一組蛇毒來源的活性肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一組蛇毒來源的活性肽的制備方法及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用。具體涉及一種用化學(xué)方法制備N端為焦谷氨酸的肽類化合物，以及這類肽化合物在抗腫瘤領(lǐng)域的具體用途。本發(fā)明還涉及焦谷氨酰賴氨酰色氨酸（pyroGlu-Lys-Trp）、焦谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸（pyroGlu-Asn-Trp）或焦谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸（pyroGlu-Gln-Trp）的化學(xué)合成方法，以及該三肽化合物在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用。
【專利說明】一組蛇毒來源的活性肽的制備方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年4月29日，申請(qǐng)?zhí)枮?01010158898.7，發(fā)明名稱為一組蛇毒來源的活性肽的制備方法及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用化學(xué)方法制備N端為焦谷氨酸的肽類化合物，以及這類肽化合物在抗腫瘤領(lǐng)域的具體用途。
【背景技術(shù)】
[0003]蛇毒是由毒蛇的毒腺分泌的天然混合物，包括蛋白、多肽和酶類，具有抗凝、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等生物活性，是研究開發(fā)新藥的重要天然化合物庫之一。蛇毒中的抗腫瘤組分主要有解離素、細(xì)胞毒素和能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的酶類及其他蛋白和多肽因子。CN101177452A公開了從斷尾蝮蛇中制備具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移活性的解離素的方法；CN101270159A公開了一種抗腫瘤細(xì)胞毒素，分子量為6kDa ；CN101429525A公開了表達(dá)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的蛇毒金屬蛋白酶抑制劑的方法，該抑制劑分子量為46kDa;CN1781551A公開了一種蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑，能夠抑制腫瘤細(xì)胞侵襲，其分子量約為lOOkDa。這類大分子蛋白在發(fā)揮其抗腫瘤活性的同時(shí)，也表現(xiàn)出了強(qiáng)免疫原性以及易被蛋白酶水解，半衰期短等缺點(diǎn)，故而制約了其臨床應(yīng)用。因此，有必要利用蛇資源，開發(fā)蛇毒中的小分子抗腫瘤藥物。
[0004]Ka1-Fa Hang等曾報(bào)道了在竹葉青蛇毒中發(fā)現(xiàn)了 3個(gè)分子量在1000以下的具有抑制金屬蛋白酶活性的小肽，參見:Ka1-Fa Hang, Chin-Chun Hang, Shih-HsiungWu 等，Characterization of Three Endogenous Peptide Inhibitors for MultipleMetalloproteinases with Fibrinogenolytic Activity from the Venom of TaiwanHabu {Jrimeresursu mucrosquamatus)，Biochemical And Biophysical ResearchCommunications.1998,248:562_566。這三個(gè)具有抑制金屬蛋白酶活性的小肽均為三肽，且其N末端均是焦谷氨酸。CN101058572A公布了從皖南尖吻蝮蛇中分離具有抑制肝腫瘤細(xì)胞增殖活性小肽的方法，其分子量為429，與上述Ka1-Fa Hang等報(bào)道的三個(gè)多肽中的其中一個(gè)為同一物質(zhì)?？傮w上目前對(duì)蛇毒中小分子活性肽，特別是3KDa以下的短肽的研究開發(fā)還遠(yuǎn)不及大分子蛋白深入。