的轉(zhuǎn)錄子。第一組顯示了與探針1(pg53 cDNA)雜交的轉(zhuǎn)錄子，第二組顯示了與探針2(pHAS4的SalI/BglI亞片段)雜交的轉(zhuǎn)錄子。代號(hào)M＝模擬病毒感染的細(xì)胞，I＝BHV-1“Iowa”感染的細(xì)胞，3.6，8＝T11-3，T11-6和T11-8感染的細(xì)胞。RNA大小標(biāo)準(zhǔn)品以千堿基(KB)在每組左側(cè)給出。
BVDV gp53蛋白質(zhì)在BHV-1中的表達(dá)。
以免疫沉淀法(IP)評(píng)價(jià)了gp53蛋白質(zhì)在BHV-1重組體中的表達(dá)。IP的詳細(xì)方法可見標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)(如Current Protocols inMolecular Biology”，Ausubel，F(xiàn).M.，et.al.，eds.，Wiley Interscience，New York)。用BHV-1重組體感染的BT細(xì)胞經(jīng)新陳代謝用35S-甲硫氨酸(Amersham，Arlington Heights，Illinois)標(biāo)記。溶解病毒感染的細(xì)胞并將可溶蛋白質(zhì)與來自牛或山羊的抗BVDV超免疫血清(VMRD，Pullman，Washington)反應(yīng)。用葡萄球菌A(免疫沉淀素，Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)或蛋白A瓊脂糖4B(Pharmaci-a，Uppsala，Sweden)沉淀抗原/抗體復(fù)合物。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和熒光攝影術(shù)分辨免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
圖6顯示了在信號(hào)肽序列后攜帶gp53基因的所有3種重組病毒都產(chǎn)生顯著量的蛋白質(zhì)。從攜帶gp53基因但不合信號(hào)肽的T2-3#3或T2-2#5病毒中未檢測(cè)到gp53的任何表達(dá)，即使該病毒合成相當(dāng)大量的gp53信使RNA?？寺2-3#3和T2-2-2#5是單獨(dú)分離的克隆，這排除了某一特定的病毒具有排斥gp53表達(dá)之缺陷的可能性(資料未顯示)。剩下的可能性是從T2-3中合成gp53，但迅速被降解，或者是我們所用的抗體不能檢測(cè)該蛋白質(zhì)的未加工形式。
圖6顯示gp53在BHV-1重組體中表達(dá)的免疫沉淀蛋白質(zhì)。用多克隆中抗BVDV血清沉淀標(biāo)記的蛋白質(zhì)，該血清與BHV-1抗原也具有微弱的反應(yīng)性。代號(hào)3.6，8＝T11-3，T11-6和T11-8感染的細(xì)胞蛋白質(zhì)，IA＝BHV-1“Iowa”感染的細(xì)胞蛋白質(zhì)，M＝模擬病毒感染的細(xì)胞蛋白質(zhì)。MW＝近似蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，單位為干道爾頓。
T11-3，T11-6和T11-8的gp53蛋白質(zhì)帶寬大，表明該蛋白質(zhì)已加工，它們似乎與NADL gp53蛋白質(zhì)相當(dāng)?shù)笮〔幌嗤?資料未顯示)。經(jīng)用N-葡聚糖酶(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)消化從BVDV-NADL和BHV-1表達(dá)的gp53蛋白質(zhì)中去掉N-連接的糖不能分辨該蛋白質(zhì)的大小差異，但該蛋白質(zhì)大小的成比例減少表明gp53天然和重組形式以相同的方式進(jìn)行加工。重組和天然蛋白質(zhì)之間的輕微大小差異可能是由于BHV-1病毒的gp53基因來自具有輕微大小差異的gp53的不同的BVD病毒株，或cDNAgp53克隆可能不含從BVDV多蛋白加工成天然gp53的精確的氨基酸。
本發(fā)明并不局限于保藏的細(xì)胞系或本文公開的實(shí)施方案所限定的范圍，它們僅僅是對(duì)本發(fā)明一個(gè)方面的解釋，任何功能上相當(dāng)?shù)募?xì)胞系或?qū)嵤┓桨付荚诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，除了本文顯示和描述的以外，根據(jù)上文描述對(duì)本發(fā)明的各種修改對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。這種修改將落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
還應(yīng)明白的是給出的核苷酸和肽的所有堿基對(duì)和氨基酸殘基數(shù)是近似值并用于描述之目的。
本文引用的全部文獻(xiàn)列入以供參考。
遺傳材料的保藏經(jīng)過僅僅使用所給出的描述本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能重新構(gòu)建本發(fā)明的所有各種實(shí)施方案。然而為了完整起見，以確保可實(shí)施性并為制造和使用本發(fā)明的其它人提供各種機(jī)會(huì)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約將本發(fā)明的某些遺傳構(gòu)建體保藏在認(rèn)可的保藏單位。
一種病毒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 ParklownDrive，Rockville，Maryland，郵編20852，美國)。該保藏品由Vpjohn公司命名為UC VR-58并由保藏單位給出下面保藏號(hào)ATCC No.VR 2436，它與本文以“T11-6”(也稱為“實(shí)施例2”)描述的病毒相對(duì)應(yīng)。該保藏品于1993年10月28日被美國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏單位收到。
