專利名稱：制備胰高血糖素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備胰高血糖素融合蛋白質(zhì)、然后用酶處理并回收以生產(chǎn)胰高血糖素的有效方法，還涉及該生產(chǎn)方法中使用的編碼胰高血糖素的DNA順序，含有該DNA順序的表達(dá)載體，以及攜帶該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
胰高血糖素(glucagon)是一種由胰島A細(xì)胞分泌的肽激素，與胰島B細(xì)胞分泌的胰島素一起對碳水化合物代謝起著重要作用。胰高血糖素還是一種已知的高血糖-糖原分解因子(HGF);胰島素可增進(jìn)葡萄糖代謝并降低血葡萄糖水平，胰高血糖素則可使葡萄糖釋入血中從而提高血糖水平。由于這些性質(zhì)，故可使用胰高血糖素來試驗(yàn)生長激素的分泌、診斷胰島瘤、進(jìn)行糖元積聚試驗(yàn)、緊急治療低血糖、在消化道的射線照相和內(nèi)窺鏡檢查中作預(yù)處理及其他臨床應(yīng)用。
胰高血糖素的氨基酸順序是已知的;其分子是由29個(gè)氨基酸組成的單股肽鏈，氨基末端是組氨酸;羧基末端是蘇氨酸(見

圖11)。人、豬和牛胰高血糖素的氨基酸順序是一樣的，因此工業(yè)上可由?；蜇i胰腺中分離并提純胰高血糖素。市場上可以買到以這種方法生產(chǎn)的胰高血糖素產(chǎn)品。再者，JamesW.White和GradyF.Saunders(NucleicAcidsResearch14，4719-4730，1986)已經(jīng)闡明了編碼胰高血糖素的人DNA順序(見圖11)。自此，人們已將注意力轉(zhuǎn)向嘗試用DNA重組技術(shù)經(jīng)濟(jì)地大量生產(chǎn)胰高血糖素。
然而，如上所述，胰高血糖素是含29個(gè)氨基酸殘基的短鏈肽，故分子量很低。當(dāng)用DNA重組技術(shù)由宿主細(xì)胞分泌這種低分子量蛋白質(zhì)時(shí)，它們將會被存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶降解。因此，如果使這種低分子量蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)結(jié)合成更為穩(wěn)定的、有適當(dāng)大小的融合蛋白質(zhì)來表達(dá)，將是很有利的。這樣，然后即可以用化學(xué)或酶方法處理這些融合蛋白質(zhì)，分離出目的蛋白質(zhì)。例如，日本專利公開63-284196號中介紹了一種以化學(xué)法處理融合蛋白然后回收目的蛋白質(zhì)的方法。但化學(xué)處理常常伴有不利的付反應(yīng)。另外，日本專利公開62-246600號描述了一種酶法處理融合蛋白以分離目的蛋白質(zhì)的方法，其中是用谷氨酸特異性蛋白酶處理含表皮生長因子(EGF)的融合蛋白質(zhì)，進(jìn)而回收EGF這一目的產(chǎn)物。但已知EGF含有四個(gè)谷氨酸殘基，因而使用這種酶難以回收到完整的EGF，而且收率很低。迄今為止，還沒有一個(gè)經(jīng)酶處理由融合蛋白中分離胰高血糖素的有效方法。
本發(fā)明生產(chǎn)胰高血糖素的方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷及其他許多缺點(diǎn)和不足，該方法包括制備通式(Ⅰ)所示的融合蛋白X-Glu+Glucagon(Ⅰ)其中X是70-170個(gè)氨基酸的先導(dǎo)順序，Glu是谷氨酸殘基，Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸順序，以及用能夠在谷氨酸殘基的羧基末端特異地水解肽鍵的酶處理所說的融合蛋白，以裂解該融合蛋白。
在一優(yōu)選方案中，用包括下列步驟的方法回收胰高血糖素(a).用適當(dāng)?shù)淖冃詣┗虮砻婊钚詣┤芙馑f的融合蛋白質(zhì);
(b).降低所說變性劑或表面活性劑的濃度;
(c).向步驟(b)得到的混合物中加入酶，從而得到一種含有因融合蛋白部分分解而產(chǎn)生可溶性中間產(chǎn)物的反應(yīng)混合物，(d).將所說的反應(yīng)混合物除鹽，得到含有所說的中間產(chǎn)物和酶，但不含有所說的變性劑和表面活性劑的部分，(e).借助含在所說部分中的酶使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，以釋放出胰高血糖素，以及(f).分離釋放的胰高血糖素。
本發(fā)明的表達(dá)載體具有編碼上述融合蛋白的DNA順序，并可在大腸桿菌宿主細(xì)胞中有效地表達(dá)所說的融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是向大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入上述表達(dá)載體而得到的。
本發(fā)明編碼胰高血糖素的DNA順序可用下式表示5′-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAATACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAGTGGCTGATGAACACC-3′(Ⅲ)本發(fā)明的純化胰高血糖素，純度達(dá)99%或更高，所說的純度是用高效液相層析法測定的。
因此，本發(fā)明可達(dá)到下述目的(1)提供一種生產(chǎn)胰高血糖素的方法，其中制備了含胰高血糖素的融合蛋白質(zhì)，并以高效率用酶處理以回收胰高血糖素;
(2)提供一種按上述方法使用小量酶，生產(chǎn)與天然產(chǎn)物相同之胰高血糖素的方法;
(3)提供一個(gè)具有編碼上述融合蛋白質(zhì)之DNA順序，并可使所說DNA順序能在大腸桿菌中有效表達(dá)的表達(dá)載體，以及在其中導(dǎo)入了所說表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體;
(4)提供一個(gè)編碼胰高血糖素的DNA順序，該DNA順序是由能以高頻率出現(xiàn)于大腸桿菌中的密碼子組成的;以及(5)提供純度達(dá)99%或更高的純化的胰高血糖素。
可借助下列附圖進(jìn)一步了解本發(fā)明的目的及其優(yōu)點(diǎn)，從而進(jìn)一步理解本發(fā)明。
圖1顯示了編碼人胰高血糖素的DNA順序。
圖2a是構(gòu)建質(zhì)粒pGAl的流程圖，該質(zhì)粒用于構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAThuIFNγ/glucagon。
圖2b是構(gòu)建質(zhì)粒Trp pAT huIFN γ/Kallikr in的流程圖，該質(zhì)粒被用于構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體Trp pAT huIFN γ/glucagon。
圖2c是構(gòu)建本發(fā)明之表達(dá)載體TrppAThuIFNγ/glucagon的流程圖。
圖3顯示表達(dá)載體TrppAThuIFNγ/glucagon中含有的胰高血糖素DNA編碼堿基順序及該DNA上游和下游側(cè)的相鄰區(qū)域。
圖4a是構(gòu)建質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ的流程圖，該質(zhì)粒被用于構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon。
圖4b是構(gòu)建本發(fā)明之表達(dá)載體TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon的流程圖。
圖5是構(gòu)建本發(fā)明之表達(dá)載體TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon的流程圖。
圖6是構(gòu)建本發(fā)明之表達(dá)載體TrppAThuIFNα80A2/glucagon的流程圖。
圖7a是用PCR方法合成含編碼人IFNα80A2堿基順序之DNA片段的流程圖。
圖7b顯示在構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon中，用PCR方法擴(kuò)增編碼胰高血糖素之基因順序及其上游和下游DNA片段的流程圖。
圖7c是構(gòu)建本發(fā)明之表達(dá)載體TrppATCysⅡhuIFNγ/glucagon的流程圖。
圖8顯示人IFN80A2的DNA順序和相應(yīng)氨基酸順序。
圖9a和9b顯示對按本發(fā)明的DNA重組技術(shù)得到的胰高血糖素所作反相HPLC和離子交換HPLC分析的結(jié)果。
圖10a和10b顯示對按本發(fā)明方法以DNA重組技術(shù)得到的胰高血糖素進(jìn)行反相HPLC分析的結(jié)果。
圖10c顯示對市售天然胰高血糖素進(jìn)行反相HPLC分析的結(jié)果。
圖11顯示人胰高血糖素的氨基酸順序和編碼所說胰高血糖素的人DNA順序。
