專利名稱：降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠有效降低蕓豆中凝集素血凝活性同時(shí)使其促α-淀粉酶抑制活性提高的加工方法。
背景技術(shù)：
蕓豆凝集素(Phytohemagglutinin)是蕓豆種子中的一類糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其具有雙重特性一方面，凝集素屬于一類抗?fàn)I養(yǎng)因子，能夠通過(guò)抑制腸道表面目標(biāo)糖蛋白的消化和腸道刷狀緣膜的活性，從而妨礙了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；但另一方面，它還具有許多有益的生理活性功能，如促α-淀粉酶抑制活性。因?yàn)槭|豆中的α-淀粉酶抑制劑與凝集素都屬于植物自身防御糖蛋白，其基因序列在染色體上排列成簇，根據(jù)Μ. Santimone et al.的研究(Biochimica et Biophysica Acta, 1696, 181-190，2004)表明部分伸展的蕓豆凝集素四聚體蛋白能夠促進(jìn)α -淀粉酶抑制劑的抑制活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化， 進(jìn)而減少糖分的攝取，降低人體內(nèi)血糖和血脂含量水平，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。隨著生活水平提高和飲食結(jié)構(gòu)的不合理，肥胖癥的發(fā)病率逐年攀升，而常常與肥胖伴發(fā)的糖尿病亦成為一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病，據(jù)FDA最新數(shù)據(jù)表明，2010年全世界糖尿病患者約為4. 5億。蕓豆糖蛋白提取物，由于富含α-淀粉酶抑制劑，作為一種純天然物質(zhì)，口服后經(jīng)胃腸道排出體外，不進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，符合世界衛(wèi)生組織倡導(dǎo)的健康安全標(biāo)準(zhǔn)，目前在日本及歐美等國(guó)都有相關(guān)的保健食品在世界各地銷(xiāo)售作為肥胖和糖尿病防治的藥物和保健品。然而為了破壞蕓豆中凝集素的抗?fàn)I養(yǎng)作用，在傳統(tǒng)的加工工藝中，蕓豆糖蛋白提取往往集中于應(yīng)用熱處理或酸堿處理破壞凝集素的血凝活性，同時(shí)也破壞了其促α -淀粉酶抑制活性，降低了蕓豆糖蛋白提取物降糖減肥的藥用效果。因此，尋找一種既能有效的降低蕓豆中凝集素血凝活性又能保持其有益的促α-淀粉酶抑制活性的加工方法十分迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α -淀粉酶抑制活性的方法，以解決目前加工方法中單純的采用熱處理破壞蕓豆凝集素使其抗?fàn)I養(yǎng)性和有益生理活性同時(shí)消失的問(wèn)題，具體技術(shù)方案如下。一種降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α -淀粉酶抑制活性的方法，包括下列步驟
(1)蕓豆提取物的制備將蕓豆或蕓豆粉與生理鹽水混合攪拌4 8h，0 4°C靜置過(guò)夜提取，過(guò)濾后離心，得上清液；
(2)硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4，使上清液中(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度達(dá)到309T90%，0 4°C靜置過(guò)夜，離心取沉淀；將沉淀溶于蒸餾水，透析T5h除鹽，冷凍干燥得蕓 凝集素粗品；
(3)動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白質(zhì)量濃度為
O.5% 2. 5% (w/w)的溶液，在壓力60 MPa 150 MPa條件下微射流均質(zhì)一次或二次；
(4)靜態(tài)超高壓處理將微射流均質(zhì)后的蕓豆提取物濃縮至蛋白質(zhì)量濃度為3% 5% (w/w)，控制處理過(guò)程中樣品處理中溫度為15 40°C，壓力在200MPa 500MPa，保壓時(shí)間 10mirTl5min，得具有降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α -淀粉酶抑制活性的蕓豆凝集素。作為上述方法進(jìn)一步優(yōu)化的技術(shù)方案步驟(I)中所述離心參數(shù)為5000g IOOOOg 下離心 15 min 30min。作為上述方法進(jìn)一步優(yōu)化的技術(shù)方案在步驟(I)中提取料液重量比為1:10-20， 靜置時(shí)間為12 24 h。作為上述方法進(jìn)一步優(yōu)化的技術(shù)方案在步驟(2)中所述離心為4000g 6000g 下離心30 min 40 min。上述方法在步驟(3)中通過(guò)動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理過(guò)程中產(chǎn)生的高頻振蕩、高速撞擊、強(qiáng)烈剪切、空穴爆炸的綜合作用改變蕓豆凝集素的聚集狀態(tài)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果
