專利名稱：桑黃菌中一種土青木香烷型倍半萜的分離技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領域。
背景技術：
桑黃，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，后變無毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質.菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。 目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應用最多的當屬柱層析法，分為兩類:一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本發(fā)明使用多種層析技術相結合，分離度高，應用此發(fā)明可以精致到純品。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中土青木香燒型倍半職的分離技術。首制備桑黃菌粗提物，然后是正相硅膠層析，使用氯仿與甲醇梯度洗脫，重復一次正相硅膠層析，使用石油醚與丙酮做洗脫劑，接著進行氯仿甲醇凝膠層析，然后是甲醇凝膠層析，再次進行正相硅膠層析，最后減壓蒸干得到土青木香烷型倍半萜。即I (10)-9-土青木香酮。此化合物的具體作用目前尚未有相關報道。本發(fā)明的技術方案如下:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內，以20 35°C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當pH值降到
2.5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0.5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；
(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一正相硅膠層析一石油醚與丙酮梯度洗脫一TLC檢測一甲醇凝膠層析一正相硅膠層析一TLC檢測一減壓蒸干一無色油狀物(土青木香烷型倍半萜)。具體方法為:
(1)制備桑黃菌粗提物；
(2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次，得到 洗脫液；
(3)將步驟(2)中最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；
(4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿:甲醇=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；
(5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進行甲醇凝膠層析，用洗脫劑洗脫；
(6)將步驟(5)得到的產(chǎn)物再次進行正相硅膠層析，使用甲醇與氯仿做洗脫劑；
(7)收集步驟(6)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥即為土青木香烷型倍半萜。


圖1為土青木香烷型倍半萜的結構式；
圖2為土青木香烷型倍半萜的一維核磁共振H譜。
具體實施例方式實例1:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量
0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。將上述得物稱取300g與等體積100目正相硅膠，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠，柱高1.4m，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1-200:1，分別洗脫2，3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1，F(xiàn)r_2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇:氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析，洗脫劑為氯仿:甲醇=1:1。使用TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓蒸干，進行甲醇凝膠層析，用甲醇洗脫，再次使用正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿:甲醇=80:1，收集洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，，展開 劑為石油醚:丙酮=30:1-35:1，合并收集出現(xiàn)斑點的洗脫液。減壓干燥，進行ID-13CNMR核磁共振分析，頻率為400 MHz，6 5.72 (s, 1H)，2.51-2.36 (m, 1H), 2.25 (d, J = 14.8 Hz, 1H)，1.89 - 1.76 (m, 2H)，1.73 (d, J =8.0 Hz, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.43 - 1.33 (m, 3H)，1.26 (s, 3H), 1.20 (d, J = 6.5Hz, 6H), 1.06 (d, J = 6.9 Hz, 3H).分析結果為證明是為土青木香烷型倍半萜。實例2:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內，以30°C溫度，搖瓶轉速為180r/min，pH6條件下，震動培養(yǎng)15天；培養(yǎng)中當pH值降到2.5時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度30°C，發(fā)酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.1vvm,攪拌速度180轉/分的條件，培養(yǎng)15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到70% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。
將上述得物稱取IOOg與等體積100目正相硅膠，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為300目正相硅膠，柱高0.8m，直徑14cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1-200:1，分別洗脫1，2個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇:氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析，洗脫劑為氯仿:甲醇=1:1。使用TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓蒸干，進行甲醇凝膠層析，用甲醇洗脫，再次使用正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿:甲醇=75:1，收集洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，，展開劑為石油醚:丙酮=30:1-35:1，合并收集出現(xiàn)斑點的洗脫液。減壓干燥，進行ID-13CNMR核磁共振分析，頻率為400 MHz，6 5.72 (s, 1H)，2.51-2.36 (m, 1H)，2.25 (d, J = 14.8 Hz, 1H)，1.89 - 1.76 (m, 2H)，1.73 (d, J =8.0 Hz, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.43 - 1.33 (m, 3H)，1.26 (s, 3H)，1.20 (d, J = 6.5Hz, 6H), 1.06 (d, J = 6.9 Hz, 3H).分析結果為證明是為土青木香烷型倍半萜。
權利要求
1.桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其步驟順序如下: (1)制備桑黃菌粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液； (3)將步驟(2)中最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿:甲醇=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進行甲醇凝膠層析，用洗脫劑洗脫； (6)將步驟(5)得到的產(chǎn)物再次進行正相硅膠層析，使用甲醇與氯仿做洗脫劑； (7)收集步驟(6)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥即為土青木香烷型倍半萜。
2.如權利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得: (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5`% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05% (2)如權利要求1所述桑黃粗提物的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內，以20 35 °C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當pH值降到2.5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0.5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ； (5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。
3.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于所述的土青木香燒型倍半職為I (10) _9_ 土青木香酮。
4.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠。
5.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
6.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚與丙酮。
7.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為SephadexLH-20或者Sephadex LH-18,洗脫劑為氯仿:甲醇=1:1。
8.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的凝膠洗脫劑為甲醇。
9.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(6)所述的層析硅膠為200-300目。
10.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(6)所述的洗脫劑，氯仿:甲醇=100:1-50:1。
11.如權利要求1所述的桑黃菌中土青木香烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(7)所述的檢測 要點是出現(xiàn)斑點，展開劑為石油醚:丙酮=30:1-35:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中土青木香烷型倍半萜的分離技術。首制備桑黃菌粗提物，然后是正相硅膠層析，使用氯仿與甲醇梯度洗脫，重復一次正相硅膠層析，使用石油醚與丙酮做洗脫劑，接著進行氯仿甲醇凝膠層析，然后是甲醇凝膠層析，再次進行正相硅膠層析，最后減壓蒸干得到土青木香烷型倍半萜。
文檔編號C07C49/643GK103102257SQ20131003592
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權日2013年1月30日
發(fā)明者宋愛榮, 趙晨, 孫效樂, 王光遠, 秦丹 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學