同時(shí)小分子活性多肽在粗毒中含量非常低，因而從少量粗毒樣品中提取活性肽往往達(dá)不到研究用量，從大量粗毒原料中雖然能夠獲得足夠量的活性肽，但是顯然增加了研究和開發(fā)成本。鑒于小分子肽類化合物僅由幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸構(gòu)成，序列較容易確定，因而利用多肽固相合成技術(shù)可以很容易制備大量活性肽，解決了從粗毒中提取量少的難題。但是某些蛇毒活性肽的N端常為焦谷氨酸，具體參見:梁寧生，蛇毒中的降壓組分-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，中國(guó)《蛇志》雜質(zhì)，1993，5 (3) 2-5。焦谷氨酸是谷氨酸通過環(huán)化后形成的，該步反應(yīng)是在蛇毒的毒腺中通過焦谷氨酸化酶催化完成的，但是目前暫沒有從蛇的毒腺中提取焦谷氨酸化酶或利用其它手段將多肽N端谷氨酸環(huán)化的報(bào)道。由于現(xiàn)有的固相合成技術(shù)通常只能夠提供N端是谷氨酸的多肽，因而需要對(duì)N端谷氨酸進(jìn)行環(huán)化處理，以達(dá)到預(yù)期的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種制備N端為焦谷氨酸的寡肽的方法，該方法包括: 方法(一):將N端為谷氨酸的寡肽樣品溶解在pH值2飛的緩沖液中，加入催化量的
CuCl2，于6(T95°C加熱，將溶液冷凍干燥后即得相應(yīng)的N端為焦谷氨酸的寡肽?；?br> 方法(二):將N端為谷氨酸的寡肽樣品在固相下均勻加熱，得到相應(yīng)的N端為焦谷氨酸的寡肽。其中，均勻加熱的方式例如:將樣品在導(dǎo)熱良好的金屬板上鋪成薄層然后加熱，為達(dá)到此目的可以采取其他類似的加熱手段，如微波加熱、鋪成薄層光照加熱等。
[0006]上述方法中，其中寡肽是指氨基酸數(shù)目少于等于10的多肽，優(yōu)選氨基酸數(shù)為3的寡肽。
[0007]上述方法(一)中，緩沖液的pH優(yōu)選為3.5^4.5，緩沖液可以是甲酸銨緩沖液、乙酸銨緩沖液或磷酸鹽緩沖液等，所述甲酸銨緩沖液是指甲酸銨和甲酸構(gòu)成的緩沖溶液；所述乙酸銨緩沖液是指乙酸銨和乙酸構(gòu)成的緩沖溶液；所述的磷酸鹽緩沖液是指陰離子為Ρ043_、ΗΡ042_、Η2Ρ04_，陽離子為H +、Na+或/和K+構(gòu)成的緩沖溶液。優(yōu)選使用磷酸鹽緩沖溶液，更優(yōu)選磷酸的納鹽緩沖溶液或磷酸的鉀鹽緩沖溶液。緩沖液中樣品濃度為0.f 10mg/ml，優(yōu)選為0.5~3mg/ml。催化量的CuCl2可以以固體的形式加入，也可以配置成溶液滴加，優(yōu)選配置成0.05-0.2mol/l的CuCl2滴加I~10滴。加熱溫度優(yōu)選為60~90。。，更優(yōu)選80~90。。，加熱時(shí)間I~4h，優(yōu)選1.5~3h。
[0008]上述方法(二)中，優(yōu)選在10(Tl50°C加熱0.5~4h，更優(yōu)選在12(Tl30°C加熱I~2h。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供了下述三個(gè)三肽化合物的制備方法。本發(fā)明所稱的“三肽化合物”，如無特別說明即是指下述三個(gè)具體的三肽中的一個(gè)或全部:焦谷氨酰賴氨酰色氨酸(pyroGlu-Lys-Trp )、焦谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸(pyroGlu-Asn-Trp )、焦谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸(pyroGlu-Gln-Trp)。所述的三肽化合物均為現(xiàn)有技術(shù)公開過的從蛇毒中提取的寡肽。所述的“原料三肽”是谷氨酰賴氨酰色氨酸(Glu-Lys-Trp)、谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸(Glu-Asn-Trp )、谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸(Glu-Gln-Trp )。
[0010]上述三個(gè)三肽化合物的制備方法包括:
方法(一):將N端為谷氨酸的原料三肽樣品溶解在pH值2飛的緩沖液中，加入催化量的CuCl2,于6(T95°C加熱，將溶液冷凍干燥后即得相應(yīng)的N端為焦谷氨酸的三肽化合物?；蚍椒?二):將N端為谷氨酸的原料三肽樣品在固相下均勻加熱，得到相應(yīng)的N端為焦谷氨酸的三肽化合物。其中，均勻加熱的方式例如:將樣品在導(dǎo)熱良好的金屬板上鋪成薄層然后加熱，為達(dá)到此目的可以采取其他類似的加熱手段，如微波加熱、鋪成薄層光照加熱等。
[0011]上述方法(一)中，緩沖液的pH優(yōu)選為3.5~4.5，緩沖液可以是甲酸銨緩沖液、乙酸銨緩沖液或磷酸鹽緩沖液等，所述甲酸銨緩沖液是指甲酸銨和甲酸構(gòu)成的緩沖溶液；所述乙酸銨緩沖液是指乙酸銨和乙酸構(gòu)成的緩沖溶液；所述的磷酸鹽緩沖液是指陰離子為Ρ043_、ΗΡ042_、Η2Ρ04_，陽離子為H +、Na+或/和K+構(gòu)成的緩沖溶液。優(yōu)選使用磷酸鹽緩沖溶液，更優(yōu)選磷酸的納鹽緩沖溶液或磷酸的鉀鹽緩沖溶液。緩沖液中樣品濃度為0.f 10mg/ml，優(yōu)選為0.5~3mg/ml。催化量的CuCl2可以以固體的形式加入，也可以配置成溶液滴加，優(yōu)選配置成0.05-0.2mol/l的CuCl2滴加I~10滴。加熱溫度優(yōu)選為60~90。。，更優(yōu)選80~90。。，加熱時(shí)間I~4h，優(yōu)選1.5~3h。
[0012]上述方法(二)中，優(yōu)選在10(Tl5(rC加熱0.5~4h，更優(yōu)選在12(Tl30°C加熱I~2h。
[0013]本發(fā)明僅涉及N末端為谷氨酸的寡肽或原料三肽經(jīng)過焦谷氨酸化成為相應(yīng)的N末端為焦谷氨酸的寡肽或三肽化合物，并不涉及肽鍵的形成。所述的N末端為谷氨酸的寡肽或原料三肽可以通過現(xiàn)有多肽合成技術(shù)獲得，如固相合成、液相合成、酶合成等，也可以由天然產(chǎn)物提取得到。
[0014]本發(fā)明所述三肽化合物的結(jié)構(gòu)確證:經(jīng)過質(zhì)譜分析采用本方法制備得到的三個(gè)三肽化合物的相對(duì)分子質(zhì)量分別為:443、429和443。紫外吸收光譜掃描結(jié)果顯示，三個(gè)樣品均在280nm有最大吸收。對(duì)三個(gè)樣品分別進(jìn)行茚三酮反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果均不顯色，提示樣品N端-NH2封閉，即N端為焦谷氨酸。氨基酸測(cè)序表明:三個(gè)樣品從C端到N端的氨基酸分別為Trp和Lys，Trp和Asn或Trp和Gin。綜上數(shù)據(jù)分析得到的三個(gè)三肽化合物分別為:pyroGlu-Lys-Trp, pyroGlu—Asn—Trp，pyroGlu-Gln—Trp。
[0015]本發(fā)明所述的制備方法還可以包括如下的純化步驟，所述的純化步驟包括將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步用制備型HPLC進(jìn)行反相層析純化。其中所用的層析柱可以為本領(lǐng)域常用的反相介質(zhì)為填料的層析柱；優(yōu)選硅膠為骨架，表面鍵合有C18或CS反相層析介質(zhì)的層析柱；最優(yōu)選硅膠為骨架，表面鍵合C18反相層析介質(zhì)的層析柱。純化所采用的洗脫方式優(yōu)選為梯度洗脫。流動(dòng)液優(yōu)選由三氟乙酸(TFA)水溶液和三氟乙酸(TFA)乙腈溶液組成，更優(yōu)選三氟乙酸(TFA)水溶液的濃度為0.05-0.2%，三氟乙酸(TFA)乙腈溶液的濃度為0.05-0.2%的流動(dòng)相；最優(yōu)選三氟乙酸(TFA)水溶液的濃度為0.1%，三氟乙酸(TFA)乙腈溶液的濃度為0.1%的流動(dòng)相。
[0016]本發(fā)明所述的制備方法簡(jiǎn)便易行、所用的原料易于獲得，成本低廉。并且該方法所得到產(chǎn)品易于后續(xù)處理，能夠得到純度很高的產(chǎn)品。