I、傳統(tǒng)的蕓豆粗提物采用熱處理或酸堿處理方法后能夠使凝集素血凝活性喪失，同時(shí)其有益的生理活性也完全消失。相比之下，本發(fā)明公開(kāi)的降低蕓豆凝集素的血凝活性且提高其促α -淀粉酶抑制活性的加工方法，不僅能夠在有效的降低蕓豆抗?fàn)I養(yǎng)性而且還可以提聞其有益生理活性。2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理結(jié)合靜態(tài)超高壓處理能夠改變蕓豆中凝集素四聚體的解離和聚合形式進(jìn)而抑制其血凝活性，同時(shí)暴露了更多同源的α -淀粉酶抑制劑片段，使其促α-淀粉酶抑制活性提高。3、本發(fā)明公開(kāi)的降低蕓豆凝集素的血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的加工方法，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品安全，可規(guī)模化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施方式中凝集素血凝活性的測(cè)定方式為用胰蛋白酶溶液處理紅細(xì)胞，增強(qiáng)紅細(xì)胞的敏感性。以紅細(xì)胞發(fā)生50%凝集作為判定終點(diǎn)，計(jì)算凝集效價(jià)。凝集效價(jià)以2η(η 為血凝板上樣品產(chǎn)生凝集現(xiàn)象的最大稀釋倍數(shù))表示。α -淀粉酶抑制活性的測(cè)定方式為利用淀粉溶液在I-KI作用下顯藍(lán)色，在660nm 處的吸光值和淀粉的量呈線性關(guān)系的特點(diǎn)，再根據(jù)加入抑制劑前后α-淀粉酶分解淀粉量的差值可計(jì)算出抑制劑的活性。測(cè)定過(guò)程在試管中進(jìn)行，取α-淀粉酶溶液O. 25ml (50mmol/l的磷酸鹽緩沖液配制,pH 6. 9),加入5mg/ml的α -淀粉酶抑制劑與蕓豆粗提物的混合溶液O. 25ml (50mmol/l的磷酸鹽緩沖液配制，pH 6. 9),蒸懼水做空白對(duì)照,相同濃度的α-淀粉酶抑制劑做比較對(duì)照。37°C結(jié)合15 min -30min，加入可溶性淀粉溶液O. 5ml， 37°C恒溫反應(yīng)10min-15min，用鹽酸終止反應(yīng)后加入碘液顯色。加水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度的差異計(jì)算抑制劑的相對(duì)活度。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施不限于此。對(duì)照I
Cl)蕓豆粗提物的制備將蕓豆與生理鹽水混合勻漿，料液比為 6000g離心20min,取上清液；
(2)硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4，使上清液中(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度達(dá)到60%，4°C靜置過(guò)夜，5000g離心30min，取沉淀。將沉淀溶于蒸餾水，透析3h除鹽，冷凍干燥得蕓豆凝集素粗品；
(3)動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白質(zhì)量濃度
I.0%的溶液，在設(shè)定壓力100 MPa條件下微射流均質(zhì)一次；
(4)將處理后的蕓豆凝集素粗品濃縮，經(jīng)冷凍干燥得到蕓豆粗提物粉末I。對(duì)照2
Cl)蕓豆粗提物的制備蕓豆粉碎后與生理鹽水混合攪拌8h，料液比為1:15，4°C靜置 16h, 6000g離心20min,得上清液；
(2)硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4，使上清液中(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度達(dá)到60%，4°C靜置過(guò)夜，5000g離心30min，取沉淀。將沉淀溶于蒸餾水，透析3h除鹽，冷凍干燥得蕓豆凝集素粗品；
(3)靜態(tài)超高壓處理將微射流均質(zhì)后的蕓豆提取物濃縮至蛋白質(zhì)量濃度為3%(w/ w)，控制處理過(guò)程中樣品處理中溫度為40°C，壓力在500MPa，保壓時(shí)間15min，得蕓豆提取物粉末2。
