細(xì)胞滲透型抗dna抗體和其抑制dna修復(fù)的用途
【專(zhuān)利摘要】提供滲透細(xì)胞核并抑制DNA修復(fù)或干擾DNA代謝的抗體用于治療癌癥（直接地以及通過(guò)使癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷型治療敏感）或者抑制或預(yù)防病毒感染、增殖或代謝。所述方法涉及用含有細(xì)胞滲透型抗DNA抗體或其衍生物的組合物處理細(xì)胞，單獨(dú)或與誘導(dǎo)DNA損傷的治療（例如DNA損傷型化學(xué)療法或放射）組合。細(xì)胞滲透型抗DNA抗體或其衍生物的影響在DNA修復(fù)不足的癌細(xì)胞中得到增強(qiáng)，并且細(xì)胞滲透型抗DNA抗體或其衍生物對(duì)DNA修復(fù)不足的癌細(xì)胞具有合成致死性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】細(xì)胞滲透型抗DNA抗體和其抑制DNA修復(fù)的用途
[0001]相關(guān)申請(qǐng)案的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)案要求2011年4月I日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/470，918號(hào)的權(quán)利，其以全文引用的方式并入本文中。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦政府贊助研究或開(kāi)發(fā)的聲明
[0004]本發(fā)明是在政府支持下根據(jù)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予皮特?格雷澤(Peter GlazerMA協(xié)議POl CA129186進(jìn)行。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明大體上是關(guān)于用于治療癌癥的抗體療法領(lǐng)域，并且更特定地是關(guān)于細(xì)胞滲透型抗DNA抗體用于抑制DNA修復(fù)、使細(xì)胞對(duì)放射療法和DNA損傷型化學(xué)療法敏感以及選擇性地殺死先前已存在DNA修復(fù)不足的癌細(xì)胞的用途。
【背景技術(shù)】
[0006]大部分癌癥療法因非特異性組織毒性所引起的顯著副作用而嚴(yán)重受限，并且鑒別對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性毒性或者選擇性地使腫瘤對(duì)治療敏感的新穎藥劑是癌癥研究中的重要目標(biāo)。大量工作集中于將單株抗體的特異性結(jié)合活性應(yīng)用于腫瘤特異性療法的開(kāi)發(fā)。選擇性抗體(例如曲妥珠單抗(trastuzumab)(赫賽(Herceptin?))、利妥昔單抗(rituximab) (.'ΜΡΦΦ (Rituxan?))和西妥昔單抗(cetuximab)(愛(ài)必妥繁(Erbitax?)))已獲準(zhǔn)用于人類(lèi)癌癥療法中，但其均缺乏滲透到癌細(xì)胞中的能力并且因此僅限于攻擊位于腫瘤細(xì)胞外表面的標(biāo)靶。
[0007]大量腫瘤特 異性標(biāo)靶位于細(xì)胞和細(xì)胞核內(nèi)，并且多種癌癥尤其易受抑制DNA修復(fù)的療法的攻擊。
[0008]因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供抑制DNA修復(fù)的細(xì)胞滲透型抗體，例如抗DNA抗體。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供提高癌細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法的敏感性的組合物。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供細(xì)胞滲透型抗體和其衍生物，其對(duì)先前已存在DNA修復(fù)不足的癌癥或其他不合需要的細(xì)胞具有選擇性毒性，這些細(xì)胞通常與家族性綜合癥有關(guān)，這些綜合癥是由DNA修復(fù)基因突變引起，但是也偶爾在DNA修復(fù)基因沉默或突變時(shí)發(fā)生。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供細(xì)胞滲透型抗體和其衍生物，其通過(guò)擾亂主體DNA修復(fù)而預(yù)防或者抑制病毒感染、整合和/或復(fù)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]已經(jīng)開(kāi)發(fā)出使用抗DNA抗體滲透細(xì)胞核并抑制DNA修復(fù)的方法。在優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞是贅生物，通常是癌細(xì)胞，例如癌瘤。治療癌性或某些受感染細(xì)胞的方法涉及使所述細(xì)胞與細(xì)胞滲透型抗DNA抗體(單獨(dú)或與其他藥劑(例如化學(xué)治療劑或放射)組合)接觸。在一些實(shí)施例中，所述方法涉及分析受試者或腫瘤中損害DNA修復(fù)的一種或多種基因突變或正?；虮磉_(dá)的變化，接著如果鑒別出一種或多種突變或發(fā)生改變的表達(dá)或功能的模式那么選擇抗DNA抗體用于治療細(xì)胞。
[0013]DNA修復(fù)受損的細(xì)胞是此方法的尤其優(yōu)良的標(biāo)靶。在優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞在與DNA修復(fù)、DNA損傷檢查點(diǎn)、DNA合成、同源重組或非同源末端接合有關(guān)的基因的表達(dá)方面存在缺陷或所述基因發(fā)生突變。例示性基因包括XRCCUADPRT (PARP-1)、ADPRTL2 (PARP-2)、聚合酶 β、CTPS、MLHl、MSH2、FANCD2、PMS2、p53、p21、PTEN、RPA, RPAl、RPA2、RPA3、XPD、ERCCl、XPF, MMS19、RAD51、RAD51b.、RAD51C、RAD51D、DMCl、XRCCR、XRCC3、BRCAl、BRCA2、PALB2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NB51、WRN、BLM、KU70、KU80、ATM、ATR CHKl、CHK2、FANCA、FANCB、FANCC,FANCDI,FANCD2,FANCE,FANCF,FANCG,FANCC,FANCDI,FANCD2,FANCE,FANCF,FANCG,RADl和RAD9。在一些實(shí)施例中，存在缺陷的基因是腫瘤抑制基因。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞可能在BRCAl或BRCA2中具有一種或多種突變。
[0014]許多癌癥療法程序(例如化學(xué)療法和放射療法)通過(guò)壓制細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的能力，引起細(xì)胞死亡來(lái)起作用。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法具有抗性。還提供了通過(guò)向受試者投予含有細(xì)胞滲透型抗DNA抗體的組合物來(lái)增強(qiáng)放射療法和/或化學(xué)療法在受試者中的功效的方法。在一些實(shí)施例中，抗體提高細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法的敏感性?？梢酝ㄟ^(guò)此方法增強(qiáng)的化學(xué)療法包括損傷DNA或者抑制DNA修復(fù)的化學(xué)療法?？梢栽谕队璺派浏煼ê?或化學(xué)療法之前、同時(shí)或者之后向受試者投予抗DNA抗體。在優(yōu)選實(shí)施例中，在投予放射療法和/或化學(xué)療法之前或之后至少兩天，更優(yōu)選地在投予放射療法和/或化學(xué)療法之前或之后至少一天，甚至更優(yōu)選地與放射療法和/或化學(xué)療法同時(shí)向受試者投予抗DNA抗體。 [0015]披露了抑制DNA修復(fù)的細(xì)胞滲透型抗DNA抗體。這些抗體在不借助于載劑或結(jié)合物的情況下被轉(zhuǎn)運(yùn)到 細(xì)胞的細(xì)胞核中。在一些實(shí)施例中，抗DNA抗體可以與單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA (dsDNA)或其組合結(jié)合。70%全身性紅斑狼瘡(SLE)患者中存在對(duì)雙鏈DNA具有特異性的抗體，相比之下，無(wú)全身性紅斑狼瘡的人群中僅0.5%的人具有這種抗體。因此，在一些實(shí)施例中，從患有SLE的受試者或者患有類(lèi)似的自體免疫病狀的動(dòng)物(例如小鼠或兔)分離或者獲得細(xì)胞滲透型抗DNA抗體，接著人類(lèi)化或重組性表達(dá)并且以二聚物或單鏈抗體形式投予。