在用本發(fā)明的方法制備融合蛋白質(zhì)X-Glu-Glucagon時(shí)，可選擇表現(xiàn)有高表達(dá)水平的氨基酸順序作為以X代表的先導(dǎo)順序。所選擇的先導(dǎo)順序X應(yīng)是當(dāng)將編碼X的堿基順序?qū)氪竽c桿菌(一種適用的宿主)以誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，所說融合蛋白質(zhì)占總蛋白產(chǎn)生量的20%或更高，且所說的融合蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中形成顆粒(即包涵體)。X的適當(dāng)分子量為10-20千道爾頓(相當(dāng)于70-170個(gè)氨基酸)。對X的適當(dāng)?shù)奶禺愋赃x擇包括干擾素γ、△Cys-干擾素γ、干擾素α80A2、干擾素β、干擾素δ、白細(xì)胞間素1β、牛生長激素、β-半乳糖苷酶、人白細(xì)胞介素8、大腸桿菌丙酮酸激酶Ⅰ、氨基糖苷酶3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)和含有這些多肽之氨基末端的各順序等。含有干擾素γ、△Cys-干擾素γ和干擾素α80A2氨基末端之90-140氨基酸片段的順序是特別適用的。構(gòu)建含有多肽DNA編碼順序的表達(dá)載體(其中上述多肽順序通過谷氨酸殘基與胰高血糖素相連接)，并用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而可高效率地表達(dá)呈穩(wěn)定融合蛋白質(zhì)顆粒形式的所說多肽。
下文將按著生產(chǎn)方法的次序描述本發(fā)明生產(chǎn)胰高血糖素的方法。可按著“MolecularCloning”(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1982)中所述程序完成用于本方法中的DNA重組技術(shù)。
編碼胰高血糖素之DNA順序的設(shè)計(jì)和化學(xué)合成人、豬和牛胰高血糖素的氨基酸順序是相同的，并可用下式代表HisSerGlnGlyThrPheThrSerAspTyrSerLysTyrLeuAspSerArgArgAlaGlnAspPheValGlnTrpLeuMetAsnThr(Ⅱ)JamesW.White和GradyF.Saunders(上述文獻(xiàn))已闡明了編碼人胰高血糖素的DNA順序。圖11中顯示了人胰高血糖素的氨基酸順序和編碼所說胰高血糖素的人DNA順序。雖然可將該DNA順序用于本發(fā)明，但最好是優(yōu)先使用那些其中的密碼子能以高效率用于大腸桿菌的DNA順序。因此，本發(fā)明人在設(shè)計(jì)和合成的DNA順序中盡可能地包含了以高頻率用于大腸桿菌內(nèi)的密碼子。該DNA順序示于圖1中。
編碼胰高血糖素的DNA順序相對較短，故可用化學(xué)合成方法制得。例如，可用自動(dòng)核酸合成儀首先合成圖1所示的15個(gè)片段(Fr.1-15)，然后用層析法如高效液相層析法(HPLC)純化這些片段，用激酶處理各片段，再用DNA連接酶以常規(guī)方法連接這些片段，即制成該合成的DNA。然后可用苯酚提取、乙醇沉淀、瓊脂糖凝膠電泳等常規(guī)方法分離經(jīng)上述連接反應(yīng)得到的DNA?？砂匆咽龇椒?Nucl.AcidsRes.，8，253-264，1980)由瓊脂糖凝膠中洗脫回收這些DNA片段。
然后可使用這些編碼胰高血糖素的DNA順序構(gòu)建重組質(zhì)粒(即表達(dá)載體)。
表達(dá)載體的構(gòu)建可按下述方法構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體即(a)TrppAThuIFNγ/glucagon，(b)TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon，(c)TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon(d)TrppAThuIFNα80A2/glucagon和(e)TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon。
(a)TrppAThuIFNγ/glucagon的構(gòu)建如圖2c所示，本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAThuIFNγ/glucagon是使用下列三個(gè)組分構(gòu)建的(1)含有編碼胰高血糖素前半部分氨基酸順序之堿基順序的19bp片段;
(2)含有編碼胰高血糖素后半部分氨基酸順序之堿基順序的片段;及
(3)TrppAThuIFNγ/Kallikrein載體。DNA片段(1)的結(jié)構(gòu)如下式所示1234GluHisSerGlnGly(Thr)GCGAACACTCTCAGGGTACACGTCGCTTGTGAGAGTCCPstIKpnI(Ⅳ)該片段由編碼包括組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)及蘇氨酸(Thr)之一部分在內(nèi)的胰高血糖素N末端氨基酸的DNA順序組成，其連接到接有谷氨酸(Glu)密碼子GAA的5′末端上。另外，該片段在5′端有一個(gè)PstⅠ裂解位點(diǎn)，在3′端有一個(gè)KpnⅠ裂解位點(diǎn)?？山?jīng)化學(xué)方法合成，然后再使構(gòu)成片段的兩單股19堿基寡核苷酸退火而得到該片段。
片段(2)是以圖2a所示方式，用限制性酶裂解由ptac12(Amman等，Gene25∶167，1983)(作為原型)構(gòu)建的克隆載體pGAl而得到的。具體地說，可按下述方法由ptac12構(gòu)建pGAl。首先，將如下式所示的合成接頭(Ⅴ)插入ptac12的PvuⅡ裂解位點(diǎn)中
(Ⅴ)
然后用PvuⅡ和HindⅢ裂解如此得到的質(zhì)粒(即ptac12/SLl;其在PvuⅡ裂解位點(diǎn)下游有一個(gè)HindⅢ裂解位點(diǎn))，并插入如圖1所示的約100bp合成基因。然后如圖2c所示，用HindⅢ裂解以這種方法得到的質(zhì)粒pGAl，用Klenow片段將其末端切成平頭，再用KpnⅠ切割如此得到的DNA片段，從而產(chǎn)生出一個(gè)90bp的KpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段。
可按下述方法制得TrppAThuIFNγ/Kallikrein載體(3)。如圖2b所示，首先用SalⅠ和BAP處理與人干擾素γ融合的PSTⅠ的表達(dá)質(zhì)粒(即TrppAThuIFNγ/PSTⅠ，J.Biochem.，102∶607-612，1987)，并回收所得兩個(gè)片段中的較大片段(即SalⅠ-SalⅠ片段)。另外用SalⅠ和XbaⅠ消化TrppAThuIFNγ質(zhì)粒，從而得到SalⅠ-XbaⅠ片段。進(jìn)而合成下示的寡核苷酸銜接子Ⅵ(其含有編碼人血漿激肽釋放酶之識別位點(diǎn)(Phe-Arg)的DNA順序)。
然后用T4DNA連接酶連接上述SalⅠ-SalⅠ片段、SalⅠ-XbaⅠ片段及合成的寡核苷酸銜接子Ⅵ，得到質(zhì)粒載體TrppAThuIFNγ/Kallikrein。該載體具有一個(gè)處于色氨酸啟動(dòng)子控制下的、編碼人干擾素γ上至135位絲氨酸殘基之片段的順序，然后是如圖2b下部分所示處于下游區(qū)域的順序。
用XbaⅠ、Klenow片段和PstⅠ處理上述TrppAThuIFNγ/Kallikrein載體(3)，并使用T4DNA連接酶，按常規(guī)方法將所得片段中較大者連接到上述片段(1)和(2)上，從而得到表達(dá)載體TrppAThuIFNγ/glucagon(圖2c)。圖3顯示了該表達(dá)載體中與編碼胰高血糖素DNA之5′和3′端相鄰的堿基順序。
(b)TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon的構(gòu)建如圖4b所示，可用下列3個(gè)組分構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon(1)含有編碼△CyshuIFNγN末端氨基酸順序(前半部)之堿基順序的片段;
(2)含有編碼△CyshuIFNγC末端氨基酸順序(后半部)和編碼胰高血糖素之堿基順序的片段;以及(3)TrppAT載體。
如圖4b所示，DNA片段(1)得自由TrppAThuIFNγ作為原型(KisotoRinsho，Vol.20∶4029-4034，1986，Japan)構(gòu)建的huIFNγ表達(dá)質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ(見圖4a)?？砂聪率龇椒ㄓ蒚rppAThuIFNγ構(gòu)建TrppAT△CyshuIFNγ。首先，用ClaⅠ、AvaⅡ和SphⅠ消化TrppAThuIFNγ，從而得到ClaⅠ和SphⅠ片段和AvaⅡ-SphⅠ片段。接下來合成下列寡核苷酸(Ⅶ)
MetGln(Asp)5′-CGATACTATGCAG-3′3′-TATGATACGTCCTG-5′ClaIAvaⅡ(Ⅶ)該合成的寡核苷酸銜接子(Ⅶ)編碼△CyshuIFNγ的前部分，其由△CyshuIFNγ氨基末端的谷氨酰胺(Gln)和天冬氨酸(Asp)開始。合成所示的兩條長度分別為13和14堿基的單股寡核苷酸，然后使之退火即得到寡核苷酸(Ⅶ)。
用T4DNA連接酶連接上述ClaⅠ-SphⅠ片段、AvaⅡ-SphⅠ片段和合成的銜接子(Ⅶ)以構(gòu)建質(zhì)粒載體TrppAT△CyshuIFNγ。然后用限制酶ClaⅠ和AsuⅡ消化該TrppAT△CyshuIFNγ載體，從而得到一個(gè)275bp片段。該ClaⅠ-AsuⅡ片段編碼由第4位谷氨酰胺殘基開始上至相當(dāng)于堿基順序中AsuⅡ裂解位點(diǎn)的部分人干擾素γ。
DNA片段(2)是用AsuⅡ和SphⅠ切割上述表達(dá)載體TrppAThuIFNγ/glucagon(圖2c)所得到之片段中的較小片段。該AsuⅡ-SphⅠ片段包含編碼人干擾素γ之后半部分氨基酸順序的堿基順序(其由相當(dāng)于編碼人干擾素γ之堿基順序內(nèi)AsuⅡ裂解位點(diǎn)處開始)，向下游還包含一個(gè)編碼胰高血糖素氨基酸順序的堿基順序。