一些質(zhì)粒保藏在農(nóng)業(yè)研究服務(wù)社培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)(美國農(nóng)業(yè)部，1815 North University Street，Peoria，Illinois，郵編61604，美國)。一個(gè)質(zhì)粒的Upjohn命名為pUC1564，它是大腸桿菌培養(yǎng)物UC15085，稱為pBHVtKex-1∷gIII/p53，它與用于構(gòu)建本文以“T11-3”(也稱為“實(shí)施例3”)描述的病毒之質(zhì)粒相對(duì)應(yīng)。該質(zhì)粒由保藏單位給出下面保藏號(hào)，NRRL B-21350。另一保藏品的Upjohn命名為pUC1565，它是大腸桿菌培養(yǎng)物UC15086，稱為pBHVtKex-3∷gIII/p53，它與用于構(gòu)建本文稱為“T-11-8”(也稱“實(shí)施例5”)的病毒的質(zhì)粒相對(duì)應(yīng)。該質(zhì)粒由保藏單位給出下面的保藏號(hào)，NR-RL B-21351。農(nóng)業(yè)研究服務(wù)社培養(yǎng)物保藏中心的保藏單位于1994年10月26日收到這兩個(gè)質(zhì)粒。
序列描述(1)一般資料(i)申請(qǐng)人The Upjohn Company發(fā)明人(僅適用于美國)Wardley，Richard c.and Haanes，Elizabeth J.
(ii)發(fā)明題目表達(dá)牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)被膜糖蛋白的復(fù)制型不致病毒病毒(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Thomas A Wootton(1920-32-1)，The UpjohnCompany(B)街道7000 Portage Road(C)城市Kalamazoo(D)州Michigan(E)國家美國(F)郵編49001—0199(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體形式Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容性(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)最近申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日
(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名Wootton，Thomas A.
(B)登記號(hào)35004(C)參考/目錄號(hào)4748(ix)電信資料(A)電話616 385—7914(B)傳真616 385—6897(C)電傳224 401 VPJOHN(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度8083堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的非(iv)反義非(vi)原始來源(A)生物體牛病毒性腹瀉病毒(B)病毒株2724(C)單個(gè)分離物pBHVtkex—3∷p53(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA 60CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT 120CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT 180TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTAGC 240TTGCATGCCT GCAGGTCGAC TTCCGCGCCC GCGGCGTCTG CCTTCGCCAG CAGGTTGTCC 300GCGGCCGCTG CCGGCCTGGT TCCGCGCCCG CCGCCTCGCG GCCAGCTCCC GCGCGGGCGC 360GTCCGCGTCC CCAACTCCGC GCGAAGACGG GCTCGTCCCA GAAGCGCAGC GGAAAGGCCG 420GCGTATAAAA TTTCGCTCGT CCGGTACAAA GACGCGGTCC GCGACTGCGT GGATGTCCAC 480GCCCAGGCAA GCAAACTCTA AACGCCCGAG CGCCATGGCC CCGATGCCGC CACAAAGAGC 540GCCGAAATTT CGCCCAGGCA CGCCGCGCCG CCCGACGCGT CTTTAGCGCA CCCGCCGGCG 600CTGTTGCCCG CGTGCCTGCT GGCCGCCCAC CGGCGGCCGC 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1500TTTTCCCGGA GCCGATGGCG TACTGGCGCA CGATGTTTGG TACGGACGCC TTAAGTGGGA 1560TCCTCGCGGC GTCTGCGCGA TGCGCCGCAG CCTCGCACGG GAGCGCACGC GCGCGGCGGG 1620CCGGCGCACC GCGCAGACGC GGACGCGGCG GGCCTGGTTG CGTACTACCA GGCCAGGTTC 1680GCGGCCCCGT ACTTAATTTT GCACGCGCGT GTCCGCGCTG CTGCGCCGCC TGGGCCGGCG 1740CCGGGCGGCG AGCTGGTGGA CCCTCGTGTT CGACCGCCAC CCCGTGGCGC GCGTGCCTCT 1800GCTACCCCTT CGCCCGCTAC TGCCTCCGCG AGATCAACGC GGAAGATCCG AATTCCTCGA 1860CCTGCAGTGA