[0016]有效的細(xì)胞滲透型抗DNA抗體的實(shí)例是單株抗DNA抗體3E10或其與3E10結(jié)合相同抗原決定基的變異體或片段。在優(yōu)選實(shí)施例中，抗DNA抗體是抗DNA抗體的單鏈可變片段或其保守性變異體。舉例來(lái)說(shuō)，抗DNA抗體可以是3E10的單鏈可變片段(3E10scFV)或其保守性變異體。3E10scFv優(yōu)選地以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(例如酵母，例如畢赤酵母(Pichia pastoris))表達(dá)的重組型蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生。
[0017]在優(yōu)選實(shí)施例中，抗體與由ATCC寄存編號(hào)PTA2439融合瘤產(chǎn)生的單株抗體3E10具有相同的抗原決定基特異性。此可以通過(guò)產(chǎn)生含有單株抗體3E10的抗體結(jié)合部位的重組型抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?，此可以通過(guò)由從患有自體免疫疾病(例如SLE)的人類(lèi)受試者或小鼠或其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生融合瘤來(lái)實(shí)現(xiàn)。合適抗體包括全長(zhǎng)抗體、單鏈抗體和抗體片段?？贵w還可以是雙特異性單株抗體，其特異性結(jié)合細(xì)胞的細(xì)胞核中的第二治療標(biāo)靶。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合細(xì)胞的細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)，例如DNA修復(fù)蛋白、DNA復(fù)制蛋白、DNA損傷反應(yīng)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白或應(yīng)力反應(yīng)蛋白。這些類(lèi)別中的例示性標(biāo)靶分別包括RAD52蛋白、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白(ATM)、CHK2或CHKl蛋白、BCL2蛋白、熱休克蛋白70 (HSP70)、Myc蛋白和Ras蛋白。
[0018]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞滲透型抗DNA抗體是以單位劑量形式以有效抑制癌癥中的DNA修復(fù)的量提供，其可以包括處于同一個(gè)小瓶中或分別處于試劑盒中的藥學(xué)上可接受之賦形劑，其中抗體以有效抑制癌細(xì)胞中的DNA修復(fù)的量存在。在優(yōu)選實(shí)施例中，抗體是以約 200mg/m2 到約 1000mg/m2，包括約 200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或1000mg/m2的量存在。在一些實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物是呈用于靜脈內(nèi)注射的單位劑型形式。在一些實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物是呈用于瘤內(nèi)注射的單位劑型形式。
[0019]醫(yī)藥組合物(例如劑量單元)可以更含有其它治療劑或者與其他治療劑一起提供在試劑盒中。舉例來(lái)說(shuō)，其它治療劑可以是抗腫瘤劑、放射增敏劑或其組合?？鼓[瘤劑優(yōu)選地?fù)p傷DNA或抑制DNA修復(fù)。在一些實(shí)施例中，抗腫瘤劑是順鉬(cisplatin)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、阿霉素(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、絲裂霉素C(mitomycin C)、氮芥(nitrogen mustard)、核糖核苷酸還原酶抑制劑(例如羥基脲)、替拉扎明(tirapazamine)、替莫唑胺(temozolomide)或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如喜樹(shù)堿(camptothecin))。
[0020]可以存在于醫(yī)藥組合物中的放射增敏劑的非限制性實(shí)例包括順鉬、阿霉素、吉西他濱(gemcitabine)、5_氟尿嘧唳(5-fluorouracil)、PARPl抑制劑、組織蛋白脫乙酰基酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)受體抑制劑、CHKl抑制劑、mTOR抑制劑、激酶抑制劑、己酮可可堿(pentoxifylline)和長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)。
[0021]醫(yī)藥組合物(例如劑量單元)可更含有一種或多種用于治療癌癥的治療性單株抗體。在優(yōu)選實(shí)施例中，治療性單株抗體是貝伐珠單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗 (rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)或其組合。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1A是3E10單鏈抗體可變片段(3E10scFv)的示意圖,此片段由通過(guò)連接結(jié)構(gòu)域(LD)接合的3E10輕鏈和重鏈的可變區(qū)組成。添加Myc和His6標(biāo)簽以便進(jìn)行檢測(cè)和純化。3E10scFv滲入癌細(xì)胞的細(xì)胞核中(在Skov-3卵巢癌細(xì)胞用5 μ M3E10scFv處理30分鐘接著固定并用抗Myc抗體染色的情況下證明)。圖1B是柱狀圖，其顯示當(dāng)存在對(duì)照緩沖液(柱I和柱3)或10 μ M3E10Fv (柱2和柱4)時(shí)用OGy (柱1_2)或4Gy (柱3_4)照射的U251人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆源性存活(與對(duì)照物相比的存活分?jǐn)?shù))。誤差條表示重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖1C-1D是顯示當(dāng)存在(虛線)或不存在(實(shí)線)10yM3E10scFv時(shí)U87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡(％，通過(guò)碘化丙錠螢光測(cè)量)隨阿霉素(Dox) (0-250nM)(圖1E)或太平洋紫杉醇(paclitaxel) (0_2.5nM)(圖1F)的變化的圖形。
[0023]圖2A說(shuō)明3E10-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)中使用的DNA受質(zhì)的不同構(gòu)造。圖2B是顯示在與遞增濃度的3E10 (0-1 μ M)—起培育后當(dāng)存在(實(shí)線)或不存在(虛線)由3Ε10結(jié)合的自由單鏈尾端(tail)時(shí)經(jīng)放射性標(biāo)記的 寡核苷酸的百分比(％)(通過(guò)凝膠遷移率變動(dòng)分析確定)。這些結(jié)合曲線得出當(dāng)存在和不存在自由單鏈尾端時(shí)3E10與受質(zhì)結(jié)合的Kd分別是0.2 μ M和
0.4 μ M0圖2C-2H呈現(xiàn)各DNA構(gòu)造的個(gè)別3E10-DNA結(jié)合曲線。圖21是柱狀圖，其顯示當(dāng)存在對(duì)照緩沖液(空心柱)或20 μ Μ3Ε10 (實(shí)心柱)時(shí)與所需的修復(fù)酶一起培育的合成性經(jīng)放射性標(biāo)記的雙螺旋DNA受質(zhì)中的單鏈斷裂/堿基切除修復(fù)(BER) (η+1產(chǎn)物％表示不完全修復(fù)中間物的比例，其中已將核苷酸添加到有間隙的雙螺旋分子中，但未修復(fù)剩余單鏈斷裂以便產(chǎn)生全長(zhǎng)產(chǎn)物)。在所示時(shí)間點(diǎn)時(shí)停止修復(fù)反應(yīng)，并且通過(guò)凝膠電泳和自動(dòng)放射線照相對(duì)η、η+1和雙螺旋反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量。
