專利名稱：一種血清白蛋白及其表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種血清白蛋白及其表達(dá)載體和構(gòu)建。
背景技術(shù)：
白蛋白是細(xì)胞中營養(yǎng)價(jià)值較高的一種物質(zhì)。組成白蛋白的氨基酸包括了所有受遺傳密碼控制的二十種氨基酸，其中包含有比較多的必需氨基酸，因此是機(jī)體各種代謝活動極為重要的氨基酸來源，例如滋養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)約有1/3來自于在肝臟中合成的白蛋白。 白蛋白被合成后，幾乎全部都被各種組織細(xì)胞消耗，用來合成具有特殊功能的另一類蛋白質(zhì)。白蛋白離開血管系統(tǒng)后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被蛋白酶水解為各種多肽或氨基酸，再合成各種機(jī)體所需的蛋白質(zhì)。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的白蛋白一方面分解產(chǎn)生大量能量，供另一種蛋白質(zhì)合成所需；另一方面又能夠在同一時(shí)間提供各種氨基酸，作為其它蛋白質(zhì)合成的必需原料，因此細(xì)胞能非常高效地利用白蛋白。白蛋白具有非常廣泛的結(jié)合能力，如它既能夠和許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)(脂肪酸、膽紅素、乙酰膽堿、藥物、染料及金屬離子等)結(jié)合，也能同機(jī)體內(nèi)各種大小的化合物結(jié)合，還能同難溶于水和溶于水的許多物質(zhì)相結(jié)合，具有重要的生理意義和臨床意義。通過鐵氧化還原反應(yīng)，亞鐵血紅素有獲得促氧化劑的特性，而白蛋白則是一種比較高效的亞鐵血紅素結(jié)合蛋白。一旦它結(jié)合，促氧化劑特性就會被削弱，從而顯示出抗氧化劑的作用。在臨床上研究學(xué)者觀察到白蛋白能促進(jìn)手術(shù)后傷口的愈合，因而有人認(rèn)為輸注蛋白質(zhì)可以起到損傷修復(fù)的功效，但是蛋白質(zhì)進(jìn)入人體后也是要被蛋白水解酶分解成各種氨基酸的，再在各種酶的作用下才能合成修復(fù)組織所需要的各種蛋白質(zhì)，這個過程明顯曲折而漫長，而且成本較高，因此這種觀點(diǎn)會是不可取的。如果對患者直接注射氨基酸效果將更加直接且高效。另外有研究發(fā)現(xiàn)白蛋白可能通過加快新陳代謝速度，從而達(dá)到修復(fù)組織的目的。在臨床上白蛋白主要用于補(bǔ)充體液，輸血，治療外傷休克，白血病，發(fā)燒，白蛋白過少癥及成紅細(xì)胞增多癥等。血漿中含有兩百多種蛋白，因此，從血漿中純化分離高純度的血清白蛋白，極具挑戰(zhàn)性。目前，已有大量的白蛋白基因被克隆并實(shí)現(xiàn)表達(dá)，特別是牛血清白蛋白、人血清白蛋白等均在畢赤酵母系統(tǒng)中得到高效表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種源自梅花鹿(Cervus axis)的血清白蛋白，在畢赤酵母系統(tǒng)中得到高效表達(dá)。本發(fā)明還提供了該血清白蛋白的表達(dá)載體。本發(fā)明提供的一種血清白蛋白，為如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)
(a)其氨基酸序列如SEQNO. 1所示；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與(a)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)上述的血清白蛋白的重組載體。
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其含有上述的重組載體。本發(fā)明還提供了一種血清白蛋白的基因的克隆方法，所述血清白蛋白的基因的克隆步驟包括從梅花鹿肝臟中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用3’ RACE PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目的基因；目的基因的亞克隆， 取陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，得到血清白蛋白的基因。本發(fā)明還提供了一種血清白蛋白的表達(dá)，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，通過發(fā)酵誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。本發(fā)明提供的一種血清白蛋白(D0F)，其重組DOF易被酶解為多肽或氨基酸等小分子物質(zhì)，經(jīng)免疫家兔制備的多克隆抗體與純化的重組血清白蛋白能夠特異性地結(jié)合；本發(fā)明提供的重組血清白蛋白能促進(jìn)大鼠成骨樣UMR-106細(xì)胞增值。發(fā)明詳述