DNA片段(3)是用ClaⅠ和SphⅠ切割上述表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNγ/glucagon所得片段中的較大片段(圖4b)。該ClaⅠ-SphⅠ片段含有色氨酸啟動(dòng)子的堿基順序。
使用T4DNA連接酶，以常規(guī)方法連接上述ClaⅠ-AsuⅡ片段(1)、AsuⅡ-SphⅠ片段(2)和ClaⅠ-SphⅠ片段(3)，得到表達(dá)載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon(圖4b)。
該載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon具有一個(gè)編碼處于色氨酸啟動(dòng)子控制下的、由第4位Gln殘基至第135位Ser殘基的人干擾素γ片段的順序，然后在下游區(qū)域中接有圖4b下部分所示的順序。該表達(dá)載體中，與編碼胰高血糖素DNA的5′和3′端相鄰的堿基順序是與TrppAT短huIFNγ/glucagon中的順序(如圖3所示)相同的。
(c)TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon的構(gòu)建如圖5所示，本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon是由(b)中所述的表達(dá)載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon(圖4b)構(gòu)建的。
具體地說，用下述程序制得TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon。首先，用限制酶AsuⅡ和PstⅠ切割載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon，用Klenow片段將末端切成平頭。然后用T4DNA連接酶以常規(guī)方法連接如此得到的較大片段(AsuⅡ/Klenow-PstⅠ/Klenow片段)，從而得到載體TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon。
該載體TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon具有一個(gè)處于色氨酸啟動(dòng)子控制下的、編碼部分人干擾素γ，即從第4位谷氨酰胺殘基至第95位苯丙氨酸殘基(Phe)的基因順序且在下游側(cè)，即編碼甘氨酸和谷氨酸殘基的順序之后，還含有一個(gè)編碼胰高血糖素之氨基酸順序的堿基順序。在該表達(dá)載體中，與編碼胰高血糖素之DNA的5′末端相鄰的堿基順序示于圖5的右下方。
(d)TrppAThuIFNα80A2/glucagon的構(gòu)建如圖6所示，本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAThuIFNα80A2/glucagon是使用下列三個(gè)組分構(gòu)建的(1)含有編碼huIFNα80A2之堿基順序的片段;
(2)含有編碼胰高血糖素之堿基順序的片段;及(3)TrppAT載體。
如圖7a所示，可用TrppBRhuIFNα80A2(日本專利公開61-56199號)作模板，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法(Saiki等，Science239∶487，1988)制得DNA片段(1)。為此目的，首先以化學(xué)方法合成兩條單股寡核苷酸鏈，即分別以下式代表的20核苷酸有意義引物(Ⅷ)和25核苷酸反意義引物(Ⅸ)。
有意義引物5′-AGTTAACTAGTACGCAAGTT-3′(Ⅷ)反意義引物5′-CAACCCTGCAGGCACAAGGGCTGTA-3′(Ⅸ)如圖7a所示，有意義引物(Ⅷ)相當(dāng)于色氨酸啟動(dòng)子的前部分，而反意義引物(Ⅸ)則相當(dāng)于huIFNα80A2的前部分?？墒褂眠@些引物，通過用Taq聚合酶擴(kuò)增該片段而得到含有huIFNα80A2編碼順序的DNA片段。用ClaⅠ和PstⅠ切割該DNA順序，得到ClaⅠ-PstⅠ片段。該ClaⅠ-PstⅠ片段含有上至第140位丙氨酸殘基處之編碼人IFNα80A2的基因順序。
DNA片段(2)是如圖6所示，用PstⅠ和BamHⅠ裂解上述表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNγ/glucagon(圖2c)得到的較小片段。該P(yáng)stⅠ-BamHⅠ片段具有一個(gè)編碼半胱氨酸、絲氨酸和谷氨酸的堿基順序，及一個(gè)編碼胰高血糖素的DNA順序。
DNA片段(3)是如圖6所示，用ClaⅠ和BamHⅠ裂解上述表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNγ/glucagon(圖2c)所得到的較大片段。該ClaⅠ-BamHⅠ片段含有色氨酸啟動(dòng)子的堿基順序。
使用T4DNA連接酶以常規(guī)方法連接上述ClaⅠ-PstⅠ片段(1)、Pst-BamHⅠ片段(2)和ClaⅠ-BamHⅠ片段(3)，得到表達(dá)載體TrppAThuIFNα80A2/glucagon(圖6)。該載體TrppAThuIFNα80A2/glucagon具有處于色氨酸啟動(dòng)子控制下的、編碼上至第140位丙氨酸殘基(Ala)之部分人IFNα80A2的基因順序，該順序下游側(cè)與圖6右下方指出的順序相鄰。huIFNα80A2的完整順序如圖8中所示。
(e)TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon的構(gòu)建如圖7c中所示，本發(fā)明的表達(dá)載體TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon是由上文(b)中所述的表達(dá)載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon衍生得到的，即所說的載體是以PCR方法(文獻(xiàn)出處同上)，使用含有失配的寡核苷酸，將只構(gòu)成該質(zhì)粒之一個(gè)PstⅠ裂解位點(diǎn)的堿基順序CTGCAG轉(zhuǎn)化成CTCGAG而得到的。具體地說，即用T4DNA連接酶連接編碼胰高血糖素及其相鄰順序的DNA片段(1)和TrppAT△CyshuIFNγ載體的較大片段(2)(兩者參見下文所述)，以得到TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon。
首先，化學(xué)合成兩條單股寡核苷酸鏈，即由下式所示的21核苷酸有意義引物(Ⅹ)和21核苷酸反意義引物(Ⅺ)有意義引物5′-CCGTTTCGCTCGAGCGAACAC-3′(Ⅹ)反意義引物5′-AGCTCTAGAGCTTTTATTAGG-3′(Ⅺ)如圖7b所示，有意義引物(Ⅹ)相當(dāng)于huIFNγ和胰高血糖素之連接處的順序，而反意義引物(Ⅺ)則相當(dāng)于由胰高血糖素的羧基末端區(qū)開始并包括其下游區(qū)部分的順序。
可按下述方法制得編碼胰高血糖素及相鄰順序的DNA片段(1)。使用上述兩引物，以TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon作模板，用上述PCR方法擴(kuò)增編碼胰高血糖素及鄰近順序的DNA片段。因?yàn)橛幸饬x引物(Ⅹ)含有誤配堿基對，所以已擴(kuò)增之DNA片段的堿基順序至少部分地不同于模板載體。這樣，就使存在于編碼干擾素γ與胰高血糖素連接區(qū)之堿基順序中的PstⅠ裂解位點(diǎn)(CTGCAG)轉(zhuǎn)化為已擴(kuò)增之DNA順序中的XhoⅠ裂解位點(diǎn)(CTCGAG)。結(jié)果，半胱氨酸密碼子TGC變?yōu)榫幋a絲氨酸殘基的TCG。用XhoⅠ切割已擴(kuò)增的DNA片段，并用Klenow片段將末端切成平頭。然后用XbaⅠ切割該片段，由此得到DNA片段(1)。
如圖7c所示，TrppAT△CyshuIFNγ載體的較大片段(2)是用PstⅠ切割載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon，再用Klenow片段處理得到的。然后用XbaⅠ切割該順序，其中所得到的較大片段就是所需的片段(2)。
使用T4DNA連接酶以常規(guī)方法連接上述XhoⅠ/Klenow-XbaⅠ片段(1)和PstⅠ/Klenow-XbaⅠ片段(2)即得到表達(dá)載體TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon。
該表達(dá)載體TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon具有一個(gè)處于色氨酸啟動(dòng)子控制下的、編碼從第4位谷氨酰胺殘基到第135位絲氨酸殘基之人干擾素γ片段的基因順序，該順序則通過圖7c右下方所示的順序與其下游側(cè)相接。
宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及表達(dá)按照“MolecularCloning”(文獻(xiàn)出處同上)中所述的方法，將上述表達(dá)質(zhì)粒即(a)TrppAThuIFNγ/glucagon、(b)TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon(c)TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon，(d)TrppAThuIFNα80A2/glucagon和(e)TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon導(dǎo)入適當(dāng)宿主細(xì)胞中。根據(jù)四環(huán)素抗性選擇轉(zhuǎn)化體。經(jīng)導(dǎo)入上述表達(dá)質(zhì)粒(a)、(b)、(c)和(e)所得到的轉(zhuǎn)化體可產(chǎn)生包含人胰高血糖素和人干擾素γ或其類似物的融合蛋白質(zhì)。經(jīng)導(dǎo)入上述表達(dá)質(zhì)粒(d)而得到的轉(zhuǎn)化體可產(chǎn)生包含人胰高血糖素及IFNα80A2的融合蛋白質(zhì)。適用的宿主微生物包括大腸桿菌K12菌株C600、JM103、AG-1等。其中特別適用的是菌株K12C600，使用該菌株可特別有效地產(chǎn)生含有人胰高血糖素的融合蛋白質(zhì)。
將上述表達(dá)載體TrppAThuIFNγ/glucagon導(dǎo)入大腸桿菌K12菌株C600中所得到的轉(zhuǎn)化體被定名為TrppAThuIFNγ融合的glucagon/C600，并已于1989年1月20日按照布達(dá)佩斯條約寄存于FermentationResearchInstituteAgencyforIndustrialScienceandTechnology，1-3，Higashi1chome，Tsukuba-Shi，Ibaraki-Ken，Japan，保藏登記號為FERMBP-2250。
培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體并收集細(xì)胞后，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)和抗胰高血糖素多克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析，進(jìn)一步證實(shí)在宿主細(xì)胞中成功地表達(dá)了呈融合蛋白質(zhì)形式的人胰高血糖素。即SDS-PAGE顯示了分別相當(dāng)于含人干擾素γ和干擾素α之融合蛋白質(zhì)的約21千道爾頓和約14千道爾頓帶。經(jīng)Western印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了這些未修飾之融合蛋白質(zhì)與抗胰高血糖素多克隆抗體的免疫學(xué)反應(yīng)。用本發(fā)明方法，當(dāng)分別用上述表達(dá)載體(a)、(b)、(c)、(d)和(e)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，每升轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)混合物中約產(chǎn)生3.06g、2.43g、3.64g、0.24g和2.45g融合蛋白質(zhì)。
溶解并用V8蛋白酶水解融合蛋白質(zhì)，分離并純化胰高糖血素因?yàn)樗拗骷?xì)胞內(nèi)融合蛋白質(zhì)是以顆粒蛋白質(zhì)的形式積聚的，所以為了從上述融合蛋白質(zhì)(X-Glu-Glucagon)中回收胰高血糖素，須首先回收并溶解該顆粒蛋白質(zhì)。
為此，可首先以常規(guī)方法離心培養(yǎng)混合物以收集細(xì)胞，然后破碎細(xì)胞并離心得到細(xì)胞團(tuán)塊。再加入變性劑或表面活性劑以溶解這些細(xì)胞團(tuán)塊?？捎糜诖四康牡淖冃詣┌?鹽酸胍)、尿素等?？上葘⑦@種變性劑以足夠量加入緩沖溶液中，然后用以溶解細(xì)胞團(tuán)塊?？墒褂秒一蚰蛩氐娘柡腿芤?，但優(yōu)選的濃度范圍為6-8M。吐溫80(商品名)是用于這一目的的適用表面活性劑，且其適宜濃度為0.05-0.2%(重量)。考慮到繼后的酶處理過程，緩沖溶液的pH最好是在該過程中所用酶的最適pH范圍內(nèi)。例如，當(dāng)使用由金黃色葡萄球菌中得到的蛋白酶V8(SigmaChemicalCo.，No.P-8400)時(shí)，pH值應(yīng)為7.8，并且應(yīng)使用pH值在7.8左右，且具有強(qiáng)緩沖能力的緩沖液，如碳酸氫銨緩沖液。如酶處理過程中使用的酶含有雜質(zhì)如中性酶時(shí)，則可向所說的緩沖溶液內(nèi)加入EDTA等酶抑制劑，以抑制所說雜質(zhì)的活性。
以這種方法制得的含已溶解材料的混合物中含有足夠高濃度的變性劑或表面活性劑，從而可阻止繼后酶處理中所用酶的作用。在這種情況下，一般應(yīng)該用適當(dāng)稀釋劑如沒有變性劑或表面活性劑的上述緩沖溶液稀釋該混合物。稀釋程度應(yīng)使蛋白質(zhì)保持溶解狀態(tài)，并能使下述酶處理過程中所用的酶發(fā)揮足夠的效力。例如，當(dāng)使用胍或尿素作變性劑時(shí)，應(yīng)將混合物稀釋到其中所說變性劑的濃度達(dá)到4M或更低，且最好為大約2M或更低。但應(yīng)注意的是，含有已溶解材料的混合物中蛋白質(zhì)濃度應(yīng)為1-5mg/ml，且最好為2-3mg/ml。
然后經(jīng)酶處理使胰高血糖素與蛋白質(zhì)X分離開。該靶胰高血糖素是以部分變性形式存在的，并通過一個(gè)間插的谷氨酸殘基與蛋白質(zhì)X融合。因?yàn)橐雀哐撬乇旧聿缓劝彼釟埢钥捎媚軌蛟诠劝彼釟埢然┒颂禺惖厍袛嚯逆I的酶處理，由完整形式的融合蛋白質(zhì)中釋放出胰高血糖素。適用于這一目的的酶包括由金黃色葡萄球菌中得到的蛋白酶V8(SigmaChemicalCo.，No.P-8400)，但這并不是唯一的選擇，原則上，能在谷氨酸殘基之羧基端特異地切斷肽鍵的任何酶都可以用于這一目的。例如，可優(yōu)先選用由金黃色葡萄球菌ATCCNo.12600得到的蛋白酶V8。酶的用量一般為上述稀釋的細(xì)胞制劑中蛋白質(zhì)總量的1/50至1/1000(W/W)，最好是約1/500(W/W)。以這種方法向上述稀釋的細(xì)胞制劑內(nèi)加入這種酶得到反應(yīng)混合物，可伴隨緩慢攪拌于室溫至40℃下反應(yīng)30分鐘至7小時(shí)。反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)所加酶的量而定。例如，當(dāng)所加酶量為大約1/500(W/W)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可為大約4小時(shí)。
可加入酸如鹽酸、醋酸，使pH降至大約3，以終止酶促反應(yīng)。如此得到的酶促反應(yīng)混合物含有終產(chǎn)物胰高血糖素，以及分子量低于X-Glu-Glucagon融合蛋白質(zhì)的中間產(chǎn)物。這些中間產(chǎn)物可能是因裂解蛋白質(zhì)X內(nèi)谷氨酸殘基而產(chǎn)生的。即使除去混合物中含有的變性劑和表面活性劑，這些中間產(chǎn)物也仍是可溶的。下列因素可能影響到這些中間產(chǎn)物的產(chǎn)生(ⅰ)上述反應(yīng)混合物中含有的酶可因變性劑和表面活性劑的短暫變性作用而顯著降低了酶促活性，(ⅱ)因裂解蛋白質(zhì)X內(nèi)谷氨酸殘基所產(chǎn)生的低分子量分解產(chǎn)物抑制了酶促作用，(ⅲ)因蛋白質(zhì)較高級結(jié)構(gòu)中的折迭或其他改變，而使得融合蛋白質(zhì)中靶谷氨酸殘基處的靶裂解位點(diǎn)對酶促作用降低了敏感性。
可以通過進(jìn)一步處理和裂解這些中間產(chǎn)物來提高胰高血糖素的產(chǎn)率。為此而采取的一個(gè)有效方法是由酶促反應(yīng)混合物中除去變性劑和表面活性劑，以及裂解蛋白質(zhì)X內(nèi)谷氨酸殘基所形成的低分子量分解產(chǎn)物。可用凝膠過濾、透析等除鹽方法有效地除去這些物質(zhì)，其中凝膠過濾是最為適用的方法。凝膠過濾最好在這樣的條件下完成，即當(dāng)除去變性劑或表面活性劑及低分子量分解產(chǎn)物的同時(shí)，也可在同一洗脫部分中洗脫酶和中間產(chǎn)物。收集凝膠過濾得到的含中間產(chǎn)物及酶的部分，將其pH調(diào)到酶的最適pH值，使酶變性并作用于已溶解的中間產(chǎn)物。然后于如上所述的同樣條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，從而釋放出胰高血糖素。
可聯(lián)合使用幾種常規(guī)技術(shù)，如凝膠過濾層析、親和層析、離子交換層析、疏水凝膠層析等層析法或離心分離法，以純化按這種方式由融合蛋白質(zhì)中裂解下來的胰高血糖素。
上述回收胰高血糖素的方法只需要較少量的酶裂解谷氨酸殘基，因此是比較經(jīng)濟(jì)的。
使用本發(fā)明的方法，當(dāng)分別用上述表達(dá)載體(a)、(b)和(e)轉(zhuǎn)化宿主時(shí)，在每升含轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中約分別產(chǎn)生150mg160mg和170mg純化的胰高血糖素。當(dāng)使用攜帶表達(dá)載體(c)或(d)的轉(zhuǎn)化體時(shí)，也可以同樣方式由被表達(dá)的融合蛋白質(zhì)中制得純化的胰高血糖素。檢測以上述方法制得的純化胰高血糖素的純度、氨基酸組成、氨基酸順序及生物學(xué)活性，結(jié)果表明該物質(zhì)確實(shí)是人胰高血糖素，它不含雜質(zhì)，并且其氨基酸組成和生物學(xué)活性與天然胰高血糖素完全相同。因此，按上述方法制得的胰高血糖素可以以與常規(guī)胰高血糖素制劑完全相同的方式用于各種目的，如檢測生長激素分泌、診斷胰島瘤、糖元積聚試驗(yàn)、低血糖的緊急治療、對消化道進(jìn)行放射圖象和內(nèi)窺鏡檢查時(shí)的預(yù)處理及其他臨床應(yīng)用。