[0024]圖3Α是試管內(nèi)DNA鏈交換分析法的示意圖。圖3Β和3C是柱狀圖，其顯示遞增劑量的3Ε10 (0-35 4 10對(duì)使用野生型11狀051蛋白(圖38)或變異體11狀0511(1331?(圖3C)的RAD51介導(dǎo)的鏈交換的影響。hRAD51K133R變異體與野生型蛋白質(zhì)相比對(duì)于鏈交換的活性甚至更高，因?yàn)槠湮词笰TP水解。3E10抑制野生型RAD51和hRAD51K133R變異體的鏈交換。
[0025]免疫熒光圖象說(shuō)明當(dāng)存在對(duì)照緩沖液或10 μ M3E10scFv時(shí)用2Gy照射后24小時(shí)，每個(gè)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的DNA雙鏈斷裂(YH2AX聚集點(diǎn))。圖3D是柱狀圖，其顯示當(dāng)存在對(duì)照緩沖液(空心柱)或10 μ M3E10scFv (實(shí)心柱)時(shí)用2Gy照射后24小時(shí)，每個(gè)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂(YH2AX聚集點(diǎn))的平均數(shù)目。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0026]圖4A-4B是柱狀圖，其通過(guò)處理后1_2周測(cè)量的集落形成顯示用對(duì)照緩沖液(空心柱)或10 μ M3E10scFv (實(shí)心柱)處理的BRCA2健全型(圖4A)或BRCA2不足型(圖4B)人卵巢癌細(xì)胞的克隆源性存活(與對(duì)照物相比的存活分?jǐn)?shù))。圖4C是顯示用3Ε10%Ρν(0-2μΜ)處理的BRCA2不足型(PEOl)和BRCA2健全型(ΡΕ04)人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡％的圖形。在處理后三天通過(guò)CellTftefGk--熒光(其報(bào)導(dǎo)ATP含量作為代謝活性細(xì)胞的測(cè)量值)評(píng)估3E10scFv對(duì)細(xì)胞存活的影響。誤差條表示六次測(cè)量的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4D是顯示用對(duì)照緩沖液或3E10scFV處理的BRCA2不足型CAPANl/neo細(xì)胞(人胰腺癌細(xì)胞)的克隆源性存活(通過(guò)集落形成測(cè)量的與對(duì)照物相比的存活 分?jǐn)?shù))。圖4E是顯示用O μ M、2.5 μ Μ、5 μ M或10 μ M完全3Ε10抗體處理的BRCA2不足型(虛線)或BRCA2健全型(實(shí)線)人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡(％)的圖形。圖4F和4G是柱狀圖，其顯示用對(duì)照緩沖液(柱1)、10μΜ3Ε10 (柱2)、3ηΜ阿霉素(Dox)(柱3)或10 μ Μ3Ε10+3ηΜ阿霉素(柱4)處理的BRCA2不足型(圖4G)或BRCA2健全型(圖4F)人卵巢癌的細(xì)胞死亡(％)。
[0027]圖5是柱狀圖，其顯示通過(guò)腹膜內(nèi)注射對(duì)照緩沖液(柱I)、單獨(dú)3Ε10抗體(0.Smg于0.5mL PBS中，10 μ Μ)(柱2)、單獨(dú)阿霉素(Dox) (80μ g/kg)(柱3)或3E10和阿霉素(柱4)進(jìn)行皮下注射處理的SCID小鼠中產(chǎn)生的U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤體積(增加％)。各處理組包含4只小鼠。注射后三天，通過(guò)測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)來(lái)評(píng)估處理的影響。
[0028]圖6A是顯示人神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植小鼠中腫瘤體積(mm3)隨時(shí)間(天)變化的圖形，這些小鼠是在U87細(xì)胞植入后二十六天(腫瘤已經(jīng)生長(zhǎng)到約IOOmm3的平均尺寸)通過(guò)腹膜內(nèi)注射對(duì)照性PBS緩沖液(實(shí)心菱形和三角形)或3E10 (Img于PBS中)(空心菱形和三角形)來(lái)處理，24小時(shí)后重復(fù)再次進(jìn)行上述注射，接著在第二次注射后用OGy (菱形)或SGy(三角形)照射2小時(shí)。
[0029]圖6B呈現(xiàn)各組中無(wú)疾病進(jìn)展存活率的卡普蘭-麥爾(Kaplan-Meier)曲線。無(wú)疾病進(jìn)展存活率定義為腫瘤尺寸與基線尺寸相比未增加達(dá)到超過(guò)三倍的存活率?；€尺寸定義為在抗體處理前一天的腫瘤尺寸，其表示為圖6A中的第25天和圖6B中的第O天。用8Gy處理的腫瘤中腫瘤增至三倍的時(shí)間(腫瘤體積增加達(dá)到基線的三倍所需的時(shí)間)是9.5±0.5天，相比之下，用8Gy+3E10處理的腫瘤的腫瘤增至三倍的時(shí)間是13.7±1.8天(p=0.04)。但是，與單獨(dú)對(duì)照緩沖液相比，單獨(dú)3E10對(duì)U87腫瘤無(wú)影響，對(duì)照性腫瘤的腫瘤增至三倍的時(shí)間是6.8±0.7天，而相比之下，用單獨(dú)3E10處理的腫瘤的腫瘤增至三倍的時(shí)間是 6.5±0.3 天(p=0.67)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]1.定義
[0031]術(shù)語(yǔ)“抗體”是指選擇性結(jié)合靶抗原的天然或合成抗體。所述術(shù)語(yǔ)包括多株和單株抗體。除完整免疫球蛋白分子之外，術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括這些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，和選擇性結(jié)合靶抗原的免疫球蛋白分子的人或人類(lèi)化型式。
[0032]術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞滲透型抗DNA抗體”是指被轉(zhuǎn)運(yùn)到活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核中并且特異性結(jié)合DNA (例如單鏈和/或雙鏈DNA)的抗體。在優(yōu)選實(shí)施例中，抗體是在不借助于載劑或結(jié)合物的情況下被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的細(xì)胞核中。在其它實(shí)施例中，抗體與細(xì)胞滲透型部分(例如細(xì)胞滲透型肽)結(jié)合。
[0033]術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指抗體與其同源抗原(例如DNA)結(jié)合而不與其它抗原顯著結(jié)合。優(yōu)選地，抗體以大于約 105mol 1 (例如 106mol \ 107mol 'IO8Iiiol \ 109mol \ 1010mol \IO11mOr1和1l2Hior1或更大)的與該第二分子的親和力常數(shù)(Ka)與所述抗原“特異性結(jié)
么”
口 ο
[0034]術(shù)語(yǔ)“單株抗體”或“MAb”是指從實(shí)質(zhì)上同類(lèi)的抗體群獲得的抗體，即除了一小群抗體分子中可能存在的天然突變外，所述群內(nèi)的個(gè)別抗體是相同的。
[0035]術(shù)語(yǔ)“DNA修復(fù)”是指細(xì)胞用來(lái)鑒別和矯正對(duì)DNA分子的損傷的一系列過(guò)程。通過(guò)堿基切除修復(fù)(BER)、核苷酸切除修復(fù)(NER)或錯(cuò)配修復(fù)(MMR)來(lái)修復(fù)單鏈缺陷。通過(guò)非同源末端接合(NHEJ)、微同源介導(dǎo)的末端接合(MMEJ)或同源重組來(lái)修復(fù)雙鏈斷裂。在DNA損傷后，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)被活化，其暫停細(xì)胞周期以便為細(xì)胞提供時(shí)間修復(fù)損傷，隨后繼續(xù)分裂。檢查點(diǎn)介體蛋白包括 BRCAl、MDCl、53BP1、p53、ATM、ATR、CHKl、CHK2 和 p21。