實(shí)施例I
蕓豆提取物的制備將蕓豆與生理鹽水混合勻漿，料液比為1:15，4°C靜置24h，SOOOg 離心20min，取上清液，得蕓豆提取物；
硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4，使上清液中(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度達(dá)到 70%，4°C靜置過(guò)夜，5000g離心30min，取沉淀。將沉淀溶于蒸餾水，透析5h除鹽，冷凍干燥
得蕓豆凝集素粗品；
動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度I. 0%的溶液，在設(shè)定壓力60 MPa條件下微射流均質(zhì)一次；
靜態(tài)超高壓處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度3. 0%的溶液，用包裝袋密封后置于聚四氟乙烯傳壓套筒內(nèi)，控制處理過(guò)程中樣品處理中溫度30°C，壓力控制在300MPa，保壓時(shí)間IOmin ； (5)將裝有蕓豆提取物的包裝袋從聚四氟乙烯傳壓套筒中取出，經(jīng)冷凍干燥得到蕓豆提取物粉末3。
實(shí)施例2
蕓豆提取物的制備蕓豆粉碎后與生理鹽水混合攪拌8小時(shí)，料液比為1:15，4°C靜置 16 h，四層紗布過(guò)濾后離心(8000g，20min)，取上清液，得蕓豆提取物；
硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4至65%飽和，O 4°C靜置過(guò)夜，離心 (5000g，30min)取沉淀。將沉淀溶于蒸餾水，透析3h，除鹽，冷凍干燥得蕓豆凝集素粗品； 動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度I. 0%的溶液，在設(shè)定壓力100 MPa條件下微射流均質(zhì)二次；
靜態(tài)超高壓處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度3. 0%的溶液，用包裝袋密封后置于聚四氟乙烯傳壓套筒內(nèi)，控制處理過(guò)程中樣品處理中溫度35°C，壓力控制在400MPa，保壓時(shí)間15min ；
將裝有蕓豆提取物的包裝袋從聚四氟乙烯傳壓套筒中取出，經(jīng)冷凍干燥得到蕓豆提取物粉末4。實(shí)施例3
蕓豆提取物的制備將蕓豆與生理鹽水混合勻漿，料液比為1:15，4°C靜置24 h，四層紗布過(guò)濾后離心(8000g，20min)，取上清液，得蕓豆提取物；
硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4至70%飽和，O 4°C靜置過(guò)夜，離心 (8000g，30min)取沉淀。將沉淀溶于蒸餾水，透析4h，除鹽，冷凍干燥得蕓豆凝集素粗品； 動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度I. 5%的溶液，在設(shè)定壓力150 MPa條件下微射流均質(zhì)一次；
靜態(tài)超高壓處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度3. 0%的溶液，用包裝袋密封后置于聚四氟乙烯傳壓套筒內(nèi)，控制處理過(guò)程中樣品處理中溫度15°C，壓力控制在450MPa，保壓時(shí)間IOmin ；
將裝有蕓豆提取物的包裝袋從聚四氟乙烯傳壓套筒中取出，經(jīng)冷凍干燥得到蕓豆提取物粉末5。
實(shí)施例4
蕓豆提取物的制備蕓豆粉碎后與生理鹽水混合攪拌8h，料液比為1:15，4°C靜置16 h，四層紗布過(guò)濾后離心(8000g，20min)，取上清液，得蕓豆提取物；
硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4至70%飽和，O 4°C靜置過(guò)夜，離心 (8000g，30min)取沉淀。將沉淀溶于蒸餾水，透析3. 5h，除鹽，冷凍干燥得蕓豆凝集素粗品； 動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度I. 5%的溶液，在設(shè)定壓力150 MPa條件下微射流均質(zhì)一次；
靜態(tài)超高壓處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白濃度2. 5%的溶液，用包裝袋密封后置于聚四氟乙烯傳壓套筒內(nèi)，控制處理過(guò)程中樣品處理中溫度為20°C，壓力控制在500MPa，保壓時(shí)間IOmin ；
將裝有蕓豆提取物的包裝袋從聚四氟乙烯傳壓套筒中取出，經(jīng)冷凍干燥得到蕓豆提取物粉末6。