ATAATAAAAT GTGTGTTTGT CCGAAATACG CGTTTGAGAT TTCTGTCCCG 1920ACTAAATTCA TGTCGCGCGA TAGTGGTGTT TATCGCCGAT AGAGATGGCG ATATTGGAAA 1980AATCGATATT TGAAAATATG GCATATTGAA AATGTCGCCG ATGTGAGTTT CTGTGTAACT 2040GATATCGCCA TTTTTCCAAA AGTTGATTTT TGGGCATACG CGATATCTGG CGATACGCTT 2100ATATCGTTTA CGGGGGATGG CGATAGACGC CTTTGGTGAC TTGGGCGATT CTGTGTGTCG 2160CAAATATCGC AGTTTCGATA TAGGTGACAG ACGATATGAG GCTATATCGC CGATAGAGGC 2220GACATCAAGC TGGCACATGG CCAATGCATA TCGATCTATA CATTGAATCA ATATTGGCCA 2280TTAGCCATAT TATTCATTGG TTATATAGCA TAAATCAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT 2340ACGTTGTATC CATATCATAA TATGTACATT TATATTGGCT CATGTCCAAC ATTACCGCCA 2400TGTTGACATT GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT 2460AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG 2520CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA 2580GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA 2640CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC 2700GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC 2760GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA 2820TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG 2880TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG 2940CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCG TTTAGTGAAC 3000CGTCAGATCG CCTGGAGACG CCATCCACGC TGTTTTGACC TCCATAGAAG ACACCGGGAC 3060CGATCCAGCC TCCGCGGCAA GCTGATCCGT CAGGGGCCAG ATGGTACAGG GCATCCTATG 3120GCTACTACTG ATAACAGGGG TACAAGGGGA CATTGACTGC AAACCTGAAC ACTCATACGC 3180CATAGCCAGG AATGATAGAA 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GACATTAAAA AATAAATATT TTGAGCCCAG 4080AGACAGTTAC TTCCAGCAAT ACATGCTAAA AGGAGATTAT CAATACTGGT TCGACCTGGA 4140GGTCACTGAC CATCATCGGG ATTACTTCGC CGAGTCCATA TTGGTGGTGG TGGTAGCTTT 4200ACTGGGTGGA AGATACGTGC TCTGGTTACT GGTAACATAC ATGGTCCTAT CAGAACAAAA 4260GGCCTTGGGG ACCCAATATG GGGCAGGGGA AGTGGTGATG ATGGGTAACT TGCTAACACA 4320TGACAGTATT GAAGTGGTGA CATATTTCTT GTTGTTATAC CTACTGCTAA GAGAGGAGGC 4380TGTAAAGAAG TGGGTCTTAC TCTTATACCA CCTTGATTGA TTGAGGATCA GCTTATCCAG 4440GGTCGACCTC AGGCATGCAA GCTCAGATCC GCTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 4500GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC 4560TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT 4620GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT 4680GCGGTGGGCT CTATGGGTAC CCAGGTGCTG AAGAATTGAC CCGGTTCCTC CTGGGCCAGA 4740AAGAAGCAGG CACATCCCCT TCTCTGTGAC ACACCCTGTC CACGCCCCTG GTTCTTAGTT 4800CCAGCCCCAC TCATAGGACA CTCATAGCTC AGGAGGGCTC CGCTTCAATC CCACCCGCTA 4860AAGTACTTGG AGCGGTCTCT CCCTCCCTCA TCAGCCCACC AAACCAAACC TAGCCTCCAA 4920GAGTGGGAAG AAATTAAAGC AAGATAGGCT ATTAAGTGCA GAGGGAGAGA AAATGCCTCC 4980AACATGTGAG GAAGTAATGA TAGAAATCAT AGAATTGAGA TCTCGAGGTG TTCGTGCTGG 5040ACGTGTCCGC