[0036]術(shù)語(yǔ)“受損DNA修復(fù)”是指其中突變細(xì)胞或基因表達(dá)發(fā)生改變的細(xì)胞不能進(jìn)行DNA修復(fù)或其中一種或多種DNA修復(fù)路徑的活性降低或與野生型細(xì)胞相比修復(fù)其DNA損傷所需的時(shí)間更長(zhǎng)的狀態(tài)。
[0037]術(shù)語(yǔ)“化學(xué)敏感性”是指癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥作用的相對(duì)敏感性。癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性越高，殺死這種癌細(xì)胞所 需的抗癌藥越少。
[0038]術(shù)語(yǔ)“放射敏感性”是指細(xì)胞對(duì)電離放射的不良作用的相對(duì)敏感性。細(xì)胞的放射敏感性越高，殺死這種細(xì)胞所需的放射越少。通常，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞放射敏感性與細(xì)胞分裂速率成正比并且與細(xì)胞的DNA修復(fù)能力成反比。
[0039]術(shù)語(yǔ)“抗放射性”是指當(dāng)暴露于臨床合適劑量的放射時(shí)不會(huì)死亡的細(xì)胞。
[0040]術(shù)語(yǔ)“贅生性細(xì)胞”是指發(fā)生異常細(xì)胞增殖(“瘤形成”)的細(xì)胞。贅生性細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)度并且與其周?chē)恼＝M織不協(xié)調(diào)。這種生長(zhǎng)通常即使在刺激停止后仍然持續(xù)按相同過(guò)度方式進(jìn)行，并且通常引起腫瘤形成。
[0041]術(shù)語(yǔ)“腫瘤”或“贅生物”是指含有贅生性細(xì)胞的異常組織塊。贅生物和腫瘤可以是良性的、惡化前的或惡性的。
[0042]術(shù)語(yǔ)“癌癥”或“惡性贅生物”是指顯示生長(zhǎng)不受控、對(duì)相鄰組織的侵襲并且通常轉(zhuǎn)移到身體其他位置的細(xì)胞。
[0043]術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤藥”是指可以抑制或預(yù)防癌癥發(fā)展、侵襲和/或轉(zhuǎn)移的組合物，例如藥物或生物制品。
[0044]術(shù)語(yǔ)“抗癌部分”是指可以與所披露的抗DNA抗體組合以便增強(qiáng)所述抗體的抗癌性質(zhì)的任何藥劑，例如肽、蛋白質(zhì)、核酸或小分子。所述術(shù)語(yǔ)包括抗腫瘤藥、結(jié)合并抑制癌細(xì)胞中其他治療標(biāo)靶的抗體以及對(duì)癌細(xì)胞具有親和力以便定向靶向癌細(xì)胞的物質(zhì)。
[0045]術(shù)語(yǔ)“病毒轉(zhuǎn)型細(xì)胞”是指已經(jīng)受病毒感染或者其基因組中已經(jīng)并入病毒DNA或RNA的細(xì)胞。病毒可以是急性轉(zhuǎn)型或慢性轉(zhuǎn)型致癌病毒。在急性轉(zhuǎn)型病毒中，病毒粒子載運(yùn)編碼活性過(guò)度的致癌基因的基因(稱(chēng)為病毒-致癌基因(v-onc))，并且一旦v-onc被表達(dá)，則受感染細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)型。相比之下，在慢性轉(zhuǎn)型病毒中，將病毒基因組插入宿主基因組中原致癌基因附近。例示性致癌病毒包括人乳頭狀瘤病毒(HPV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、人親T淋巴細(xì)胞性病毒(HTLV)、與卡堡氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)有關(guān)的皰疹病毒(HHV-8)、梅克爾細(xì)胞(Merkel cell)多瘤病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus ；EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和人巨細(xì)胞病毒(CMV)。
[0046]病毒感染細(xì)胞是指已經(jīng)暴露于病毒或受病毒感染或攜帶病毒遺傳物質(zhì)(RNA或DNA)的細(xì)胞。病毒可以是致癌病毒或裂解病毒或潛伏性病毒并且會(huì)引起癌癥、免疫缺陷、肝炎、腦炎、肺炎、呼吸道疾病或其它疾病病狀。早先已證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(特別是HIV)在某種程度上依賴(lài)于堿基切除修復(fù)(BER)路徑來(lái)整合到宿主DNA中。3E10抑制DNA修復(fù)的能力提供了一種機(jī)制，使3E10和其它抗DNA抗體可以改善病毒引起的疾病，特別是通過(guò)干擾DNA修復(fù)并且由此通過(guò)阻斷DNA或RNA代謝(其是病毒生命周期的一部分以及細(xì)胞病毒感染的一部分)。實(shí)例證明3E10抑制BER路徑，支持抑制所述反轉(zhuǎn)錄病毒的感染性的功效。
[0047]術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“宿主”、“受試者”和“患者”可以互換地使用，是指作為投藥或治療對(duì)象的任何個(gè)體。受試者可以是脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物。因此，受試者可以是人或獸醫(yī)學(xué)患者。
[0048]術(shù)語(yǔ)“治療有效性”意指所使用的組合物量是足以改善疾病或病癥的一種或多種病因或癥狀的量。所述改善僅需減輕或改變，而不一定是消除。用于治療癌癥的組合物的治療有效量?jī)?yōu)選地是足以引起腫瘤消退或使腫瘤對(duì)放射或化學(xué)療法敏感的量。
[0049]術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受”是指不會(huì)在生物學(xué)或其它方面不合需要的物質(zhì)，即所述物質(zhì)可以被投予個(gè)體而不會(huì)引起任何不合需要的生物學(xué)作用或通過(guò)有害的方式與含有它的醫(yī)藥組合物中的任一種其它組分相互作用。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知，將容易地選擇載劑以便使活性成分的任何降解最少以及使個(gè)體中的任何不良副作用最少。
[0050]術(shù)語(yǔ)“治療”是指意圖治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理學(xué)病狀或病癥的對(duì)患者的醫(yī)學(xué)管理。此術(shù)語(yǔ)包括積極治療，即治療特別針對(duì)疾病、病理學(xué)病狀或病癥的改善，并且還包括病因治療，即治療針對(duì)去除相關(guān)疾病、病理學(xué)病狀或病癥的病因。此外，此術(shù)語(yǔ)包括姑息治療，即治療被設(shè)計(jì)成 用于緩解癥狀而非治愈疾病、病理學(xué)病狀或病癥；預(yù)防性治療，即治療針對(duì)最小化或部分抑制或完全抑制相關(guān)疾病、病理學(xué)病狀或病癥的發(fā)展；和支持治療，即治療用于補(bǔ)充另一種針對(duì)改善相關(guān)疾病、病理學(xué)病狀或病癥的特定治療。[0051]術(shù)語(yǔ)“抑制”意指降低活性、反應(yīng)、病狀、疾病或其它生物參數(shù)。此術(shù)語(yǔ)可以包括(但不限于)完全消除活性、反應(yīng)、病狀或疾病。此術(shù)語(yǔ)還可以包括(例如)使活性、反應(yīng)、病狀或疾病與原始或?qū)φ粘潭认啾冉档?0%。因此，與原始或?qū)φ粘潭认啾?，降低程度可達(dá)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或其間的任何降低量。
[0052]“融合蛋白”是指通過(guò)接合兩個(gè)或多于兩個(gè)多肽而形成的多肽，所述接合是通過(guò)一個(gè)多肽的氨基末端與另一個(gè)多肽的羧基末端之間形成的肽鍵進(jìn)行。融合蛋白可以通過(guò)成分多肽的化學(xué)偶合而形成或者其可以表達(dá)為來(lái)自編碼單一相連融合蛋白的核酸序列的單一多肽。單鏈融合蛋白是具有單一相連多肽主結(jié)構(gòu)的融合蛋白。融合蛋白可以使用分子生物學(xué)中的常規(guī)技術(shù)通過(guò)將兩個(gè)基因同框接合到單一核酸序列中接著在產(chǎn)生融合蛋白的條件下在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸來(lái)制備。
[0053]I1.組合物
[0054]A.抗 DNA 抗體