[0017]本發(fā)明的再一個(gè)`方面在于提供所述寡肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。發(fā)明人通過體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法所制備的pyroGlu-Lys-Trp、pyroGlu-Asn-Trp和pyroGlu-Gln-Trp三肽化合物對(duì)胃腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1:pyroGlu-Lys-Trp 三肽質(zhì)譜圖 圖2:pyroGlu-Asn-Trp三肽質(zhì)譜圖
圖3:pyroGlu-Gln-Trp三肽質(zhì)譜圖 圖4:pyroGlu-Asn-Trp高分辨率質(zhì)譜圖 圖 5:pyroGlu-Lys-Trp 三肽的 RP-HPLC 圖譜 圖 6:pyroGlu-Asn-Trp 三肽的 RP-HPLC 圖譜 圖 7:pyroGlu-Gln-Trp 三肽的 RP-HPLC 圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1:N端為谷氨酸的多肽樣品的合成
稱取Fmoc-Trp-Wang Resin 0.6779g (0.59mmol/g)置于多肽合成儀的反應(yīng)器中，加入IOmlDMF混合I小時(shí)，使樹脂充分溶脹。加入25%PIP (DMF)溶液10ml，混合30min后，用DMF洗滌，洗滌結(jié)束后即可進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)?；旌戏磻?yīng)器中加入0.7591g Fmoc-Lys (Trt) -0H,0.64mol/L HOBT (DMF)溶液 2.5 ml,0.53mol/L DIC (DMF)溶液 3 ml 和 DMF 3ml 進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為室溫，以茚三酮反應(yīng)確定反應(yīng)終點(diǎn)，得到Fmoc-Lys(Trt)-Trp-Wang Resin。
[0020]偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，用IOml DMF洗滌，加入25% PIP的DMF溶液10ml，進(jìn)行脫保護(hù)30min，反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌，向反應(yīng)器加入0.6831g Fmoc-Glu(OtBU)-0H，以及0.64mol/L HOBT (DMF)溶液 2.5 ml,0.53mol/L DIC (DMF)溶液 3 ml 和 DMF 3ml 進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為室溫，以茚三酮反應(yīng)確定反應(yīng)終點(diǎn)，最終得到Fmoc -Glu (OtBU) -Lys (Trt) -Trp-WangResin0
[0021]真空干燥合成的樹脂肽，加入裂解試劑進(jìn)行裂解。裂解試劑的配比為:TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水/TIS=82/3/5/5/4/l，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，裂解結(jié)束后，用石英漏斗進(jìn)行抽濾，樹脂加少量TFA洗滌，合并抽濾液，向裂解抽濾液中，按10倍量加入冰乙醚，沉淀多肽，離心，棄上清，沉淀再加乙醚洗漆離心6次,真空干燥,稱重得Glu-Lys-Trp 0.40241g。 [0022]以 0.7011g Fmoc-Trp-Wang Resin (0.59mmol/g)>0.9426g Fmoc-Asn(Trt)-OH和0.704gFmoc-Glu (OtBU) -OH 為原料，同法合成可得到 Glu-Asn-Trp 0.18803g。
[0023]以 0.7124g Fmoc-Trp-Wang Resin (0.59mmol/g)、l.027g Fmoc-Gln(Trt)-OH和0.715gFmoc-Glu (OtBU)-OH 為原料，同法合成可得到 Glu-Gln-Trp 0.22254g。
[0024]實(shí)施例2
將實(shí)施例1得到的Glu-Lys-Trp三肽溶解在pH為2的磷酸鈉鹽緩沖液中，控制樣品濃度為lmg/ml，加入0.lmol/1的CuCl2三滴。于60°C水浴加熱4h，將溶液冷凍干燥后即得pyroGlu-Lys-Trpo產(chǎn)物使用Q-Tof mirco (Waters公司)質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,見附圖1。