GGCGCCAGAC GCGTGCGCGG CCGCCGTACT GGACATGCGG CCCGCCATGC 5100AGGCCGCTTG CGCGGACGGG GCGGCGGGCG CGACGCTGGC GACCCTGGCG CGTCAGTTCG 5160CGCTAGAGAT GGCGGGGGAG GCCACGGCGG GCCCTAGGGG ACTATAAAGC TGCCCCTGCG 5220CTCGCTCGCT CGCTGCATTT GCGCCCCGAT CGCCTTACGG GGACTCGGCG CTCGGCGGAT 5280CCCCTCCCGG CCCCGCCGCG AAGCAGGCCG CCAGACAAAA AAATGCGGCG CCCGCTCTGC 5340GCGGCGCTAT TGGCAGCGGC TGTCCTCGCG CTCGCCGCGG GCGCCCCCGC CGCCGCCCGC 5400GGCGGGGGCG CCGAAGCCAG GGCAGCACAG AGACGCCCGA TACGAAATCG AAGAGTGGGA 5460AATGGTGGTC GGAGCCGGGC CGGCCGTGCA CACGTTCACC ATCCGCTGCC TCGGGCCGCG 5520GGGCATTGAG CGCGTGGCCC ACATTGCAAA CCTCAGCCGG CTGCTGGACG GGTACATAGC 5580GGTCCACGTT GACGTTGCGC GCACCTCTGG CCTGCGGGAC GCCATGTTTT TCCTGCCGCG 5640CGCGGCCGTC GACTCTAGAG GATCCCCGGG TACCGAGCTC GAATTCACTG GCCGTCGTTT 5700TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT 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(iv)反義非(vi)原始來源(A)生物體牛病毒性腹瀉病毒(B)病毒株2724(C)單個(gè)分離物pBHVtkex—3∷BGH/p53(xi)序列描述SEQ ID NO4GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA 60CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT120CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT180TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTAGC240TTGCATGCCT GCAGGTCGAC TTCCGCGCCC GCGGCGTCTG CCTTCGCCAG CAGGTTGTCC300GCGGCCGCTG CCGGCCTGGT TCCGCGCCCG CCGCCTCGCG GCCAGCTCCC GCGCGGGCGC360GTCCGCGTCC CCAACTCCGC GCGAAGACGG GCTCGTCCCA GAAGCGCAGC GGAAAGGCCG420GCGTATAAAA TTTCGCTCGT CCGGTACAAA GACGCGGTCC GCGACTGCGT GGATGTCCAC480GCCCAGGCAA GCAAACTCTA AACGCCCGAG CGCCATGGCC CCGATGCCGC CACAAAGAGC540GCCGAAATTT CGCCCAGGCA CGCCGCGCCG CCCGACGCGT CTTTAGCGCA CCCGCCGGCG600CTGTTGCCCG CGTGCCTGCT GGCCGCCCAC CGGCGGCCGC TGTCCCCGGC CTCAGCAGGG660CCGGGGTCGC CGGCGGGCGG CCGCGGGGTG CGGCCACAGC CGCCCTTTTG CCCGTAGCCA720GGGGAAGCGG CTGCCCCTTC TGCCGCCGCG GCCGCGGTTG CTCGGCTTTG CGTTTGCCCC780GCGGCGATCG CCCCGCTCGC 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(A)生物體牛病毒性腹瀉病毒(B)病毒株2724(C)單個(gè)分離物pBHVtkex—3∷gIII/p53(xi)序列描述SEQ ID NO5GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA 60CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT120CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT180TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTAGC240TTGCATGCCT GCAGGTCGAC TTCCGCGCCC GCGGCGTCTG CCTTCGCCAG CAGGTTGTCC300GCGGCCGCTG CCGGCCTGGT TCCGCGCCCG CCGCCTCGCG GCCAGCTCCC GCGCGGGCGC360GTCCGCGTCC CCAACTCCGC GCGAAGACGG GCTCGTCCCA GAAGCGCAGC GGAAAGGCCG420GCGTATAAAA TTTCGCTCGT CCGGTACAAA GACGCGGTCC GCGACTGCGT GGATGTCCAC480GCCCAGGCAA GCAAACTCTA AACGCCCGAG CGCCATGGCC CCGATGCCGC CACAAAGAGC540GCCGAAATTT CGCCCAGGCA CGCCGCGCCG CCCGACGCGT CTTTAGCGCA CCCGCCGGCG600CTGTTGCCCG CGTGCCTGCT GGCCGCCCAC CGGCGGCCGC TGTCCCCGGC CTCAGCAGGG660CCGGGGTCGC CGGCGGGCGG CCGCGGGGTG CGGCCACAGC