[0055]披露用于增強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法和/或放射的敏感性的細(xì)胞滲透型抗DNA抗體。經(jīng)常在全身性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清中發(fā)現(xiàn)針對(duì)單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)的自身抗體并且它們通常與疾病發(fā)病機(jī)理有關(guān)。因此，在一些實(shí)施例中，可以從SLE患者獲得或分離抗DNA抗體。在優(yōu)選實(shí)施例中，抗DNA抗體是單株抗體或者其片段或變異體。存在DNA反應(yīng)性循環(huán)自身抗體(抗DNA抗體)是全身性紅斑狼瘡(SLE)患者中的標(biāo)志性實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)。盡管抗DNA抗體在SLE中的確切作用尚不清楚，但已經(jīng)表明所述抗體在SLE病理生理學(xué)中起積極作用。在二十世紀(jì)九十年代早期，在針對(duì)SLE的實(shí)驗(yàn)疫苗療法中測(cè)試鼠類(lèi)狼瘡抗DNA抗體3E10。這些工作的目的在于開(kāi)發(fā)抗個(gè)體基因型抗體，其將特異性結(jié)合SLE患者中的抗DNA抗體。但是，意外發(fā)現(xiàn)3E10可以滲透到活細(xì)胞和細(xì)胞核中而不引起任何可觀測(cè)到的細(xì)胞毒性(韋斯巴特RH (Weisbart RH)等人，免疫學(xué)雜志(J Immunol.) 1990144 (7):2653-2658 ;扎克 DJ (Zack DJ)等人，免疫學(xué)雜志 1996157 (5):2082-2088)。對(duì) SLE 疫苗療法中3E10的研究接著 被集中于開(kāi)發(fā)用于將治療分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞和細(xì)胞核中的分子遞送工具的3E10的努力所替代。也報(bào)告了其它抗體能夠滲透細(xì)胞。
[0056]3E10抗體和其單鏈可變片段(3E10scFv)滲透到細(xì)胞和細(xì)胞核中并且已證實(shí)其能夠通過(guò)化學(xué)結(jié)合或重組型融合來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)連接到所述抗體的治療性蛋白貨物。通過(guò)3E10或3E10scFv遞送到細(xì)胞的蛋白貨物包括過(guò)氧化氫酶、p53和Hsp70 (韋斯巴特RH等人，免疫學(xué)雜志 2000164 =6020-6026 ;漢森 JE (Hansen JE)等人，癌癥研究(Cancer Res.) 2007 年2 月 15 日；67 (4):1769-74 ;漢森 JE 等人，腦部研究(Brain Res.)2006 年 5 月 9 日；1088(I): 187-96)。3E10scFv在活體內(nèi)有效地介導(dǎo)將Hsp70遞送到神經(jīng)元并且由此降低大鼠中風(fēng)模型中的大腦梗塞體積和改良神經(jīng)功能(詹X (Zhan X)等人，中風(fēng)學(xué)(Stroke)，201041(3):538-43)。
[0057]現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3E10和3E10scFv在不與任何治療性蛋白質(zhì)結(jié)合的情況下可以增強(qiáng)癌細(xì)胞放射敏感性和化學(xué)敏感性并且此作用在DNA修復(fù)不足的細(xì)胞中得到增強(qiáng)。此外，3E10和3E10scFv即使在不進(jìn)行放射或化學(xué)療法的情況下仍對(duì)DNA修復(fù)不足的癌細(xì)胞有選擇性致死性。美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)建立開(kāi)發(fā)單株抗體用于人類(lèi)療法的途徑，并且FDA已經(jīng)批準(zhǔn)將3E10用于I期人類(lèi)臨床試驗(yàn)，此試驗(yàn)被設(shè)計(jì)成測(cè)試3E10在針對(duì)SLE的實(shí)驗(yàn)疫苗療法中的功效(斯佩爾蒂尼F (Spertini F)等人,風(fēng)濕病學(xué)雜志(J Rheumatol) 1999, 26(12):2602-8)。因此，這些類(lèi)型的抗體可以用于DNA修復(fù)不足的癌癥的靶向療法以及針對(duì)癌癥的新靶向療法以便增強(qiáng)DNA修復(fù)健全型癌癥以及DNA修復(fù)不足型癌癥中的其他癌癥治療形式。
[0058]已知其它細(xì)胞滲透型抗體(均天然存在于SLE患者中)并且通過(guò)篩選抗體文庫(kù)或已知細(xì)胞滲透型抗體的衍生化作用來(lái)獲得。在一些實(shí)施例中，抗DNA抗體與細(xì)胞滲透型部分(例如細(xì)胞滲透型肽)結(jié)合以便有助于進(jìn)入細(xì)胞中和轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。細(xì)胞滲透型肽的實(shí)例包括(但不限于)聚精氨酸(例如R9)、觸角足(Antennapedia)序列、TAT、HIV-Tat,穿膜肽(Penetratin)、Antp-3A (Antp突變體)、蟾蜍肽II (Buforin II)、細(xì)胞穿透肽(Transportan)、MAP (模型兩性肽)、K-FGF、Ku70、朊病毒、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC (雙胍鹽-亞精胺-膽固醇^PBGTC (雙胍鹽-三氨乙基胺-膽固醇)。在其它實(shí)施例中，使用TransMabs?技術(shù)(不列顛哥倫比亞省溫哥華市的英鈉克斯生物技術(shù)公司(InNexusBiotech., Inc., Vancouver, BC))修飾抗體。
[0059]在優(yōu)選實(shí)施例中，抗DNA抗體是在不借助于載劑或結(jié)合物的情況下被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的細(xì)胞核中。舉例來(lái)說(shuō)，在活體內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核中而無(wú)細(xì)胞毒素作用的單株抗體3E10和其活性片段披露于頒予理查德.韋斯巴特(Richard Weisbart)的美國(guó)專(zhuān)利第4，812，397號(hào)和第7，189，396號(hào)中，其描述3E10抗體以及產(chǎn)生和修飾3E10抗體的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以根據(jù)已知技術(shù)通過(guò)使來(lái)自抗DNA抗體的血清含量升高的宿主(例如MRL/lpr小鼠)的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合或者通過(guò)用合適的轉(zhuǎn)型載體使脾細(xì)胞轉(zhuǎn)型以便使細(xì)胞永生化來(lái)制備抗體。可以在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞并且進(jìn)行篩選以便選擇結(jié)合DNA的抗體。
[0060]可以使用的抗體包括任何類(lèi)別的完全免疫球蛋白(即完整抗體)、其片段和至少含有抗體的抗原結(jié)合可變域的合成蛋白質(zhì)?？勺冇蛟诳贵w間序列不同并且用于各特定抗體針對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。但是，可變性通常并不在抗體的可變域內(nèi)均勻分布。其通常集中于稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR`)或高變區(qū)(均位于輕鏈和重鏈可變域中)的三個(gè)區(qū)段中。可變域中保守性更高的部分被稱(chēng)為構(gòu)架(FR)。原生重鏈和輕鏈的可變域各包含四個(gè)FR區(qū)域，其主要呈β片狀構(gòu)造，由三個(gè)⑶R連接，其形成環(huán)連接并且在一些情況下形成β片狀結(jié)構(gòu)的一部分。各鏈中的⑶R通過(guò)FR區(qū)域保持緊密靠近在一起并且與來(lái)自另一條鏈的⑶R —起貢獻(xiàn)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成。因此，抗體至少含有滲透細(xì)胞、保持DNA結(jié)合和/或干擾DNA修復(fù)的⑶R組分。3Ε10的可變區(qū)含有所有三種性質(zhì)。
[0061]還披露具有生物活性的抗體片段。片段(無(wú)論是否連接到其它序列)包括插入、缺失、取代或特定區(qū)域或特異性氨基酸殘基的其他所選修飾，只要與未經(jīng)過(guò)修飾的抗體或抗體片段相比不顯著改變或損害片段的活性即可。