本發(fā)明不只限于生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)形式之人胰高血糖素的方法。本發(fā)明還包括表達(dá)所說融合蛋白質(zhì)的載體、經(jīng)導(dǎo)入這些載體所得到的轉(zhuǎn)化體，以及某些編碼胰高血糖素的特定DNA順序。
因此，本發(fā)明提供了一種只使用少量酶，通過簡單、有效且低成本的加工程序由X-Glu-glucagon形式的融合蛋白質(zhì)中分離得到與天然胰高血糖素完全相同之胰高血糖素產(chǎn)品的方法。利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的這種胰高血糖素能夠以低成本大批量生產(chǎn)。此外，因?yàn)檫@種類型產(chǎn)品的氨基酸順序與天然人胰高血糖素的氨基酸順序完全相同，所以臨床使用時(shí)不會發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，并可以與臨床上常用的常規(guī)產(chǎn)品一樣用于各種目的。
實(shí)施例下文所述的基因重組實(shí)驗(yàn)是按照“MolecularCloning”(ColdSpringHarborLaboratory，1982)中指出的方法完成的。使用的酶均購自TakaraShuzoCo.，Ltd.。
(A)編碼胰高血糖素之DNA順序的設(shè)計(jì)和化學(xué)合成原則上，可使用大腸桿菌有高利用頻率的密碼子設(shè)計(jì)編碼人胰高血糖素之氨基酸順序的DNA順序。如此設(shè)計(jì)的DNA順序，可編碼圖1中所示從起始組氨酸殘基到第29位蘇氨酸殘基的氨基酸順序。
用自動(dòng)核酸合成儀化學(xué)合成圖1中所示的15個(gè)短鏈片段。然后使這些片段退火，從而得到圖1中所示有雙鍵結(jié)構(gòu)的DNA順序。該DNA順序在5′端有一個(gè)編碼蛋氨酸的ATG密碼子及AluⅠ酶切位點(diǎn)，且在3′端有兩個(gè)TAA終止密碼子和一個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)。
(B)表達(dá)載體的構(gòu)建按下述方法構(gòu)建5個(gè)能在大腸桿菌中表達(dá)人胰高血糖素的質(zhì)粒載體，即(a)TrppAThuIFNγ/glucagon，(b)TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon，(c)TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon，(d)TrppAThuIFNα80A2/glucagon和(e)TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon。
(a)TrppAThuIFNγ/glucagon的構(gòu)建經(jīng)連接下文(1)-(3)中所述的三個(gè)DNA片段而構(gòu)建該表達(dá)載體。圖2a-2c中圖解顯示了該表達(dá)載體的構(gòu)建程序。
(1)按下述方法制備含編碼胰高血糖素前半部分氨基酸順序之堿基順序的19bpPstⅠ-KpnⅠ片段。該堿基順序的設(shè)計(jì)是在編碼胰高血糖素前半部分氨基酸(包括組氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和蘇氨酸密碼子的一部分)之DNA順序的5′端加上谷氨酸密碼子GAA和PstⅠ酶切位點(diǎn)，并在3′端提供一個(gè)KpnⅠ酶切位點(diǎn)。該堿基順序已示于上文式(Ⅳ)中。然后化學(xué)合成用以形成該堿基順序的兩個(gè)19mer寡核苷酸并使之退火，從而得到含有胰高血糖素前半部分氨基酸編碼順序、在上游側(cè)含PstⅠ酶切位點(diǎn)且在下游側(cè)含KpnⅠ酶切位點(diǎn)的19bp片段。
(2)按下述方法制備質(zhì)粒pGAl的KpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段。如圖2a所示，使用質(zhì)粒ptac12(文獻(xiàn)同上)作原型，依下述程序構(gòu)建克隆載體pGAl。首先，將上文式(Ⅴ)所示的15bp合成接頭插入ptac12的PvuⅡ酶切位點(diǎn)中，從而構(gòu)建成在PvuⅡ酶切位點(diǎn)下游有一HindⅢ酶切點(diǎn)的質(zhì)粒(ptac12/SL1)。然后用PvuⅡ和HindⅢ切割該質(zhì)粒ptac12/SL1，并插入前述(A)中得到的約100bp之合成基因(即圖1中所示的DNA順序)中，從而得到定名為pGAl的質(zhì)粒。
另外，如圖2c所示，用HindⅢ消化質(zhì)粒pGAl并用Klenow片段處理，使其被切斷的末端成為平頭。然后用KpnⅠ消化已切割的質(zhì)粒，并回收如此得到的較短片段，即90bpKpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段。如圖1所示，該KpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段編碼胰高血糖素的后半部分氨基酸順序，即從上述胰高血糖素氨基酸編碼順序中間位置的KpnⅠ酶切位點(diǎn)開始的順序。
(3)以下述方法制備質(zhì)粒載體TrppAThuIFNγ/Kallikrein的XbaⅠ-PstⅠ片段。如圖2b所示，于37℃下用SalⅠ將由人干擾素γ和PSTⅠ形成之融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒(TrppAThuIFNγ/PSTⅠ，J.Biochem.，102∶607-612，1987)消化1小時(shí)，然后用BAP將其產(chǎn)物37℃下處理2小時(shí)，并分離較大片段(SalⅠ-SalⅠ片段)。在另一操作中，用SalⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒TrppAThuIFNγ并回收較小的XbaⅠ-SalⅠ片段。然后使用T4DNA連接酶，用上文式(Ⅵ)所示的合成寡核苷酸接頭(含有編碼人血漿激肽釋放酶之識別位點(diǎn)(Phe-Arg)的DNA順序)連接上述SalⅠ-SalⅠ片段和上述XbaⅠ-SalⅠ片段。
將以該方式制得的質(zhì)粒載體定名為TrppAThuIFNγ/Kallikrein。該載體TrppAThuIFNγ/Kallikrein含有處于色氨酸啟動(dòng)子控制下的上至第135位絲氨酸殘基之部分人干擾素γ的基因編碼順序，其下游側(cè)則是圖2b下部分所示的順序。如圖2c所示用XbaⅠ切割載體TrppAThuIFNγ/Kallikrein后，再用Klenow片段將切割的末端修成平頭。接下來用PstⅠ切割該片段并回收所得的較大DNA片段(XbaⅠ-PstⅠ片段，3.6Kbp)。
如圖2c中所示，用T4DNA連接酶連接上述DNA片段(1)-(3)(已分別按NucleicAcidsRes.，8∶253-264，1980中所述方法，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離)，從而得到定名為TrppAThuIFNγ/glucagon的表達(dá)載體。然后按照Proc.Natl.AcadSci.USA74∶5464-5467，1977中所述方法檢查已插入該表達(dá)質(zhì)粒中之DNA片段的堿基順序，從而證實(shí)所說的DNA片段確實(shí)正確地編碼了人胰高血糖素的全部29氨基酸順序。
(b)TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon的構(gòu)建該表達(dá)載體是經(jīng)連接下文(1)-(3)中所述的三個(gè)DNA片段而得到的。圖4a和4b中圖解顯示了該表達(dá)載體的構(gòu)建。
(1)按下述方式制備人干擾素γ表達(dá)質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ的ClaⅠ-AsuⅡ片段。所說的人干擾素γ表達(dá)質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ是用TrppAThuIFNγ(上述文獻(xiàn))作原型構(gòu)建的(參見圖4a)。首先，用ClaⅠ、AvaⅡ和SphⅠ消化TrppAThuIFNγ，從而得到一個(gè)ClaⅠ-SphⅠ片段和一個(gè)AvaⅡ-SphⅠ片段。另外，進(jìn)一步合成上述合成的寡核苷酸銜接子(Ⅶ)。然后用T4DNA連接酶連接該ClaⅠ-SphⅠ片段、AvaⅡ-SphⅠ片段和合成的銜接子(Ⅶ)。將如此制得的質(zhì)粒定名為TrppAT△CyshuIFNγ。
其后，如圖4b右側(cè)所示，于37℃下用ClaⅠ和AsuⅡ消化該質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ(1小時(shí))，并由產(chǎn)物中分離275bp片段(ClaⅠ-AsuⅡ片段)。
(2)于37℃下用AsuⅡ和SphⅠ消化TrppAThuIFNγ/glucagon(1小時(shí))，然后分離較小片段，以制備上文(a)中所述的表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNγ/glucagon的AsuⅡ-SphⅠ片段。
(3)此外，于37℃下用ClaⅠ和SphⅠ消化TrppAThuIFNγ/glucagon(1小時(shí))并分離較大片段，以制得上文(a)中所述表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNγ/glucagon的ClaⅠ-SphⅠ片段。