CGCCCTTTTG CCCGTAGCCA720GGGGAAGCGG CTGCCCCTTC TGCCGCCGCG GCCGCGGTTG CTCGGCTTTG CGTTTGCCCC780GCGGCGATCG CCCCGCTCGC CGCGAACGCG CGCGCGCGAA 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CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA 2580GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA 2640CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC 2700GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC 2760GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA 2820TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG 2880TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG 2940CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCG TTTAGTGAAC 3000CGTCAGATCG CCTGGAGACG CCATCCACGC TGTTTTGACC TCCATAGAAG ACACCGGGAC 3060CGATCCAGCC TCCGCGGCAA GCTTCGACCA TGGCCTCGCT CGCGCGTGCG ATGCTCGCTC 3120TGCTGGCGCT CTACGCGGCG GCCATCGCCG CGGCGCCGTC GGGGATCCTA TGGCTACTAC 3180TGATAACAGG GGTACAAGGG GACATTGACT GCAAACCTGA ACACTCATAC GCCATAGCCA 3240GGAATGATAG AATTGGCCCA TTAGGAGCTG AAGGCCTCAC CACTGTTTGG AAGGATTACT 3300CACATGAAAT GAAGCTGGAA GACACAATGG TCATAGCTTG GTGCAAAGAC GGTAAGTTTA 3360CATACCTCTC AAGGTGCACA AGAGAAACTA GATATCTTGC AATTCTGCAT TCAAGAGCCT 3420TGCAGACCAG TGTGGTATTC AAAAAACTTT TCGAGGGGCA AAGGCAAGGG GAAACATTTG 3480AAATGGCTGA CGACTTTGAA TTTGGACTCT GCCCATGCGA TGCCAATCCC GTAGTAAGAG 3540GGAAGTTCAA TACAACACTG CTAAACGGAC CGGCCTTCCA GATGGTATGC CCTATAGGAT 3600GGACAGGAAC TGTGAGCTGT ATGTTAGCTA ATAGGGACAC CCTAGACACA GCAGTAGTGC 3660GTGTGTATAA GAGGTCCAAA CCATTCCCTT ATAGACAAGG TTGTATCACC CAAAGAACTC 3720TGGGGGAGGA TCTCTATAAC TGTGATCTTG GAGGGAATTG GACTTGTGTG ACTGGGGACC 3780AGCTACAATA CACAGGAGGC CCTGTCGAAT CTTGCAAGTG GTGTGGTTAT AAATTCCAAA 3840AAAGTGAGGG GTTGCCACAC TACCCCATCG GCAAGTGTAG GTTGAAGAAT GAGACTGGCT 3900ACAGATTTGT AGACGGCACC ACTTGCAACA GAGAGGGTGT AGCCATAGTA CCACAAGGAT 3960TGGTAAAGTG TAAGATAGGA GACACAATCG TACAGGTCAT AGCTCTTGAC ACCAAACTTG 4020GGCCTATGCC TTGCAAGCCA TATGAGATCA TACCAAGTGA GGGGCCTGTA GAAAAGACGG 4080CATGCACCTT CAACTACACG AGGACATTAA AAAATAAATA TTTTGAGCCC AGAGACAGTT 4140ACTTCCAGCA ATACATGCTA AAAGGAGATT ATCAATACTG GTTCGACCTG GAGGTCACTG 4200ACCATCATCG GGATTACTTC GCCGAGTCCA TATTGGTGGT GGTGGTAGCT TTACTGGGTG 4260GAAGATACGT GCTCTGGTTA CTGGTAACAT ACATGGTCCT ATCAGAACAA AAGGCCTTGG 4320GGACCCAATA TGGGGCAGGG GAAGTGGTGA TGATGGGTAA CTTGCTAACA CATGACAGTA 4380TTGAAGTGGT GACATATTTC TTGTTGTTAT ACCTACTGCT AAGAGAGGAG GCTGTAAAGA 4440AGTGGGTCTT ACTCTTATAC CACCTTGATT GATTGAGGAT CAGCTTATCC AGGGTCGACC 4500TCAGGCATGC AAGCTCAGAT CCGCTGTGCC TTCTAGTTGC CAGCCATCTG TTGTTTGCCC 4560CTCCCCCGTG CCTTCCTTGA CCCTGGAAGG TGCCACTCCC ACTGTCCTTT CCTAATAAAA 4620TGAGGAAATT GCATCGCATT GTCTGAGTAG GTGTCATTCT ATTCTGGGGG GTGGGGTGGG 4680GCAGGACAGC AAGGGGGAGG ATTGGGAAGA CAATAGCAGG CATGCTGGGG ATGCGGTGGG 4740CTCTATGGGT