[0062]還可以修改技術(shù)以便用于產(chǎn)生對(duì)抗原性蛋白質(zhì)具有特異性的單鏈抗體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知用于產(chǎn)生單鏈抗體的方法?？梢酝ㄟ^(guò)使用短肽連接子使重鏈和輕鏈的可變域融合在一起，由此在單一分子上重新構(gòu)成抗原結(jié)合位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生單鏈抗體。已經(jīng)在不顯著破壞抗原結(jié)合或結(jié)合特異性的情況下產(chǎn)生單鏈抗體可變片段(scFv)，其中一個(gè)可變域的C端通過(guò)具有15個(gè)到25個(gè)氨基酸的肽或連接子系到另一個(gè)可變域的N端。選擇連接子以允許重鏈和輕鏈按照其合適的構(gòu)造定向結(jié)合在一起。
[0063]可以修飾抗DNA抗體以便改良其治療潛力。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，細(xì)胞滲透型抗DNA抗體與另一種抗體結(jié)合，所述另一種抗體對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞核中的第二治療標(biāo)靶具有特異性。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞滲透型抗DNA抗體可以是融合蛋白，其含有3E10scFv和特異性結(jié)合第二治療標(biāo)靶的單株抗體的單鏈可變片段。在其它實(shí)施例中，細(xì)胞滲透型抗DNA抗體是雙特異性抗體，其具有來(lái)自3E10的第一重鏈和第一輕鏈以及來(lái)自特異性結(jié)合第二治療標(biāo)靶的單株抗體的第二重鏈和第二輕鏈。
[0064]可以通過(guò)連接兩個(gè)scFv來(lái)工程改造出二價(jià)單鏈可變片段(二-scFv)。此可以通過(guò)產(chǎn)生具有兩個(gè)VH和兩個(gè)VL區(qū)域的單肽鏈從而產(chǎn)生串聯(lián)scFv來(lái)進(jìn)行。ScFv也可以被設(shè)計(jì)成具有對(duì)于使兩個(gè)可變區(qū)折疊在一起來(lái)說(shuō)太短的連接肽(約五個(gè)氨基酸)，從而迫使scFv發(fā)生二聚。此類(lèi)型被稱(chēng)為雙功能抗體。已經(jīng)證實(shí)雙功能抗體的解離常數(shù)比相應(yīng)scFv低高達(dá)40倍，表明其對(duì)其標(biāo)靶的親和力高得多。更短的連接子(一個(gè)或兩個(gè)氨基酸)引起形成三聚物(三功能抗體)。四功能抗體亦己被產(chǎn)生。其與雙功能抗體相比對(duì)其標(biāo)祀呈現(xiàn)出甚至更高的親和力。
[0065]抗體的治療功能可以通過(guò)使抗體或其片段與治療劑偶合來(lái)增強(qiáng)。所述抗體或片段與治療劑的偶合可以通過(guò)形成免疫結(jié)合物或形成融合蛋白，或通過(guò)使抗體或片段連接到核酸(例如siRNA)或小分子(包含抗體或抗體片段和治療劑)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0066]重組型融合蛋白是通過(guò)融合基因的遺傳工程改造而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。此通常涉及從編碼第一個(gè)蛋白質(zhì)的cDNA序列去除終止密碼子，接著通過(guò)接合或重疊擴(kuò)展PCR同框連接第二個(gè)蛋白質(zhì)的cDNA序列。DNA序列接著將被細(xì)胞表達(dá)成單一蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以被工程改造成包括兩種原始蛋白質(zhì)的完全序列或任一蛋白質(zhì)的一部分序列。如果兩個(gè)實(shí)體是蛋白質(zhì)，那么通常還添加連接子(或“間隔基”)肽，其使蛋白質(zhì)更有可能獨(dú)立地折疊并且按預(yù)期起作用。
[0067]本領(lǐng)域中熟知將非人類(lèi)抗體人類(lèi)化的方法。通常，人類(lèi)化抗體中引入有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人類(lèi)來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人類(lèi)氨基酸殘基通常被稱(chēng)為“輸入”殘基，其通常是從“輸入”可變域獲得?？贵w人類(lèi)化技術(shù)通常涉及使用重組DNA技術(shù)操作編碼抗體分子中一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的DNA序列。
[0068]在一些實(shí)施例中，修飾細(xì)胞滲透型抗體以便改變其半衰期。在一些實(shí)施例中，需要延長(zhǎng)抗體的半衰期以使其在循環(huán)中或在治療位點(diǎn)處存在更長(zhǎng)的時(shí)間。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)單獨(dú)使用抗DNA抗體治療癌癥(例如DNA修復(fù)受損的癌細(xì)胞)時(shí)，可能需要長(zhǎng)時(shí)間保持循環(huán)或治療位置中抗體的效價(jià)。在其它實(shí)施例中，縮短抗DNA抗體的半衰期以便降低潛在副作用。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)抗體與放射療法或化學(xué)療法結(jié)合使用時(shí)，抗體優(yōu)選地在放射或抗腫瘤藥治療期間以高劑量存在于循環(huán)中，但在其它時(shí)間則快速地從循環(huán)中去除。預(yù)期抗體片段(例如3E10scFv)的半衰期比全尺寸抗體短。其它改變半衰期的方法已知并且可用于所述方法中。舉例來(lái)說(shuō)，抗體可以用延長(zhǎng)半衰期的Fe變異體工程改造，例如使用Xtend?抗體半衰期延長(zhǎng)技術(shù)(加利福尼亞州蒙羅維亞的先科公司(Xencor, Monrovia, CA))。
[0069]B.癌癥和病毒轉(zhuǎn)型細(xì)胞
[0070]抗體可用于治療發(fā)生生長(zhǎng)失調(diào)、侵襲或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。DNA修復(fù)受損的癌細(xì)胞是細(xì)胞滲透型抗DNA抗體的尤其優(yōu)良的對(duì)象。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞滲透型抗DNA抗體對(duì)DNA修復(fù)受損的細(xì)胞具有致死性。在優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞在與DNA修復(fù)、DNA合成或同源重組有關(guān)的基因表達(dá)方面存在缺陷。例示性基因包括XRCCl、ADPRT (PARP-1)、ADPRTL2 (PARP-2)、聚合酶 β、CTPS, MLH1、MSH2、FANCD2、PMS2、ρ53、ρ21、PTEN、RPA, RPAl、RPA2、RPA3、XPD、ERCCU XPF、MMS19、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMCU XRCCR、XRCC3、BRCAU BRCA2、PALB2、RAD52、RAD54、RAD50、MREl1、ΝΒ51、WRN、BLM、KU70、KU80、ATM、ATR CFIKl、CHK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RAD1和RAD9。在一些實(shí)施例中，存在缺陷的基因是腫瘤抑制基因。在優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞的BRCAl或BRCA2中具有一個(gè)或多個(gè)突變?；蛲蛔?例如BRCAl和BRCA2突變)可以使用標(biāo)準(zhǔn)PCR、雜交或定序技術(shù)鑒別。