按圖4b中所示，使用T4DNA連接酶連接上述DNA片段(1)-(3)(各片段均已按NucleicAcidsRes.8∶253-264，1980所述，以瓊脂糖凝膠電泳法分離出來)，從而得到定名為TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon的表達(dá)載體。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5464-5467，1977中所述方法檢查已插入該表達(dá)質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon中之DNA片段的堿基順序，從而證實(shí)所說的DNA片段確實(shí)正確地編碼了人胰高血糖素的全部29氨基酸順序。
(c)TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon的構(gòu)建按下述方法構(gòu)建表達(dá)載體。圖5中顯示了該表達(dá)載體的構(gòu)建程序。
于37℃下用AsuⅡ和PstⅠ將上文(b)中所述的表達(dá)質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon消化1小時(shí)，并用Klenow片段將切斷的末端修成平頭。再用T4DNA連接酶重新連接所得的較大片段(AsuⅡ/Klenow-PstⅠ/Klenow片段)，如此便得到稱為TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon的表達(dá)載體。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5464-5467，1977中所示方法檢查已導(dǎo)入該表達(dá)質(zhì)粒TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon中之DNA片段的堿基順序，從而證實(shí)所說的DNA片段確實(shí)已正確地編碼了人胰高血糖素的全部29氨基酸順序。
(d)TrppAThuIFNα80A2/glucagon的構(gòu)建連接下文(1)-(3)中所述的三個(gè)DNA片段以構(gòu)建該表達(dá)載體。圖6中圖解顯示了該表達(dá)載體的構(gòu)建程序。
(1)按下述方法構(gòu)建含編碼huIFNα80A2之堿基順序的ClaⅠ-PstⅠ片段。首先，合成兩條單股寡核苷酸，即相當(dāng)于人IFNα80A2表達(dá)質(zhì)粒TrppBRhuIFN80A2(文獻(xiàn)同上)之Trp啟動(dòng)子后半部分的20核苷酸有意義引物(上述式(Ⅷ))和編碼huIFNα80A2之后半部分的25核苷酸反意義引物(上述式(Ⅸ))。使用這些引物和Taq聚合酶，按照RCR方法(見上述文獻(xiàn))進(jìn)行擴(kuò)增以得到含有編碼huIFNα80A2之堿基順序的DNA片段。于37℃下用ClaⅠ和PstⅠ將該擴(kuò)增的片段消化1小時(shí)，并分離所得到的ClaⅠ和PstⅠ片段。
(2)于37℃下用PstⅠ和BamHⅠ消化上文(a)中所述的表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNγ/glucagon(1小時(shí))并分離較小的片段，制得含編碼胰高血糖素之堿基順序的PstⅠ-BamHI片段(圖6)。
(3)同樣，于37℃下用ClaⅠ和BamHI將上文(a)中得到的表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNγ/glucagon消化1小時(shí)，并分離較大片段，制得質(zhì)粒載體TrppAThuIFNγ/glucagon的ClaⅠ-BamHI片段(圖6)。
如圖6所示，按照NucleicAcidsRes.8∶253-264，1980中所說的方法，使用T4DNA連接酶連接已用瓊脂糖凝膠電泳法分離的上述DNA片段(1)-(3)。從而得到定名為TrppAThuIFNα80A2/glucagon的表達(dá)載體。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5464-5467，1977中所述方法檢查已導(dǎo)入該表達(dá)質(zhì)粒TrppAThuIFNα80A2/glucagon中之DNA片段的堿基順序，從而證實(shí)所說的DNA片段確實(shí)已正確地編碼了人胰高血糖素的整個(gè)29氨基酸順序。
(e)TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon的構(gòu)建該表達(dá)載體是由上述(b)中制得的質(zhì)粒TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon衍生的。圖7c中圖解顯示了所說的表達(dá)載體的構(gòu)建。
首先，合成一個(gè)21核苷酸有意義引物(上述式(Ⅹ))和一個(gè)21核苷酸反意義引物(上述式(Ⅺ))。使用這些引物和Taq聚合酶，以TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon作模板，依據(jù)PCR方法擴(kuò)增約130堿基對的DNA片段。37℃下用XhoⅠ將該擴(kuò)增的DNA片段消化1小時(shí)，用Klenow片段處理，然后再于37℃下用XbaⅠ消化1小時(shí)，由此得到約110堿基對的DNA片段(1)。
然后于37℃下用PstⅠ將所說的載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon消化1小時(shí)，用Klenow片段處理，再于37℃下用XbaⅠ消化1小時(shí)并回收較大片段(2)，從而由載體TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon制得DNA片段(2)。
用T4DNA連接酶連接上述DNA片段即構(gòu)建成表達(dá)載體TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5464-5467，1977中所述方法檢查已導(dǎo)入該表達(dá)載體之DNA片段的堿基順序，從而證實(shí)所說的DNA片段確實(shí)已正確地編碼了人胰高血糖素的整個(gè)29氨基酸順序。
(C)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)使用大腸桿菌K12菌株C600(F-、thi-1、thr-1、leuB6、lacY1、tonA21、supE44)作為宿主細(xì)胞，用上述方法構(gòu)建的質(zhì)粒即(a)Trp pAT huIFN γ/glucagon，(b)Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon，(c)Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon，(d)Trp pAT huIFNα80A2/glucagon和(e)Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因?yàn)檫@些表達(dá)質(zhì)粒已向轉(zhuǎn)化體內(nèi)導(dǎo)入了所有必需的四環(huán)素抗性，故可將細(xì)胞在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基(含有15μg/ml四環(huán)素的LB平皿培養(yǎng)基)上37℃培養(yǎng)過夜并選擇已形成集落的細(xì)胞。然后，將這些集落于37℃下在改良的M9培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)離心收集細(xì)胞并懸浮于適于進(jìn)行SDS凝膠分析的緩沖溶液(0.1MTris-HCl，1%SDS、20%蔗糖和1%β-巰基乙醇，pH6.8)中，對該懸液進(jìn)行SDS-PAGE分離，通過用考馬斯亮蘭R染色并使用抗胰高血糖素多克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析以檢查含胰高血糖素之融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。結(jié)果表明用上述表達(dá)質(zhì)粒(a)、(b)、(d)和(e)轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生了分子量約21千道爾頓的顆粒蛋白質(zhì)，而用上述表達(dá)質(zhì)粒(c)轉(zhuǎn)化的宿主則產(chǎn)生了約14千道爾頓的蛋白質(zhì);此外，所說的蛋白質(zhì)未經(jīng)進(jìn)一步修飾即可與抗胰高血糖素抗體反應(yīng)。因此，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所有轉(zhuǎn)化體均產(chǎn)生了含所需胰高血糖素的融合蛋白質(zhì)。
(D)融合蛋白質(zhì)的溶解，用V8蛋白酶水解;胰高血糖素的分離和純化宿主細(xì)胞用上述表達(dá)載體(a)、(b)、(c)、(d)和(e)轉(zhuǎn)化后，在改良的M9培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集細(xì)胞并懸浮于緩沖溶液A(8g/l氯化鈉、0.2g/l氯化鉀、2.9g/lNa2HPO4·12H2O，0.2g/1KH2PO4，5mM EDTA，18mM β-巰基乙醇和10mM苯脒，pH6.65)中。經(jīng)攪拌后，離心該細(xì)胞懸液并洗滌所得細(xì)胞。將細(xì)胞重新懸浮于上述緩沖液A中，然后加入溶菌酶使其終濃度達(dá)到每克細(xì)胞含2mg(凈重)，并使混合物于35℃下反應(yīng)1小時(shí)。接著超聲處理并離心該反應(yīng)混合物，以回收呈沉淀團(tuán)塊形式的顆粒部分。最后分別按照下文(D-1)和(D-2)中所述的一步驟或兩步驟酶促反應(yīng)方法由這些顆粒部分中分離出胰高血糖素。