ACCCAGGTGC TGAAGAATTG ACCCGGTTCC TCCTGGGCCA GAAAGAAGCA 4800GGCACATCCC CTTCTCTGTG ACACACCCTG TCCACGCCCC TGGTTCTTAG TTCCAGCCCC 4860ACTCATAGGA CACTCATAGC TCAGGAGGGC TCCGCTTCAA TCCCACCCGC TAAAGTACTT 4920GGAGCGGTCT CTCCCTCCCT CATCAGCCCA CCAAACCAAA CCTAGCCTCC AAGAGTGGGA 4980AGAAATTAAA GCAAGATAGG CTATTAAGTG CAGAGGGAGA GAAAATGCCT CCAACATGTG 5040AGGAAGTAAT GATAGAAATC ATAGAATTGA GATCTCGAGG TGTTCGTGCT GGACGTGTCC 5100GCGGCGCCAG ACGCGTGCGC GGCCGCCGTA CTGGACATGC GGCCCGCCAT GCAGGCCGCT 5160TGCGCGGACG GGGCGGCGGG CGCGACGCTG GCGACCCTGG CGCGTCAGTT CGCGCTAGAG 5220ATGGCGGGGG AGGCCACGGC GGGCCCTAGG GGACTATAAA GCTGCCCCTG CGCTCGCTCG 5280CTCGCTGCAT TTGCGCCCCG ATCGCCTTAC GGGGACTCGG CGCTCGGCGG ATCCCCTCCC 5340GGCCCCGCCG CGAAGCAGGC CGCCAGACAA AAAAATGCGG CGCCCGCTCT GCGCGGCGCT 5400ATTGGCAGCG GCTGTCCTCG CGCTCGCCGC GGGCGCCCCC GCCGCCGCCC GCGGCGGGGG 5460CGCCGAAGCC AGGGCAGCAC AGAGACGCCC GATACGAAAT CGAAGAGTGG GAAATGGTGG 5520TCGGAGCCGG GCCGGCCGTG CACACGTTCA CCATCCGCTG CCTCGGGCCG CGGGGCATTG 5580AGCGCGTGGC CCACATTGCA AACCTCAGCC GGCTGCTGGA CGGGTACATA GCGGTCCACG 5640TTGACGTTGC GCGCACCTCT GGCCTGCGGG ACGCCATGTT TTTCCTGCCG CGCGCGGCCG 5700TCGACTCTAG AGGATCCCCG GGTACCGAGC TCGAATTCAC TGGCCGTCGT TTTACAACGT 5760CGTGACTGGG AAAACCCTGG CGTTACCCAA CTTAATCGCC TTGCAGCACA TCCCCCTTTC 5820GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC 5880CTGAATGGCG AATGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG CGGTATTTCA 5940CACCGCATAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGCCC 6000CGACACCCGC CAACACCCGC TGACGCGCCC TGACGGGCTT GTCTGCTCCC GGCATCCGCT 6060TACAGACAAG CTGTGACCGT CTCCGGGAGC TGCATGTGTC AGAGGTTTTC ACCGTCATCA 6120CCGAAACGCG CGAGACGAAA GGGCCTCGTG ATACGCCTAT TTTTATAGGT TAATGTCATG 6180ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT 6240ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA 6300TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC 6360CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGGTG 6420AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC 6480AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT 6540TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTATTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC 6600GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG 6660CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTGAT 6720AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT 6780TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA 6840GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGTAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC 6900AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG 6960GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT 7020GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 7080GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT 7140GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTGTCA 7200GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG 7260ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG 7320TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 7380CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT GGTTTGTTTG 7440CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG GCTTCAGCAG AGCGCAGATA 7500CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA 7560CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG 7620TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC 7680TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA CGACCTACAC CGAACTGAGA 7740TACCTACAGC GTGAGCTATG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG AAGGGAGAAA GGCGGACAGG 7800TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC 7860GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG 7920TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG 7980TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC CTGCGTTATC CCCTGATTCT 8040GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG CTCGCCGCAG CCGAACGACC 8100GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAGA 813權(quán)利要求
1.一種復(fù)制型不致病病毒，用于預(yù)防由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的疾病，其中所說的復(fù)制型不致病病毒包含取自BVDV病毒的基因或基因組合，所說的復(fù)制型不致病病毒在功能上表達(dá)所說的基因或基因組合。
2.權(quán)利要求1的病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒是減毒的。
3.權(quán)利要求2的病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒選自減毒的牛泡疹病毒1型(BHV-1)，減毒的腺病毒，減毒的牛乳頭炎病毒，減毒的牛乳頭狀瘤病毒或減毒的假狂犬病病毒。
4.權(quán)利要求2的病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒是減毒的并含有和表達(dá)下列基因的任意組合編碼gp48，gp25，p14衣殼蛋白質(zhì)，p20N-末端蛋白酶和p125/p80蛋白質(zhì)的基因。
5.權(quán)利要求3的病毒，其中所說的復(fù)制型非致病病毒是減毒的并含有和表達(dá)下列基因的任意組合編碼gp48，gp25，p14衣殼蛋白質(zhì)，p20N-末端蛋白酶和p125/p80蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求2的病毒，其中所說的減毒是經(jīng)過使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
7.權(quán)利要求3的病毒，其中所說的減毒是經(jīng)過使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
8.權(quán)利要求4的病毒，其中所說的減毒是經(jīng)過使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
9.權(quán)利要求5的病毒，其中所說的減毒是經(jīng)過使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
10.權(quán)利要求9的病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒是減毒的牛泡疹病毒1型(BHV-1)
11.權(quán)利要求10的病毒，其中所說的復(fù)制型不致病病毒含有并表達(dá)編碼牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)糖蛋白gp53的基因。
12.權(quán)利要求11的病毒，其中在所說的牛泡疹病毒1型(BHV-1)中將信號(hào)肽插入編碼gp53的基因或基因組合之前。
13.權(quán)利要求12的病毒，其中所說的編碼gp53的基因插入到滅活的腸苷激酶(tK)基因位點(diǎn)。
14.權(quán)利要求13的病毒，其中用于產(chǎn)生該病毒，在功能上表達(dá)的基因或基因組合包含具有完整病毒DNA的重組質(zhì)粒，所說的質(zhì)粒包含a)含有胸苷激酶(tK)基因且在胸苷激酶(tK)基因上具有缺失的BHV-1基因組DNA片段，b)插入到胸苷激酶(tK)基因缺失處的啟動(dòng)子/多聚腺苷酸化信號(hào)，c)位于gp53基因或基因組合之前的信號(hào)肽基因序列，其全部插入到啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間。