[0025]實(shí)施例3
將實(shí)施例1得到的Glu-Gln-Trp溶解在pH為6的磷酸鈉鹽緩沖液中，控制樣品濃度為3mg/ml，加入0.lmol/1的CuCl2三滴。于85°C水浴加熱2h，將溶液冷凍干燥后即得pyroGlu-Gln-Trp。產(chǎn)物使用Q-Tof mirco (Waters公司)質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,見附圖3。
[0026]實(shí)施例4
將實(shí)施例1得到的Glu-Asn-Trp溶解在pH為4磷酸鉀鹽緩沖液中，控制樣品濃度為10mg/ml，加入0.2mol/l的CuCl2三滴。于90°C水浴加熱2h，將溶液冷凍干燥后即得pyroGlu-Asn-Trp。進(jìn)一步純化后可得純度大于98%的終產(chǎn)物。
[0027]純化條件:
層析柱:Waters 公司 Sunfire C18 OBD (10 μ m) ;1.9X150mm
柱體積(CV):42.5 ml
流速:10.0 ml/min
流動(dòng)液組成A:0.2%TFA水溶液 B:0.2% TFA的乙腈溶液 檢測(cè)波長(zhǎng):215nm
梯度洗脫并收集洗脫液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行峰純度分析，根據(jù)面積歸一化法將純度在98%以上的洗脫液按峰合并。減壓蒸餾除去乙腈后將樣品冷凍干燥。反相高效液相(RP-HPLC )色譜圖見附圖6。
[0028]產(chǎn)物使用Q-Tof mirco (Waters公司)質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,見附圖2。[0029]產(chǎn)物使用Q-Tof mirco (Waters公司)質(zhì)譜儀進(jìn)行高分辨率質(zhì)譜分析,見附圖4。
[0030]實(shí)施例5
將實(shí)施例1得到的Glu-Lys-Trp溶解在pH為3.5的乙酸銨緩沖液中，控制樣品濃度為
0.5mg/ml，調(diào)節(jié)，加入0.lmol/1的CuCl2三滴。于80°C水浴加熱2h，將溶液冷凍干燥后即得pyroGlu-Lys-Trp。進(jìn)一步純化后可得純度大于98%的終產(chǎn)物。
[0031]純化條件:
層析柱:Waters 公司 Sunfire C18 OBD (10 μ m) ;1.9X150mm
柱體積(CV):42.5 ml
流速:10.0 ml/min
流動(dòng)液組成A:0.1%TFA水溶液 B:0.1% TFA的乙腈溶液 檢測(cè)波長(zhǎng):215nm
梯度洗脫并收集洗脫液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行峰純度分析，根據(jù)面積歸一化法將純度在98%以上的洗脫液按峰合并。減壓蒸餾除去乙腈后將樣品冷凍干燥。反相高效液相(RP-HPLC )色譜圖見附圖5。
[0032]實(shí)施例6
將實(shí)施例1得到的Glu-Gln-Trp溶解在pH為4.5的甲酸銨緩沖液中，控制樣品濃度為8mg/ml，加入0.lmol/1的CuCl2三滴。于75°C水浴加熱3h，將溶液冷凍干燥后即得pyroGlu-Gln-Trp。進(jìn)一步純化后可得純度大于98%的終產(chǎn)物。
[0033]純化條件:`
層析柱:Waters 公司 Sunfire C18 OBD (10 μ m) ;1.9X150mm
柱體積(CV):42.5 ml
流速:10.0 ml/min
流動(dòng)液組成A:0.1%TFA水溶液 B:0.1% TFA的乙腈溶液 檢測(cè)波長(zhǎng):215nm
梯度洗脫并收集洗脫液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行峰純度分析，根據(jù)面積歸一化法將純度在98%以上的洗脫液按峰合并。減壓蒸餾除去乙腈后將樣品冷凍干燥。反相高效液相(RP-HPLC )色譜圖見附圖7。
[0034]實(shí)施例7
將實(shí)施例1得到的Glu-Lys-Trp鋪成薄層，于100°C加熱lh，促使焦谷氨酸化，即得pyroGlu-Lys-Trp.,反應(yīng)后樣品進(jìn)一步純化后可得純度大于98%的焦谷氨酸化樣品。