本發(fā)明分離的的血清白蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化血清白蛋白。基本上純的蛋白在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。血清白蛋白的純度能用氨基酸序列分析。實(shí)施例之一，從梅花鹿鹿茸中分離出促成骨細(xì)胞增值的單一組分，經(jīng)N端測序，N端氨基酸同牛、羊等的血清白蛋白氨基酸序列的N端有極高的同源性。本發(fā)明涉及從梅花鹿肝臟細(xì)胞中克隆的血清白蛋白DOF的編碼序列。實(shí)施例之一，本發(fā)明提取梅花鹿肝臟細(xì)胞的總RNA，通過3’ RACE PCR等的方法克隆到編碼DOF的全長序列。實(shí)施例之一中，所述編碼序列包含如SEQ NO. 1所示的核酸序列，稱之為D0F。實(shí)施例之一中，本領(lǐng)域常用的TA克隆，將所述編碼序列為SEQ NO. 2中的核苷酸序列克隆至 PMD18-T進(jìn)行測序，l-1752bp所示的核苷酸序列為DOF基因。本發(fā)明還涉及包含所述DOF編碼序列的重組載體，例如由各種本領(lǐng)域常用的表達(dá)載體制備的重組載體，所述編碼序列不包含其來源微生物的內(nèi)源性信號肽序列。實(shí)施例之一中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明DOF編碼序列經(jīng)萬⑶RI和Λ^ I雙酶切后與 Eco RI和Λ^ I雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達(dá)載體pPIC9k_D0F。本發(fā)明還制備包含本發(fā)明DOF編碼序列的細(xì)胞。實(shí)施例之一中，所述細(xì)胞是用上述本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的。所述細(xì)胞優(yōu)選各種利于基因產(chǎn)物表達(dá)或發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞，此類細(xì)胞已為本領(lǐng)域熟知并常用，例如各種大腸桿菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施例之一中，選用畢氏酵母GSl 15構(gòu)建表達(dá)血清白蛋白DOF的重組細(xì)胞。本發(fā)明還提供了表達(dá)血清白蛋白DOF的方法，包括培養(yǎng)前述包含DOF編碼序列的細(xì)胞或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，還可以可行性地包括純化表達(dá)產(chǎn)物的步驟。實(shí)施例之一中，本發(fā)明通過包含本發(fā)明DOF編碼序列的酵母(例如畢氏酵母GS115) 發(fā)酵來生產(chǎn)D0F，并通過硫酸銨沉降、脫鹽、離子交換層析和反向色譜柱純化得到了電泳純的目的蛋白。本發(fā)明的血清白蛋白，在畢赤酵母系統(tǒng)中得到高效表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了血清白蛋白的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明通過蛋白質(zhì)分析、酶學(xué)分析、免疫原性分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析，證明本發(fā)明的重組血清白蛋白DOF極易被胃酶、胰酶等降解為易被機(jī)體吸收的小分子多肽和氨基酸， 能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞增值。


圖1血清白蛋白基因(DOF)在畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9K上的重組子結(jié)構(gòu)圖。圖2重組血清白蛋白畢氏酵母表達(dá)發(fā)酵過程樣品的SDS-PAGE圖。圖3經(jīng)純化的本發(fā)明重組血清白蛋白的分子量。圖4重組血清白蛋白的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)分析圖。圖5重組血清白蛋白經(jīng)胃酶(a)和胰酶(b)酶解后的SDS-PAGE電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式以下根據(jù)具體的實(shí)施例充分說明本發(fā)明。I實(shí)驗(yàn)材料和試劑 1.菌株和載體