(D-1)以一步驟酶促反應(yīng)法分離將由上述表達(dá)載體(a)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中得到的顆粒部分懸浮于緩沖溶液A(含有6M鹽酸胍)中，所說緩沖溶液的量為細(xì)胞培養(yǎng)物初始體積的1/6。徹底攪拌并進(jìn)行超聲處理后，將混合物于室溫下放置2小時(shí)以使之溶解。然后離心除去尚未溶解的部分，并將上清液對含有2M的鹽酸胍的緩沖溶液B(50mM碳酸氫銨、5mMEDTA，pH7.8)透析過夜。將透析液與等量緩沖溶液B混合，使鹽酸胍濃度達(dá)到1M，并將所得樣品稱為(a)。對樣品(a)的SDS-PAGE分析表明，每升培養(yǎng)液中約產(chǎn)生1g(50μmol)人干擾素γ。根據(jù)該混合物中所存在的蛋白質(zhì)總量的比例，以1/10(W/W)比例向樣品(a)中加入得自金黃色葡萄球菌并能特異地切割谷氨酸基之肽鍵的蛋白酶V8(SigmaChemicalCo.No.P-8400)，使該混合物于37℃下反應(yīng)1小時(shí)。因?yàn)樗璧囊雀哐撬厥峭ㄟ^谷氨酸殘基與干擾素γ融合的，而且在胰高血糖素中沒有谷氨酸殘基，所以該蛋白酶V8處理可以以完整和未改變的形式分離到整個(gè)胰高血糖素分子。然而，以這種方法得到的樣品(b)中還含有因胰高血糖素與人干擾素γ分解而產(chǎn)生的各種長度的肽的混合物。為了除去這些有不同長度的肽類雜質(zhì)，可離心樣品(b)，除去沉淀物，并使用C柱(4.6mmi.d.×250mm)，對上清液進(jìn)行反相HPLC分離。初始洗脫液是混合的32%乙腈-0.1%三氟乙酸溶劑，洗脫是隨著漸漸增加乙腈的濃度進(jìn)行的，即從洗脫開始后5分鐘內(nèi)每分鐘增加0.5%，直到濃度達(dá)到42%為止。
結(jié)果如圖9a中所示。于相同條件下用HPLC法分析胰高血糖素標(biāo)準(zhǔn)品，并在相當(dāng)于滯留時(shí)間19.7分鐘的位置進(jìn)行檢測。此后，收集在相當(dāng)于圖9a中約20分鐘的位置洗脫的部分，并用離子交換HPLC法純化該部分。將含有胰高血糖素的洗脫部分引入裝有陽離子交換樹脂DEAE-5PW的柱(7.5mmi.d.×75mm)中，所說的樹脂是已用含有20%乙腈的10mMTris-HCl(pH8.5)(緩沖溶液C)緩沖的。用緩沖溶液C洗5分鐘后，于0-0.1M氯化鈉的線性濃度梯度下(即當(dāng)流速為1.0ml/分鐘時(shí)，氯化鈉濃度于30分鐘內(nèi)由0增加到0.1M)用緩沖溶液C洗脫所需材料。結(jié)果示于圖9b中。基于胰高血糖素標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫位置，進(jìn)一步證實(shí)該分析物的基本成分(滯留時(shí)間19.3分鐘，樣品(b))是胰高血糖素。然后按下述方法分析樣品(b)的氨基酸組成及氨基酸順序。這些分析的結(jié)果分別示于表1和2中。
氨基酸組成分析分析物用HPLC法(AquaporeRP-300柱，Brownlee)除鹽并于110℃下用4M甲磺酸(含有0.2%3-(2-氨乙基)吲哚)水解24小時(shí)。然后用Hitachi835型氨基酸分析儀檢測該水解產(chǎn)物的氨基酸組成。
氨基酸順序分析經(jīng)HPLC(AquaporeRP-300柱，Brownlee)脫鹽后，用AppliedBiosystems477A型蛋白質(zhì)順序分析儀檢測該分析物的氨基酸順序。
上述純化方法中，由1g(約50mol)融合蛋白質(zhì)約純化得到33mg(約10mol)胰高血糖素，即由每升培養(yǎng)液約得到33mg純胰高血糖素。但該方法中需要使用大量酶裂解谷氨酸殘基的肽鍵。
表1氨基酸組成氨基酸數(shù)目氨基酸測定值計(jì)算值A(chǔ)sp4.04Thr2.73Ser3.64Glu3.03Gly1.21Ala1.11Val1.01Met1.01Leu2.22Tyr2.02Phe2.02Lys1.21His1.01Arg1.92Trp1.11總計(jì)29
表2氨基酸順序分析降解步驟氨基酸殘基回收率(%)1His9.62Ser77.93Gln27.54Gly29.65Thr52.26Phe28.27Thr47.48Ser58.69Asp19.610Tyr16.111Ser42.512Lys8.713Tyr14.014Leu12.015Asp11.316Ser25.417Arg9.918Arg7.819Ala7.720Gln7.921Asp6.3
22Phe3.223Val2.924Gln6.625Trp1.026Leu1.827Met1.028Asn2.929Thr0.8(D-2)以兩步驟酶促反應(yīng)法分離按下述方法由用上述表達(dá)載體(a)、(b)、(c)、(d)和(e)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌所產(chǎn)生的顆粒部分中制備胰高血糖素。首先，將1g離心沉淀的顆粒部分溶解在35ml緩沖溶液1(8M鹽酸胍、50mM碳酸氫銨、5mM EDTA和10mM DTT，pH7.8)中。然后加入不含鹽酸胍的緩沖溶液2(50mM碳酸氫銨、5mM EDTA和10mM DTT，pH7.8)，將溶液中鹽酸胍的濃度調(diào)到2M，使蛋白濃度達(dá)到2-3mg/ml(用Proteinassay試劑盒(BioRad Co.)檢測)。然后向該溶液內(nèi)加入等于該混合物中蛋白質(zhì)量1/500(W/W)的金黃色葡萄球菌蛋白酶V8(Sigma Chemical Co.No.P-8400)，并在緩慢攪拌下于25℃進(jìn)行反應(yīng)。4小時(shí)后，加入鹽酸將溶液的pH調(diào)到3.0以終止反應(yīng)。在終止酶促反應(yīng)期間或其后取樣，使用Vydac Protein C4柱(0.46mm內(nèi)徑×15.0cm)進(jìn)行反相HPLC以檢測反應(yīng)產(chǎn)物。初始洗脫劑是混合的25%乙腈-0.1%三氟乙酸溶劑，洗脫過程中丙腈的濃度呈線性增加，于洗脫開始后25分鐘內(nèi)達(dá)到35%。分析結(jié)果表明，融合蛋白質(zhì)及小量胰高血糖素的部分分解產(chǎn)物是隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸產(chǎn)生的。
因此，酶促反應(yīng)之后應(yīng)離心除去反應(yīng)混合物中的不溶性材料，并使用SephadexG-15柱(5cm內(nèi)徑×30cm，容量590ml)。使用的洗脫劑為含有5mMEDTA的50mM乙酸緩沖溶液(pH3.3)，洗脫后回收含有中間產(chǎn)物和蛋白酶V8的高分子量部分。用氫氧化銨將該部分調(diào)至pH7.8，并在緩慢攪拌下于25℃再次進(jìn)行反應(yīng)。從而使反應(yīng)混合物中的蛋白酶V8復(fù)性并作用于中間產(chǎn)物，約5小時(shí)內(nèi)胰高血糖素即由所說的中間產(chǎn)物中釋放出來。向該反應(yīng)混合物中加入尿素使其終濃度達(dá)6M，然后用乙酸調(diào)pH至5.0，并使混合物終體積達(dá)到約200ml。使用預(yù)先用緩沖液3(用乙酸調(diào)至pH5.0的6M尿素溶液)平衡過的Sephadex柱(2.0cm內(nèi)徑×20.0cm，容量63ml，高流速型)對該混合物進(jìn)行離子交換層析。連續(xù)用120ml緩沖溶液3和120ml含有0.05M氯化鈉的緩沖溶液洗柱，除去未吸附的部分。然后于線性氯化鈉濃度梯度即緩沖溶液3中氯化鈉濃度由0.05M增加至0.15M的條件下(使用相當(dāng)于柱容量15倍的洗脫劑)進(jìn)行洗脫，并用約含有0.1M氯化鈉的緩沖液洗脫胰高血糖素。使用預(yù)先已用50mM乙酸平衡過的SephadexG-15柱(5cm內(nèi)徑×30cm，容量590ml)，以凝膠過濾層析法使胰高血糖素部分(約70ml)脫鹽。此時(shí)胰高血糖素的純度為大約97-98%，因此尚須用HPLC法進(jìn)一步純化。
將按上述凝膠過濾法制得的含胰高血糖素部分導(dǎo)入用25.0%乙腈-0.1%三氟乙酸平衡過的Vydac Protein C4柱(2.2cm內(nèi)徑×25cm，10-15μm填充孔徑300 )中，借助乙腈線性濃度梯度〔即乙腈濃度于120分鐘內(nèi)由25%增加到30%(流速4ml/分鐘)〕分離和純化胰高血糖素。此后胰高血糖素約洗脫90分鐘。對于分別用載體(a)、(b)和(e)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌來說，以這種方法制得的離心沉淀的顆粒部分，每克分別約產(chǎn)生16.3mg、21.9mg和23.1mg純胰高血糖素，而每克融合蛋白質(zhì)的相應(yīng)產(chǎn)率分別為49.0mg、65.8mg和69.4mg。如以表達(dá)載體(c)和(d)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，也可用相似方法得到純化的胰高血糖素。
使用下述方法分析由用表達(dá)載體(a)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生的純化之胰高血糖素的(ⅰ)純度，(ⅱ)氨基酸組成，(ⅲ)氨基酸順序及(ⅳ)生物學(xué)活性。