[0071] 因此，在一些實(shí)施例中，抗DNA抗體可以用于治療由DNA修復(fù)不足型家族性綜合癥引起的癌癥，例如乳癌、卵巢癌和胰腺癌。在這些實(shí)施例中，抗DNA抗體可以在無(wú)放射療法或化學(xué)療法的情況下有效。舉例來(lái)說(shuō)，抗DNA抗體可以用于治療與BRCAl、BRCA2、PALB2或RAD51B、RAD51C、RAD51D或相關(guān)基因中的突變有關(guān)的癌癥?？笵NA抗體還可以用于治療跟與DNA錯(cuò)配修復(fù)有關(guān)的基因(例如MSH2、MLHU PMS2和相關(guān)基因)中的突變有關(guān)的結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜腫瘤或腦腫瘤?？笵NA抗體還可以用于治療伴有DNA修復(fù)基因(例如BRCAUMLH1或RAD51B、RAD51C或RAD51D)沉默的癌癥。在這些優(yōu)選實(shí)施例中，抗DNA抗體抑制DNA修復(fù)的能力與這些癌癥固有的修復(fù)不足相組合便足以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0072]因此，在一些實(shí)施例中，抗DNA抗體可以用于治療病毒轉(zhuǎn)型細(xì)胞，例如受致癌病毒感染的細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)型可以迫使細(xì)胞發(fā)生表達(dá)型變化，例如高飽和密度、不依賴(lài)于錨定的生長(zhǎng)(anchorage-1ndependent growth )、接觸抑制損失、定向生長(zhǎng)損失、永生化和細(xì)胞骨架分裂。細(xì)胞轉(zhuǎn)型需要細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在病毒基因組的至少一部分。此可以通過(guò)從多種病毒基因(例如致癌基因)持續(xù)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些基因可能干擾細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起觀測(cè)到的細(xì)胞的表型變化。在一些情況中，將病毒基因組插入宿主基因組中原致癌基因附近。最終結(jié)果是轉(zhuǎn)型細(xì)胞顯示細(xì)胞分裂增加，其對(duì)病毒是有利的。在一些實(shí)施例中，病毒轉(zhuǎn)型、病毒感染和/或代謝依賴(lài)于DNA修復(fù)機(jī)制。在這些實(shí)施例中，使用所披露的抗DNA抗體抑制DNA修復(fù)也抑制細(xì)胞中的病毒轉(zhuǎn)型、病毒感染和/或代謝。
[0073]在一些實(shí)施例中，病毒轉(zhuǎn)型、病毒感染和/或代謝依賴(lài)于作為病毒生命周期的一部分的病毒編碼RNA或DNA的代謝，產(chǎn)生容易被3E10或其它抗DNA抗體結(jié)合和/或抑制的中間物。在這些實(shí)施例中，用所披露的抗DNA抗體進(jìn)行的治療也抑制細(xì)胞中的病毒轉(zhuǎn)型、病毒感染和/或代謝。
[0074]早先已發(fā)現(xiàn)慢病毒(例如HIV)的感染和整合依賴(lài)于宿主BER活性(約德(Yoder)等人，公共科學(xué)圖書(shū)館?綜合(PLoS 0ne)，2011年3月，6 (3)el7862)。此外，共濟(jì)失調(diào)-微血管擴(kuò)張突變型(ATM) DNA損傷反應(yīng)似乎對(duì)HIV復(fù)制比較關(guān)鍵(劉(Lau)等人，自然細(xì)胞生物學(xué)(Nat Cell Biol),20057 (5):493_500)。在一些實(shí)施例中，反轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒、HIV)感染和整合依賴(lài)于宿主DNA修復(fù)機(jī)制。在這些實(shí)施例中，用所披露的抗DNA抗體進(jìn)行的治療也可以抑制病毒感染/整合和抑制病毒生命周期中的再感染。
[0075]在一些實(shí)施例中，慢病毒(HIV)復(fù)制依賴(lài)于DNA修復(fù)。在這些實(shí)施例中，用所披露的抗DNA抗體進(jìn)行的治療也可以抑制病毒復(fù)制和抑制病毒生命周期中的再感染。因此，抗DNA抗體可以用于治療受病毒(例如致癌病毒)感染的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，抗體抑制病毒轉(zhuǎn)型、復(fù)制、代謝或其組合。會(huì)受抗DNA抗體影響的例示性致癌病毒包括人乳頭狀瘤病毒(HPV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、人親T淋巴細(xì)胞性病毒(HTLV)、卡堡氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(HHV-8)、梅克爾細(xì)胞多瘤病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和人巨細(xì)胞病毒(CMV)?？笵NA抗體也可以用于治療潛伏性病毒。在一些實(shí)施例中，受感染細(xì)胞設(shè)置針對(duì)病毒(例如HSV-1)的DNA損傷反應(yīng)的失效有助于產(chǎn)生潛伏期。因此這些受病毒感染細(xì)胞的DNA修復(fù)受損并且對(duì)用抗DNA抗體進(jìn)行的治療敏感。例示性潛伏性病毒包括CMV、EBV、單純皰疹病毒(I型和2型)以及水痘帶狀皰疹病毒。
[0076]抗DNA抗體也可以用于治療由病毒引起的病毒感染，這些病毒會(huì)引起癌癥、免疫缺陷、肝炎、腦炎、肺炎、呼吸道疾病或其它疾病病狀，借助于抗體結(jié)合DNA和干擾DNA修復(fù)或RNA代謝(其是病毒生命周期的一部分)的能力。
[0077]生命周期或所引起的感染的癥狀可能受到抗體投藥影響的代表性病毒包括人乳頭狀瘤病毒(HPV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、人親T淋巴細(xì)胞性病毒(HTLV)、卡堡氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(HHV-8)、梅克爾細(xì)胞多瘤病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和人巨細(xì)胞病毒(CMV)。
[0078]其它可能受:到抗體投藥影響的病毒包括細(xì)小病毒、痘病毒、皰疫病毒和其它DNA
病毒:
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種抑制贅生細(xì)胞或暴露于病毒的細(xì)胞或受感染細(xì)胞中DNA修復(fù)的方法，其包含使所述細(xì)胞與包含細(xì)胞滲透型抗DNA抗體的醫(yī)藥組合物接觸,所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體增強(qiáng)DNA損傷或干擾DNA代謝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述贅生細(xì)胞是從由以下各項(xiàng)所構(gòu)成的族群中選出的癌細(xì)胞:肉瘤、淋巴瘤、白血病、癌瘤和腺癌、胚細(xì)胞瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、黑素瘤、橫紋肌樣瘤、胚胎性瘤、神經(jīng)外胚層腫瘤、類(lèi)癌瘤、顱咽管瘤、組織細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、原始神經(jīng)外胚層腫瘤、唾液腺腫瘤、胸腺瘤、胸腺癌瘤、甲狀腺癌和威耳姆士瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞具有抗放射性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法具有抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞具有固有性存在缺陷的或不足的DNA修復(fù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞暴露于具有或引起DNA修復(fù)缺陷或不足的病毒或受到所述病毒感染，或所述病毒依賴(lài)于宿主DNA修復(fù)途徑進(jìn)行感染、整合或復(fù)制。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞暴露于慢病毒或受慢病毒感染。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞具有從由以下各項(xiàng)所構(gòu)成的族群中選出的DNA修復(fù)基因的一種或多種突變或異常表達(dá):XRCC1、ADPRT(PARP-1 )、ADPRTL2(PARP-2)、聚合酶 β、CTPS, MLH1、MSH2、FANCD2、PMS2、p53、p21、PTEN、RPA, RPAl、RPA2、RPA3、XPD,ERCCl、XPF, MMS19、RAD51、RAD51b.