大腸桿菌DH5a購自于Novagen公司，T載體pMD18 T vector購自于TAKAEA公司。畢赤酵母GS115及表達(dá)載體pPIC9K均購自hvitrogen公司。2.酶類及其他生化試劑
限制性內(nèi)切酶購自！^ermentas，DNA Maker、蛋白質(zhì)Make、3 ’ RACE試劑盒等均購自 TAKARA公司，其他常規(guī)試劑購自中國上海生物工程有限公司。3.使用的培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基，YPD，YPAD, BMDY, BNNY, MM, MD培養(yǎng)基均參照Invitrogen畢氏酵母操作手
ππ
WJo4.方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明中所用到的生物化學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(美國紐約州冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989)；趙永芳等，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第二版)(科學(xué)出版社，2008)；朱檢等，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M](上海科學(xué)技術(shù)出版社，1995)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。如沒有特別說明，本專利中所提及的蛋白質(zhì)電泳均是指SDS-PAGE，實(shí)驗(yàn)參數(shù)為 12. 5%分離膠，5%濃縮膠；120V恒壓電泳30min，然后再150V恒壓電泳60min ；電泳膠用考
馬斯亮藍(lán)染色。本專利中所提及的核酸電泳、DNA電泳等均是指瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)參數(shù)為1% 瓊脂糖，120V恒壓電泳30min，采用膠內(nèi)EB (Ethidium Bromide，溴化乙錠)染色。實(shí)施例1從梅花鹿鹿茸中獲得血清白蛋白組分(DOF)及其抗體制備 (1)鹿茸促成骨細(xì)胞生長因子的純化
準(zhǔn)確稱取150mg的凍干鹿茸分溶于2 ml PBS緩沖液(50 mM pH6. 8,200 mM NaCl)中， 充分溶解；經(jīng)12,000 rpm，4 °C，離心30 min ；取上清液，即為鹿茸提取液。將上述鹿茸提取液 2ml 上 S印hacryl S-200HR 凝膠色譜柱(Φ 1. 6 X 180cm)。先用 PBS (pH6. 8，IOmM)緩沖液洗脫平衡柱子，然后上樣，繼續(xù)用PBS沖洗，分部收集樣品，進(jìn)行體外細(xì)胞活性檢測和蛋白質(zhì)電泳分析。
收集凝膠過濾分離的活性峰樣品，用于POROS 20QE (Φ2. 5X20cm)強(qiáng)陰離子交換柱的分離。先用0. OlM PBS, pH6. 8平衡緩沖液充分平衡；上樣后流加平衡緩沖液以去掉未吸附組分；用同樣的緩沖液含0. 3MNaCl的洗脫緩沖液階段洗脫，流速為lml/min，時(shí)間為 15 min;最后以0.01MPBS，0. 5MNaCl, pH6. 8洗脫液進(jìn)行洗脫。收集個部分樣品進(jìn)行體外細(xì)胞活性檢測和蛋白質(zhì)電泳分析。收集活性樣品，經(jīng)濃縮、脫鹽、凍干，上樣于經(jīng)PBS (pH7. 0，20mM，加IOOmM Na2SO4) 緩沖液平衡的TSK 63000SW色譜柱，流速0. 5ml/min,收集沖洗峰1 ，經(jīng)蛋白質(zhì)電泳檢測該組分已達(dá)到電泳純，分子量大小約為67kDa。(2)鹿茸DOF組分N端序列的測定和分析
利用EDMAN降解法測得鹿茸純化組分的1 的N端起始氨基酸序列為DHKSEIAHRFKDLGEDNFQGLVLIAFSQY。在NBCI網(wǎng)站的蛋白庫中進(jìn)行分析比較后，找到與此起始序列相似性高于90%以上分別源于羊、牛、鼠、稱猴、馬和人的血清白蛋白序列，分別對它們進(jìn)行相似性和同源性的比對，據(jù)此我們判定鹿茸中的純化組分1 為血清白蛋白。(3)鹿茸DOF組分抗體的制備