[0035]實(shí)施例8
將實(shí)施例1得到的Glu-Asn-Trp鋪成薄層，于150°C加熱lh，促使焦谷氨酸化，即得pyroGlu-Asn-Trp。反應(yīng)后樣品進(jìn)一步純化后可得純度大于98%的焦谷氨酸化樣品。
[0036]純化條件:
層析柱:Waters 公司 Sunfire C18 OBD (10 μ m) ;1.9X150mm
柱體積(CV):42.5 ml
流速:10.0 ml/min
流動(dòng)液組成A:0.2%TFA水溶液 B:0.2% TFA的乙腈溶液 檢測(cè)波長(zhǎng):215nm梯度洗脫并收集洗脫液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行峰純度分析，根據(jù)面積歸一化法將純度在98%以上的洗脫液按峰合并。減壓蒸餾除去乙腈后將樣品冷凍干燥。
[0037]實(shí)施例9
將實(shí)施例1得到的Glu-Gln-Trp鋪成薄層，于125°C加熱lh，促使焦谷氨酸化，即得pyroGlu-Gln-Trp。反應(yīng)后樣品進(jìn)一步純化后可得純度大于98%的焦谷氨酸化樣品。
[0038]純化條件:
層析柱:Waters 公司 Sunfire C18 OBD (10 μ m) ;1.9X150mm
柱體積(CV):42.5 ml
流速:10.0 ml/min
流動(dòng)液組成A:0.05%TFA水溶液 B:0.05% TFA的乙腈溶液 檢測(cè)波長(zhǎng):215nm
梯度洗脫并收集洗脫液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行峰純度分析，根據(jù)面積歸一化法將純度在98%以上的洗脫液按峰合并。減壓蒸餾除去乙腈后將樣品冷凍干燥。
[0039]實(shí)施例10:體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性篩選
實(shí)驗(yàn)方法:將處于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人低分化胃腺癌細(xì)胞BGC-823、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721分別按一定的細(xì)胞量(2500-4000/孔)接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后分別加入以上實(shí)施例制備的焦環(huán)化的三肽樣品，細(xì)胞在37°C，5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，加入MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，用DMSO溶解，在酶標(biāo)儀490nm下進(jìn)行檢測(cè)。具體數(shù)據(jù)見表一。
[0040]表一:PyroGlu-Lys-Trp對(duì)人低分化胃腺癌細(xì)胞BGC-823、乳腺癌細(xì)胞
【權(quán)利要求】
1.一種三肽化合物的制備方法，特征為將N端為谷氨酸的原料三肽溶解在pH值為2飛的緩沖液中，加入催化量的CuCl2,于6(T95°C加熱，將溶液冷凍干燥后即得相應(yīng)的N端為焦谷氨酸的三肽化合物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，特征在于緩沖液的pH值為3.5^4.5。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中緩沖液是磷酸鹽緩沖液。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，特 征在于緩沖液中樣品濃度為0.riOmg/mL.
【文檔編號(hào)】C07K1/107GK103554221SQ201310493979
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2010年4月29日
【發(fā)明者】吳勇, 馮軍, 張喜全, 徐宏江, 薛春佳, 馬宇旋 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司