專利名稱：提高棉花耐鹽與干旱能力的GbWD1基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的(ibWDl基因及其編碼的多肽。
背景技術(shù)：
土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源問題和生態(tài)問題，越來越引起人們的重視。聯(lián)合國糧農(nóng)組織的調(diào)查結(jié)果顯示，全球6 %的陸地面積遭受著土壤鹽漬化的侵蝕，20 %的灌溉農(nóng)業(yè)受到不同程度的鹽害威脅。當(dāng)前，全球鹽堿地面積已達(dá)9.5X108hm2。中國鹽漬土總面積約1億hm2，其中已經(jīng)鹽漬化土壤約0. 37億hm2，殘余鹽漬化土壤約0. 45億hm2，潛在鹽漬化土壤約0. 17億hm2。土壤鹽漬化吞噬著有限的土地資源，成為嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問題。大量研究證明，運(yùn)用分子生物學(xué)手段從耐鹽的種質(zhì)(例如海島棉)中分離耐鹽基因，通過轉(zhuǎn)基因分子育種手段獲得耐鹽作物新品種可以有效解決上述問題。土壤鹽漬化對植物的傷害主要包括3個(gè)方面(1)對植物的萌發(fā)和生長產(chǎn)生抑制作用。(2)影響植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用。(3)影響植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。為了應(yīng)對土壤鹽漬化對植物的傷害，植物發(fā)展一系列的耐鹽與避鹽機(jī)制(1)平衡金屬離子的吸收以減少毒性離子(Na+)的傷害；(2)形成大量的調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)如小分子的氨基酸(脯氨酸)、甘露醇、山梨醇等來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓力。近年來，通過分子生物學(xué)方法克隆了大量有關(guān)編碼植物信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(例如堿性磷酸酶互作蛋白激酶cira等)、滲透物質(zhì)合成酶(甜菜堿合成酶)以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等)的基因，并通過轉(zhuǎn)基因的手段將這些基因轉(zhuǎn)化到不同的植物中，獲得了具有一定耐鹽水平的轉(zhuǎn)基因植物。但遺憾地是，到目前為止還沒有上述轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化報(bào)道。因此，分離新的耐鹽/抗旱基因?qū)τ谥参锏哪望}和抗旱轉(zhuǎn)基因育種仍然具有重要的意義。WD重復(fù)蛋白(WD repeats protein)是一類含有色氨酸-天門冬氨酸(WD)重復(fù)序列的蛋白。已有的研究證明WD重復(fù)蛋白參與植物液泡形成和運(yùn)輸，從而實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)組裝以及染色質(zhì)的修飾及轉(zhuǎn)錄等不同的生物化學(xué)過程中的功能。盡管WD重復(fù)蛋白在植物發(fā)育方面的研究比較詳細(xì)，但是有關(guān)WD重復(fù)蛋白如何參與植物抗逆性(耐鹽與抗旱)的研究、以及WD重復(fù)蛋白是否具有耐鹽和抗旱的功能沒有報(bào)道。本申請利用分子生物學(xué)的方法從海島棉中克隆了一個(gè)WD重復(fù)蛋白基因(ibWDl。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過表達(dá)譜分析、蛋白質(zhì)互作分析以及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽與抗旱能力分析證實(shí)WD重復(fù)蛋白基因(ibWDl具有抗旱和耐鹽功能，從而構(gòu)成此發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的基因，并得到所述基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明首次采用分子克隆方法，從構(gòu)建的海島棉根部cDNA文庫中分離獲得了新的(ibWDl基因，并且通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了它具有提高棉花耐鹽與干旱能力的功能，從而達(dá)到了發(fā)明目的。本發(fā)明利用滲透壓誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子在棉花中特異表達(dá)(^bWDl基因提高在干旱、高鹽土壤條件下棉花合成新的液泡數(shù)目，從而提高棉花對有毒Na+離子的分配能力以及調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓力的能力。本發(fā)明包括以下內(nèi)容1、提供了一種新的分離出的(ibWDl蛋白質(zhì)多肽，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)將 SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(較佳地1-20個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐鹽與干旱能力功能的(^bWDl蛋白質(zhì)活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了編碼上述多肽的多核苷酸，選自(a)編碼上述(ibWDl蛋白質(zhì)多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO :1中160-1404位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-1591位的序列。3、提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。4、提供了制備上述(ibWDl蛋白質(zhì)多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和(ibWDl蛋白質(zhì)多肽的用途，即，在培育提高棉花耐鹽與干旱能力的棉花品種方面的應(yīng)用。6、提供了一種提高棉花耐鹽與干旱能力的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的(^bWDl選自下組(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐鹽與干旱能力的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟⑴中的農(nóng)桿菌接觸，從而使(^bWDl基因編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入(ibWDl基因的DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。在本發(fā)明中，術(shù)語“(ibWDl蛋白質(zhì)”、“(ibWDl多肽”或者“提高棉花耐鹽與干旱能力蛋白”可互換使用，都指具有提高棉花抗旱、耐鹽能力的(^bWDl蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的(^bWDl蛋白質(zhì)。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的(ibWDl蛋白或多肽”是指(ibWDl多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化GbffDl蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括(ibWDl蛋白質(zhì)的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、 “衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然(^bWDl蛋白質(zhì)相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽， 或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文所述，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“(ibWDl多肽”指具有能夠與液泡形成蛋白質(zhì)相互作用、能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與(ibWDl蛋白質(zhì)相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)， 更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)， 通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括(^bWDl蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)程度條件下能與(^bWDl雜交的DNA、cDNA所編碼的蛋白、以及利用抗(ibWDl多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含(^bWDl多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 (^bWDl多肽的可溶性片段。 通常，該片段具有(^bWDl多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供(ibWDl蛋白質(zhì)或多肽的類似物。這些類似物與天然(ibWDl多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到。表 權(quán)利要求
1.一種能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的多肽，包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.權(quán)利要求1所述的多肽，所述保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐鹽與干旱能力功能的多肽。
3.權(quán)利要求1或2所述的多肽在提高耐鹽能力方面的功能與應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述的多肽與液泡形成蛋白AtVCl互作的功能。
5.一種能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的基因，包含(a)編碼權(quán)利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)與(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
6.權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于，其序列選自(a)具有SEQID NO :1中160-1404位的序列；或(b)具有SEQ ID NO :1 中 1-1591 的序列。
7.權(quán)利要求5或6所述的基因在提高棉花耐鹽能力方面的功能與應(yīng)用。
8.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求5或6所述的基因。
9.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求8所述的載體。
10.一種提高棉花耐鹽與干旱能力的方法，包括(a)提供攜帶權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌；(b)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所攜帶的表達(dá)載體中的DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(c)選擇出轉(zhuǎn)入有(ibWDl蛋白質(zhì)的DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(d)將步驟(c)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠在干旱、鹽堿條件下促進(jìn)棉花液泡形成GbWD1基因及其編碼的GbWD1蛋白質(zhì)多肽，本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了所述多肽與液泡形成蛋白AtVC1互作的功能，以及在棉花植株中超量表達(dá)GbWD1基因具有顯著提高棉花耐鹽與干旱能力的功能。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102399276SQ20111040692
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者代其林, 左開井, 王勁 申請人:左開井, 王勁