、RAD51C、RAD51D、DMCl、XRCCR、XRCC3、BRCAl、BRCA2、PALB2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NB51、WRN、BLM、KU70、KU80、ATM、ATR CHK1、CHK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RADl 和 RAD9。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞具有存在缺陷的腫瘤抑制基因，例如BRCAl 或 BRCA2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是缺氧腫瘤的一部分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體是與放射增敏劑組合投予。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述放射增敏劑是從由以下各項(xiàng)所構(gòu)成的族群中選出:順鉬(cisplatin)、阿霉素(doxorubicin)、吉西他濱(gemcitabine)、5-氟尿嘧唳(5-fluorouraCil)、PARPl抑制劑、組織蛋白脫乙?；敢种苿?、蛋白酶體抑制劑、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)受體抑制劑、CHKl抑制劑、mTOR抑制劑、激酶抑制劑、己酮可可堿(pentoxify11 ine )和長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine )。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含用放射療法治療受試者，其中所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體提高所述細(xì)胞對(duì)放射療法的敏感性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含用損傷DNA或抑制DNA修復(fù)的抗腫瘤藥治療所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體提高所述細(xì)胞對(duì)所述抗腫瘤藥的敏感性。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述贅生細(xì)胞是位于受試者中，其進(jìn)一步包含用治療性單株抗體治療所述受試者。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體是來(lái)源于患有自體免疫疾病的受試者或動(dòng)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述自體免疫疾病是全身性紅斑狼瘡或其動(dòng)物模型。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體包含單株抗體3E10、其細(xì)胞滲透片段、保守性變異體或人類(lèi)化形式。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體包含3E10的單鏈可變片段(3E10scFv)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體是在不借助于載劑或結(jié)合物的情況下被轉(zhuǎn)運(yùn)到所述細(xì)胞的細(xì)胞核中。
21.一種劑量單元，其包含于藥學(xué)上可接受的賦形劑中的細(xì)胞滲透型抗DNA抗體或其片段，其中所述抗體是以有效抑制具有或不具有固有的DNA修復(fù)不足的癌癥或受病毒感染細(xì)胞中的DNA修復(fù)的量存在。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的劑量單元，其進(jìn)一步包含抗腫瘤藥或放射增敏劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的劑量單元，其中所述抗腫瘤劑是從由以下各項(xiàng)所構(gòu)成的族群中選出:順鉬、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、阿霉素、甲氨蝶呤(methotrexate)、絲裂霉素 C (mitomycin C)、氮芥(nitrogen mustard)、羥基脲、替拉扎明(tirapazamine)、替莫唑胺(temozolomide)、喜樹(shù)喊(camptothecin)、PARP 抑制劑、卡鉬(carboplatin)、表柔比星(epirubicin)、核糖核苷酸還原酶抑制劑、異環(huán)磷酰胺(ifosphamide)、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、舒尼替尼(sunitinib)、鏈脲霉素(streptozocin)、索拉非尼(sorafenib)、放線菌素 D (actinomycin D)、甲基苯甲餅(procarbazine)、DTIC、8_M0P、培美曲塞(pemetrexed)、依維莫司(everolimus)、長(zhǎng)春新喊(vincristine)、長(zhǎng)春喊(vinblastine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、依托泊苷(etoposide)、格`立得(Gliadel)、烷化劑、核苷或核苷酸類(lèi)似物以及它們的組合。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的劑量單元，其中所述放射增敏劑是從由以下各項(xiàng)所構(gòu)成的族群中選出:順鉬、阿霉素、吉西他濱、5-氟尿嘧啶、PARPl抑制劑、組織蛋白脫乙?；敢种苿⒌鞍酌阁w抑制劑、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)受體抑制劑、CHKl抑制劑、mTOR抑制劑、己酮可可堿、長(zhǎng)春瑞濱、迷索硝唑(misonidazole)、絲裂霉素C、烷化劑、核苷類(lèi)似物和核苷酸類(lèi)似物。
25.—種人或人類(lèi)化單株細(xì)胞滲透型抗DNA抗體,其抑制DNA修復(fù),所述細(xì)胞滲透型抗DNA抗體是在不借助于載劑或結(jié)合物的情況下被轉(zhuǎn)運(yùn)到所述細(xì)胞的細(xì)胞核中，且所述抗體并非為由ATCC寄存編號(hào)PTA2439融合瘤產(chǎn)生的單株抗體3E10。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的抗體，其與由ATCC寄存編號(hào)PTA2439融合瘤產(chǎn)生的單株抗體3E10具有相同或不同抗原決定基特異性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體，其包含具有單株抗體3E10的抗體結(jié)合部位的重組型抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的抗體，其是由使用從患有自體免疫疾病的人類(lèi)受試者或從自體免疫疾病的動(dòng)物模型分離的淋巴細(xì)胞制備的融合瘤產(chǎn)生。
29.根據(jù)權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體或其片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是雙特異性單株抗體，其特異性結(jié)合第二標(biāo)靶。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合從由DNA修復(fù)蛋白、DNA復(fù)制蛋白和DNA損傷反應(yīng)蛋白所構(gòu)成的族群中選出的蛋白質(zhì)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合熱休克蛋白(HSP)、Myc蛋白或Raf/Ras蛋白。
33.一種測(cè)定受試者對(duì)DNA損傷療法的敏感性的方法，其包含分析來(lái)自所述受試者的樣品中的細(xì)胞滲透型抗DNA抗體含量,其中所述樣品與對(duì)照物相比細(xì)胞滲透型抗DNA抗體增加表明所述受試 者對(duì)所述DNA損傷療法敏感。
【文檔編號(hào)】C07K16/44GK103874710SQ201280025431
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月1日
【發(fā)明者】J·E·漢森, P·M·格雷澤, R·H·維斯波爾, R·N·西村, G·陳 申請(qǐng)人:耶魯大學(xué), 加利福尼亞大學(xué)董事會(huì), 美國(guó)政府代表的退伍軍人事務(wù)部