由表I可見(jiàn)，對(duì)比未經(jīng)超高壓處理的蕓豆粗提物粉末，采用本發(fā)明的加工方法所制備的蕓豆粗提物粉末的凝集素血凝活性均有降低(凝集效價(jià)可由24降低為21)，并且隨著動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)及靜態(tài)高壓處理壓力的增大，血凝活性降低得越多，表明本發(fā)明所采用的加工方法能夠有效的降低蕓豆粗提物的抗?fàn)I養(yǎng)性。由表2可見(jiàn)，單獨(dú)微射流均質(zhì)處理或單獨(dú)超高壓處理的蕓豆提取物也可促進(jìn) α-淀粉酶抑制劑的抑制活性，但效果不明顯；在微射流均質(zhì)處理的基礎(chǔ)上再加以超高壓處理，則可顯著提高蕓豆凝集素促進(jìn)α-淀粉酶抑制劑的抑制活性。采用本發(fā)明的加工方法所制備的蕓豆粗提物粉末的促α-淀粉酶抑制活性均有所提高(相對(duì)抑制率可由53.86% 提聞至69. 41%)ο表I蕓豆粗提物粉末凝集效價(jià)蕓豆粗提物粉末凝集效價(jià)對(duì)照I24對(duì)照224實(shí)例I23實(shí)例222實(shí)例322實(shí)例421
表2
蕓豆粗提物粉末相對(duì)抑制率蕓豆粗提物粉末相對(duì)抑制率對(duì)照I53. 86%對(duì)照254. 53%實(shí)例I59. 34%實(shí)例262. 22%實(shí)例369. 06%實(shí)例468. 40%
權(quán)利要求
1.降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于包括下列步驟(1)蕓豆提取物的制備將蕓豆或蕓豆粉與生理鹽水混合攪拌4 8h，0 4°C靜置過(guò)夜提取，過(guò)濾后離心，得上清液；(2)硫酸銨沉淀向上清液中加入固體(NH4)2SO4，使上清液中(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度達(dá)到309T90%，0 4°C靜置過(guò)夜，離心取沉淀；將沉淀溶于蒸餾水，透析T5h除鹽，冷凍干燥得蕓 凝集素粗品；(3)動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理將蕓豆凝集素粗品用磷酸鹽緩沖液配制成蛋白質(zhì)量濃度為O.5% 2. 5% (w/w)的溶液，在壓力60 MPa 150 MPa條件下微射流均質(zhì)一次或二次；(4)靜態(tài)超高壓處理將微射流均質(zhì)后的蕓豆提取物濃縮至蛋白質(zhì)量濃度為3% 5% (w/w)，控制處理過(guò)程中樣品處理中溫度為15 40°C，壓力在200MPa 500MPa，保壓時(shí)間 10mirTl5min，得具有降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α _淀粉酶抑制活性的蕓豆凝集素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于步驟(I)中所述離心參數(shù)為5000g IOOOOg下離心15 min 30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于在步驟(I)中提取料液重量比為1:10-20，靜置時(shí)間為12 24 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的處理方法，其特征在于在步驟(2)中所述離心為4000g 6000g 下離心 30 min 40 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于在步驟(3)中通過(guò)動(dòng)態(tài)微射流均質(zhì)處理過(guò)程中產(chǎn)生的高頻振蕩、高速撞擊、強(qiáng)烈剪切、空穴爆炸的綜合作用改變蕓豆凝集素的聚集狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明涉及降低蕓豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，包括步驟蕓豆粗提物的制備；硫酸銨沉淀；60MPa~150MPa下微射流均質(zhì)處理一次或兩次；200MPa-500MPa超高壓處理10min~15min；將處理后的蕓豆粗提物取出，經(jīng)冷凍干燥得到蕓豆粗提物粉末。經(jīng)本發(fā)明處理以后，蕓豆粗提物中的凝集素血凝活性降低同時(shí)促α-淀粉酶抑制活性提高，即一方面有效的降低了蕓豆的抗?fàn)I養(yǎng)性，另一方面提高了其有益的促α-淀粉酶抑制活性。
文檔編號(hào)C07K1/30GK102603880SQ201210087009
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者任嬌艷, 劉岑岑, 崔春, 游麗君, 趙謀明 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)