15.權(quán)利要求14的病毒，其中所說的信號(hào)肽基因序列取自任何充分鑒定的信號(hào)肽序列，如見于Perlman，D.，et al.，J.Mol.Biol.Vol.167pp.391-409(1983)的39個(gè)充分鑒定的信號(hào)肽序列中的任何一個(gè)。
16.權(quán)利要求15的病毒，其中所說的信號(hào)肽基因序列取自假狂犬病病毒gIII基因(PRV)和/或牛生長激素(BGH)。
17.權(quán)利要求16的病毒，其中的質(zhì)粒選自下列質(zhì)粒，a)pBHVtKex-1∷BGH/P53；b)pBHVtKex-1∷gIII/P53；c)pBHVtKex-3∷BGH/P53或d)pBHVtKex-3∷gIII/p53。
18.權(quán)利要求17的病毒，其中所說的產(chǎn)生在功能上表達(dá)的基因或基因組合的產(chǎn)物的病毒是選自下列之一的病毒T11-3，T11-6或T11-8。
19.權(quán)利要求18的病毒，其中所說的編碼gp53的基因插入到滅活的胸苷激酶(tK)基因位點(diǎn)。
20.權(quán)利要求11病毒，其中所說的編碼gp53的基因插入到滅活的胸苷激酶(tK)基因位點(diǎn)。
21.權(quán)利要求20的病毒，其中用于產(chǎn)生病毒的功能上表達(dá)的基因或基因組合包含具有完整病毒DNA的重組質(zhì)粒，所說的質(zhì)粒包含a)含胸苷激酶(tK)基因且在胸苷激酶(tK)基因上具有缺失的BHV-1基因組DNA片段，b)在胸苷激酶(tK)基因缺失處插入的啟動(dòng)子/多聚腺苷酸化信號(hào)。c)在啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間插入的gp53基因或基因組合。
22.權(quán)利要求21的病毒，其中所說的質(zhì)粒由具有質(zhì)粒pHAS4特征的質(zhì)粒構(gòu)成。
23.權(quán)利要求22的病毒，其中所說的質(zhì)粒是pBHVtKex-3∷P53。
24.權(quán)利要求23的病毒，其中所說的病毒選自下列病毒之一T2-3#3或T2-2#5。
25.一種用于預(yù)防由牛病毒性腹瀉病毒(BDVD)引起的疾病的疫苗，包含權(quán)利要求1的藥用上有效量的病毒和一種載體。
26.權(quán)利要求25中要求的用于預(yù)防由牛病毒性腹瀉病毒(BD-VD)引起的疾病的疫苗，包含權(quán)利要求1的藥用上有效量的病毒和一種載體，所說的載體包含任何生理緩沖介質(zhì)，即含有大約2.5到15％的無抗BHV抗體的血清的pH大約為7.0到7.4的緩沖介質(zhì)。
27.一種免疫動(dòng)物抗由牛病毒性腹瀉病毒(BDVD)引起的感染性疾病的方法，包含給動(dòng)物施用藥用上有效量的權(quán)利要求1的病毒。
28.一種制備權(quán)利要求1的病毒的方法，包含a)分離產(chǎn)生BVDV的功能上表達(dá)的基因或基因組合，b)將所說的基因或基因組合插入復(fù)制型不致病病毒中，c)選擇功能上表達(dá)所說的基因或基因組合的產(chǎn)物的活病毒。
29.制備權(quán)利要求11的病毒的方法，其中用于產(chǎn)生該病毒的功能上表達(dá)的基因或基因組合以包括重組具有完整病毒DNA的質(zhì)粒的方法來生產(chǎn)，所說的質(zhì)粒包含a)含有胸苷激酶(tK)基因且胸苷激酶(tK)基因具有缺失的BHV-1基因組DNA片段，b)將啟動(dòng)子/多聚腺苷酸化信號(hào)插入到所說質(zhì)粒的胸苷激酶(tK)基因的缺失處，c)在啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間插入gp53基因或基因組合，d)用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生重組病毒，該病毒含有插入到活病毒中的功能性基因或基因組合，該活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并且表達(dá)所說的功能性基因或基因組合。
30.制備權(quán)利要求12的病毒的方法，其中用于產(chǎn)生病毒的功能上表達(dá)的基因或基因組合由包括重組具有完整病毒DNA的質(zhì)粒的方法來生產(chǎn)，所說的質(zhì)粒包含a)含有胸苷激酶(tK)基因且在胸苷激酶基因上具有缺失的BHV-1基因組DNA片段，b)將啟動(dòng)子/多聚腺苷酸化信號(hào)插入到所說質(zhì)粒的胸苷激酶(tK)基因缺失處，c)將前面具有信號(hào)肽基因序列的gp53基因或基因組合插入到啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)之間，d)用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生含有插入到活病毒中的所說的功能性基因或基因組合的重組病毒，該活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并表達(dá)所說的功能性基因或基因組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及用于其治療之疫苗的領(lǐng)域。本發(fā)明描述了制備活的、減毒的中泡疹病毒1型(BHV-1)作為表達(dá)BVDV抗原的病毒、疫苗和載體。含有與糖蛋白gp53相對(duì)應(yīng)的序列的BVDVcDNA克隆插入到滅活的BHV-1病毒中。
文檔編號(hào)C07K14/18GK1134175SQ94193978
公開日1996年10月23日 申請(qǐng)日期1994年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月5日
發(fā)明者E·J·哈尼斯, R·C·瓦爾德雷 申請(qǐng)人:厄普約翰公司