專利名稱：基于金屬離子和氧化石墨烯的dna切割方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法。
背景技術(shù)：
核酸是生命體內(nèi)重要的生物大分子，它不僅對于生命的延續(xù)、生物物種遺傳特性的保持、生長發(fā)育、細(xì)胞分化等起著重要的作用，而且與生物變異，如腫瘤、遺傳病、代謝病等也密切相關(guān)。所以如何有效操縱核酸分子不僅在癌癥等疾病治療方面，而且在生物技術(shù)本身都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。近幾年來用有機(jī)小分子來影響和干擾核酸分子的研究吸引了人們的研究興趣。其中模擬核酸的人工核酸酶來有效切割脫氧核糖核酸DNA(Deoxyribonucleic acid)的研究取得了顯著的成績。已經(jīng)合成了許多可以有效切割DNA的過渡金屬配合物。例如，比較經(jīng)典的Fe (Bleomycin)，Mn (Porphyin)，和 Cu(Phenanthroline)等金屬配合物可以有效切割DNA。金屬配合物的幾何構(gòu)型在與DNA的相互作用過程中起著至關(guān)重要的作用，因此對金屬配合物進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)能夠改變其空間構(gòu)型以及電子結(jié)構(gòu)，對研究它們與DNA的作用機(jī)理和生物功能，從而在尋找能識別DNA的構(gòu)象和序列的能力的多功能試劑中發(fā)揮著重要作用。此外，用小分子過渡金屬配合物與大分子DNA的相互作用研究去探索大分子DNA的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其功能，將為其他研究領(lǐng)域如，基因芯片、DNA生物傳感器、DNA計(jì)算機(jī)等的開發(fā)研究提供重要理論基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)含有大的平面結(jié)構(gòu)配體的金屬配合物具有很好的和DNA結(jié)合的能力，因此也具有很好的DNA的切割活性。但是很合成具有超大平面結(jié)構(gòu)的小分子有機(jī)化合物作為金屬離子的配體形成具有較大平面性的化合物，而且這些化合物的與DNA作用時(shí)都必須在光照或者其它輔助試劑的作用下才可發(fā)生(文獻(xiàn):Inorg. Chem. 2007，46，11122-11132 J. Phys. Chem. B 2010，114， 5851-5861)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于金屬離子和氧化石墨烯的 DNA切割方法，利用氧化石墨烯材料的單原子層、平面結(jié)構(gòu)、表面官能團(tuán)的特點(diǎn)，結(jié)合金屬銅離子、鋅離子、錳離子，鎳離子，實(shí)現(xiàn)了一種新的DNA切割方式。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟第一步將氧化石墨超聲分散于去離子水中，制成黃褐色的氧化石墨烯水溶液。所述的氧化石墨水溶液的制備是通過將天然石墨依次與硝酸鈉，濃硫酸和高錳酸鉀在低溫反應(yīng)后分散于過氧化氫水溶液中，經(jīng)過干燥、酸洗和干燥處理得到固體，然后分散到水溶液中。第二步將滅菌后的氧化石墨烯和金屬離子加入到DNA緩沖溶液中，在常溫下反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DNA切割。所述的滅菌是指用0. 22 μ m的過濾膜過濾溶液。
所述的氧化石墨烯是指0. 5mg/mL氧化石墨烯水溶液。所述的金屬離子是指濃度為50mM的氯化銅、氯化錳、氯化鋅或氯化鎳水溶液，
所述的DNA是指超螺旋的PSICOR-GFP DNA,濃度為0. 5 μ g/ μ L，所述的DNA緩沖溶液是指ρΗ為7. 2，濃度為50mM的Tris緩沖液。所述的常溫下反應(yīng)是指將樣品放在水浴鍋內(nèi)反應(yīng)兩小時(shí)，水浴溫度為37°C。本發(fā)明是利用納米材料的氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，結(jié)合金屬離子的特征達(dá)到切割DNA的目的。與現(xiàn)有報(bào)道的小分子DNA切割劑相比，因?yàn)檠趸┑钠矫嫘暂^大， 可以提高對DNA切割的選擇性，此外，因?yàn)檠趸┛梢耘c多種金屬離子相互作用，所以為發(fā)現(xiàn)可以設(shè)別不同結(jié)構(gòu)的DNA體系的研究奠定基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明的步驟示意圖。圖2為切割后DNA的凝膠電泳圖；其中泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為超螺旋DNA，泳道3為線性DNA，泳道4為泳道 2的樣品用本發(fā)明體系切割后的超螺旋DNA。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。在應(yīng)用本體系切割DNA的過程中，通過調(diào)整金屬離子和氧化石墨烯的用量以及二者之間的比例可以確定最佳的反應(yīng)時(shí)間。圖二是利用凝膠電泳表征切割后的DNA。環(huán)形DNA 條帶表明本發(fā)明的體系可以有效切割單鏈DNA。