6周齡家兔(購自福州吳氏實(shí)驗(yàn)動物中心)兩只，在免疫前由耳動脈取血5ml，4°C靜置過夜，6000rpm/min，離心5min，取血清，分裝，-20°C保存。首次注射，取抗原(即上述純化DOF 溶縮至2mg/ml)l. 5ml與等體積的弗氏完全佐劑混合徹底乳化，實(shí)驗(yàn)組兔子注射2ml抗原乳劑，在其背脊兩側(cè)分十處注射。其中對照組兔子以滅菌的生理鹽水為抗原；首次免疫后每間隔3周分別進(jìn)行第2次、第3次和第4次免疫，并在每次免疫前采集2ml血液，經(jīng)處理，取血清，分裝，_20°C保存；第4次免疫一周后，耳動脈大量采血，4°C靜置過夜，6000rpm/min離心 5min，取血清，分裝，-20°C保存。用包被緩沖液將已知抗原(純化的DOF稀釋至lOyg/ml，每孔加100 μ 1，最后一行加入ΙΟΟμ 1的包被緩沖液作為空白對照，4°C靜置過夜；用洗滌液(PBS pH7. 4)洗滌3次，將板倒置于濾紙上吸去殘余液體；每孔加入封閉液(0. 1% BSA) ΙΟΟμ 1，37°C Ih ； 用洗滌液洗滌3次，并將板扣干；將上述待測血清用樣本稀釋液(IOOmM pBNa pH6. 0)按 1:102，1:103，1:104，1:105，1:106，1:107 稀釋后，每孔加 100μ 1，做復(fù)孔，37°C恒溫 Ih ；用洗滌液洗滌4次，并將板扣干；二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗羊抗兔)用封閉液1:6000稀釋，100μ 1/孔，37°C恒溫Ih ；用洗滌液洗滌4次，并將板扣干；各孔中加入臨時(shí)配置的TMB 底物溶液0. 1ml，室溫避光顯色15 20min;每孔加入終止液(濃硫酸)50 μ 1，于450nm 以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。測定結(jié)果如表1，末次免疫后抗血清稀釋100000倍時(shí)A45tlnm為0. 2095，故ELISA測得抗血清效價(jià)在1:100000以上，成功獲得檢測多克隆抗體。表1梅花鹿DOF的免疫血清測定吸光值
權(quán)利要求
1.一種血清白蛋白，為如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列如SEQNO. 1所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與(a)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。
2.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的血清白蛋白的重組載體。
3.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求2所述的重組載體。
4.一種如權(quán)利要求1所述的血清白蛋白的基因的克隆方法，其特征在于所述血清白蛋白的基因的克隆步驟包括從梅花鹿肝臟中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用 3’ RACE PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并回收凝膠中的目的基因；目的基因的亞克隆，取陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，得到血清白蛋白的基因。
5.一種如權(quán)利要求1所述的血清白蛋白的表達(dá)，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求3或4所述的宿主細(xì)胞，通過發(fā)酵誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種血清白蛋白及其表達(dá)載體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明血清白蛋白，為如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列如SEQNO.1所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與(a)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)上述的血清白蛋白的重組載體。本發(fā)明提供一種血清白蛋白(DOF)易被酶解為多肽或氨基酸等小分子物質(zhì)，經(jīng)免疫家兔制備的多克隆抗體與純化的重組血清白蛋白能夠特異性地結(jié)合；本發(fā)明提供的重組血清白蛋白能促大鼠成骨樣UMR-106細(xì)胞增值。
文檔編號C07K14/765GK102399286SQ201110405289
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者葉秀云, 李仁寬, 林娟, 陳萍 申請人:福州大學(xué)