(ⅰ)純度使用Vydac Protein C4柱(0.46cm內(nèi)徑×15.0cm)以反相層析法檢測純度。使用的初始洗脫劑是混合的25%乙腈-0.1%三氟乙酸溶劑，借助由開始洗脫的25分鐘內(nèi)乙腈濃度增加到35%這一線性濃度梯度進(jìn)行洗脫。如此得到的HPLC洗脫曲線如圖10a所示，圖10c則顯示市售天然胰高血糖素(Sigma Chemical Co)的相應(yīng)洗脫曲線。從圖10a中可以看出，這種純化的胰高血糖素的洗脫曲線只展示單一峰，故其中不含有雜質(zhì)(即純度為100%)。此外，這種純化的胰高血糖素的洗脫滯留時(shí)間23.016分與圖10c中所示天然胰高血糖素的洗脫滯留時(shí)間相同，即23.088分鐘，此證明這種胰高血糖素確實(shí)與天然胰高血糖素完全相同。圖10b中顯示了按上述方法制得的另一胰高血糖素樣品的HPLC洗脫圖形。這種純化胰高血糖素的洗脫滯留時(shí)間是20.404分鐘，其純度為99.3%。分析用表達(dá)載體(b)-(e)轉(zhuǎn)化之轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的純化胰高血糖素制劑，基本上都得到同樣的結(jié)果。
(ⅱ)氨基酸組成分析氨基酸組成之前，先于110℃下用含有0.2%3-(2-氨乙基)吲哚的4M甲磺酸將分析物水解24小時(shí)，然后用Hitachi835型氨基酸分析儀測定樣品的氨基酸組成。結(jié)果(如表3所示)表明，用表達(dá)載體(a)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生之純化胰高血糖素的氨基酸組成比例與理論值完全相同。分析用表達(dá)載體(b)-(e)轉(zhuǎn)化之轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的純化胰高血糖素制劑，基本上都得到同樣的結(jié)果。
(ⅲ)氨基酸順序分析使用AppliedBiosystems477A型蛋白質(zhì)順序儀檢測用表達(dá)載體(a)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生之純化胰高血糖素的氨基酸順序。這一分析結(jié)果(如表4所示)表明，用表達(dá)載體(a)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌所產(chǎn)生之純化胰高血糖素的氨基酸順序與天然胰高血糖素完全相同。分析用表達(dá)載體(b)-(e)轉(zhuǎn)化之轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的純化胰高血糖制劑，基本上都得到了同樣的結(jié)果。
表3氨基酸組成氨基酸數(shù)目氨基酸測定值計(jì)算值A(chǔ)sp4.04Thr2.83Ser3.74Glu3.13Pro0.00Gly1.01Ala1.01Cys/20.00Val0.91Met1.01Ile0.00Leu2.12Tyr2.02Phe2.02Lys1.11His1.01Trp1.11Arg2.02總計(jì)29
表4氨基酸順序分析降解步驟氨基酸殘基測定的氨基酸量(pmol)1His13332Ser8853Gln14124Gly15975Thr11466Phe24737Thr5508Ser3339Asp97510Tyr116211Ser35712Lys65813Tyr80414Leu102315Asp70116Ser21317Arg52918Arg55119Ala77920Gln63921Asp52322Phe464
23Val53724Gln17825Trp10926Leu35627Met27728Asn27829Thr31上樣量＝3856pmol(ⅳ)生物學(xué)活性使用大鼠肝細(xì)胞膜部分進(jìn)行受體分析，使用游離的大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行cAMP反應(yīng)分析，并研究由灌注的肝標(biāo)本釋放的葡萄糖量，以這些作為生物學(xué)活性的指標(biāo)。結(jié)果表明，在所有分析中，由用表達(dá)載體(a)-(e)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生的純化胰高血糖素具有與天然胰高血糖素同樣的活性，故再次證明這些產(chǎn)物是與天然胰高血糖素完全相同的。
應(yīng)明確的是，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不超出本發(fā)明范圍和精神的前提下，對本發(fā)明所作的各種其他改動(dòng)都將是顯而易見和容易做到的。因此，本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍不僅限于本說明書中描述的具體內(nèi)容，這些權(quán)利要求應(yīng)包括有新穎性的所有特征以及被本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員視為等同物的所有特征。
權(quán)利要求
1.一種制備胰高血糖素的方法，其包括制備下式所示的融合蛋白質(zhì)X-Glu-Glucagon(Ⅰ)其中X是70-170個(gè)氨基酸的先導(dǎo)順序，Glu是谷氨酸殘基，Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸順序，以及用可特異地水解谷氨酸殘基羧基端肽鍵的酶處理所說的融合蛋白質(zhì)，以裂解所說的融合蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的順序X含有干擾素γ、△Cys干擾素γ，或干擾素α80A2之氨基末端順序的一部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的胰高血糖素氨基酸順序如下式所示HisSerGlnGlyThyPheThrSerAspTyrSerLysTyrLeuAspSerArgArgAlaGlnAspPheValGlnTrpLeuMetAsnThr(Ⅱ)
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的融合蛋白質(zhì)是通過培養(yǎng)將表達(dá)式Ⅰ所示融合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌所得到的轉(zhuǎn)化體而制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的胰高血糖素是經(jīng)下述程序回收的，包括(a)用適當(dāng)?shù)淖冃詣┗虮砻婊钚詣┤芙馑f的融合蛋白質(zhì)，(b)降低所說變性劑或表面活性劑的濃度，(c)向步驟(b)中制得的混合物中加入酶，從而得到含有因所說融合蛋白質(zhì)部分分解而產(chǎn)生之可溶性中間產(chǎn)物的反應(yīng)混合物，(d)將所說的反應(yīng)混合物脫鹽，以得到含有所說中間產(chǎn)物和所說的酶，且不含有所說變性劑與表面活性劑的部分，(e)借助所說部分中含有的酶使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，以釋放出胰高血糖素，以及(f)回收釋放的胰高血糖素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的酶是得自金黃色葡萄球菌的蛋白酶V8。
7.編碼胰高血糖素的DNA順序，該順序如下式所示5′-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAATACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAGTGGCTGATGAACACC-3′(Ⅲ)
8.含有編碼下式所示融合蛋白質(zhì)之DNA順序的表達(dá)載體X-Glu-Glucagon(Ⅰ)其中X是70-170個(gè)氨基酸的先導(dǎo)順序，Glu是谷氨酸殘基，且Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸順序。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其選自于TrppAThuIFNγ/glucagon、TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon、TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon、TrppAThuIFNα80A2/glucagon及TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon。
10.通過向大腸桿菌內(nèi)導(dǎo)入權(quán)利要求8或9的表達(dá)載體而得到的轉(zhuǎn)化體。
11.一種純度為99%或99%以上的純化的胰高血糖素，所說的純度是用高效液相層析法測定的。
全文摘要
提供一種生產(chǎn)胰高血糖素的新方法。該方法包括制備由下式代表的融合蛋白質(zhì)X-GLu-GLucagon (I)其中X是有70-170個(gè)氨基酸的先導(dǎo)順序，GLu是谷氨酸殘基，且GLucagon代表胰高血糖素的氨基酸順序，以及用能夠在谷氨酸殘基的羧基端特異地水解肽鍵的酶處理該融合蛋白質(zhì)，從而裂解該融合蛋白質(zhì)。
文檔編號C07K1/20GK1046559SQ9010116
公開日1990年10月31日 申請日期1990年2月1日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月1日
發(fā)明者石崎順, 玉木幹男, 新優(yōu), 寺岡宏, 吉田信男, 續(xù)木博茂 申請人:鹽野義制藥株式會社