實(shí)例施1如圖1所示，本實(shí)施例所述的制備方法包括以下步驟第一步、稱取0. 0085g CuCl2 · 2H20,配置50mM的溶液，用0. 22 μ m的過濾膜過濾。第二步、量取4 μ L用0. 22 μ m的過濾膜過濾的氧化石墨烯水溶液和4 μ L過濾后的濃度為50mM的CuCl2溶液。第三步、將上述兩種試劑加入到ρΗ為7. 2，濃度為50mM的Tris緩沖液中。第四步、在上述溶液中加入3 μ L濃度為0. 5 μ g/ μ L的DNA。第五步、倒置樣品管幾次，使反應(yīng)液達(dá)到充分混合。將樣品管放置在預(yù)先預(yù)熱的37 度水浴鍋中，反應(yīng)2小時(shí)。第六步、加入體積為2 μ L濃度為0. 75mM的溴酚藍(lán)凝膠上樣緩沖液停止反應(yīng)。實(shí)施例2第一步、稱取0. 0122g ZnCl2 · 6H20,配置50mM的溶液，用0. 22 μ m的過濾膜過濾。第二步、量取用0. 22 μ m的過濾膜過濾的氧化石墨烯水溶液4 μ L和4 μ L過濾后的濃度為50mM的ZnCl2溶液。第三步、將上述兩種試劑加入到ρΗ為7. 2，濃度為50mM的Tris緩沖液中。第四步、在上述溶液中加入3 μ L濃度為0. 5 μ g/ μ L的DNA。
第五步、倒置樣品管幾次，使反應(yīng)液達(dá)到充分混合。將樣品管放置在預(yù)先預(yù)熱的37 度水浴鍋中，反應(yīng)2小時(shí)。第六步、加入體積為2 μ L濃度為0. 75mM的溴酚藍(lán)凝膠上樣緩沖液停止反應(yīng)。實(shí)施例3第一步、在室溫下，稱取0. Olg MnCl2 · 4H20,配置50mM的溶液，用0. 22 μ m的過濾
膜過濾。第二步、量取用0. 22 μ m的過濾膜過濾的氧化石墨烯水溶液4 μ L和4 μ L過濾后的濃度為50mM的MnCl2溶液。第三步、將上述兩種試劑加入到pH為7. 2，濃度為50mM的Tris緩沖液中。第四步、在上述溶液中加入3 μ L濃度為0. 5 μ g/ μ L的DNA。第五步、倒置樣品管幾次，使反應(yīng)液達(dá)到充分混合。將樣品管放置在預(yù)先預(yù)熱的37 度水浴鍋中，反應(yīng)2小時(shí)。第六步、加入體積為2 μ L濃度為0. 75mM的溴酚藍(lán)凝膠上樣緩沖液停止反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征在于，包括以下步驟 第一步將氧化石墨超聲分散于去離子水中，制成黃褐色的氧化石墨烯水溶液。 第二步將滅菌后的氧化石墨烯和金屬離子加入到DNA緩沖溶液中，在常溫下反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DNA切割。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征是，所述的氧化石墨水溶液的制備是通過將天然石墨依次與硝酸鈉，濃硫酸和高錳酸鉀在低溫反應(yīng)后分散于過氧化氫水溶液中，經(jīng)過干燥、酸洗和干燥處理得到固體，然后分散到水溶液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征是，所述的滅菌是指用0. 22 μ m的過濾膜過濾溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征是，所述的氧化石墨烯是指0. 5mg/mL氧化石墨烯水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征是，所述的金屬離子是指濃度為50mM的氯化銅、氯化錳、氯化鋅或氯化鎳水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征是，所述的DNA是指超螺旋的PSICOR-GFP DNA,濃度為0. 5 μ g/ μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征是，所述的DNA緩沖溶液是指ρΗ為7. 2，濃度為50mM的Tris緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，其特征是，所述的常溫下反應(yīng)是指將樣品放在水浴鍋內(nèi)反應(yīng)兩小時(shí)，水浴溫度為37°C。
全文摘要
一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的基于金屬離子和氧化石墨烯的DNA切割方法，通過制備氧化石墨烯水溶液，并將滅菌后的氧化石墨烯和金屬離子加入到DNA緩沖溶液中，在常溫下反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DNA切割。本發(fā)明利用氧化石墨烯材料的單原子層、平面結(jié)構(gòu)、表面官能團(tuán)的特點(diǎn)，結(jié)合金屬銅離子、鋅離子、錳離子，鎳離子。與現(xiàn)有的許多DNA切割試劑相比，本發(fā)明中所用的氧化石墨烯和金屬離子切割DNA體系不需要任何輔助試劑，如氧化劑或者還原劑，或者使用光照射，只需要在37℃的生理?xiàng)l件下就可完成。
文檔編號C07H21/04GK102286458SQ20111012560
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者任紅柳, 周雪皎, 張井巖, 張佳利, 徐達(dá)鋒, 王翀, 鄭靜, 郭守武 申請人:上海交通大學(xué)