專利名稱：禽流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于禽流感疫苗的肽和肽結(jié)合的脂質(zhì)體、以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感病毒通過遺傳漂變而改變其表面抗原性，每年引起流行。此外，在約10年至 40年的周期中，由于轉(zhuǎn)變已出現(xiàn)了抗原性譜(profile)與其完全不同的新型病毒，這在對(duì)該新型病毒缺乏免疫性的人類中引起了世界大流行(下文稱為“流行病”)。據(jù)稱，過去的西班牙流感、香港流感和其它流行病有可能是禽流感病毒引起的；存在將來500萬至1億5000萬人將有可能死于禽流感的估計(jì)。目前，引起高死亡率的高致病性禽流感(H5N1)的感染在世界各地被報(bào)告；迫切需要有效的對(duì)策。通常地，包括禽流感病毒在內(nèi)的流感病毒很可能在增殖過程中經(jīng)歷突變。而且，如果感染了人的病毒在體內(nèi)與人流感病毒重排列，則可能出現(xiàn)在人之間有高感染性、同時(shí)保持高致病性的病毒。病毒本身的這些頻繁變化是上述重復(fù)流行病的原因。點(diǎn)突變(抗原遺傳漂變)在編碼病毒表面糖蛋白[血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶 (NA)]的基因中發(fā)生，而抗原轉(zhuǎn)變產(chǎn)生兩個(gè)基因都在免疫學(xué)上改變的新毒株。常規(guī)疫苗誘導(dǎo)與流感病毒表面蛋白特異性結(jié)合的抗體的產(chǎn)生，并且通過該抗體的作用使病毒喪失感染潛力。但是，如上所述，表面蛋白很可能經(jīng)歷突變，從而使得上述疫苗誘導(dǎo)的抗體不總是有效。目前，根據(jù)預(yù)期流行的病毒類型儲(chǔ)備疫苗，但該預(yù)期可能是令人失望的，引起損害擴(kuò)大。同時(shí)，流感病毒的內(nèi)部蛋白即使在遺傳漂變突變體和轉(zhuǎn)變突變體中也相對(duì)地高度保守，難以通過從病毒外部結(jié)合抗體而使該蛋白失活，從而使得內(nèi)部蛋白尚未被積極地用作常規(guī)疫苗的靶。病毒-感染的細(xì)胞在其表面上暴露摻入病毒內(nèi)部蛋白的氨基酸序列的一部分的主要組織相容性抗原復(fù)合體(MHC)。如果可以制備能夠特異性地殺傷表現(xiàn)這些特征的病毒-感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，那么就可能有效地防止病毒的復(fù)制并從而防止其增殖和擴(kuò)散，而不受突變的影響。專利文獻(xiàn)1公開了制備T細(xì)胞激活劑的方法，所述T細(xì)胞激活劑能夠有效地和特異性地增加用于殺傷病原體-感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+ T細(xì)胞， 細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞CTL)，其應(yīng)用抗原結(jié)合的脂質(zhì)體，并且所述T細(xì)胞激活劑用于傳染病和癌癥的預(yù)防或治療。但是，完全不清楚的是，該方法是否可在實(shí)際上有效地預(yù)防禽流感病毒感染，和哪類抗原可用于制備有效的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn) 1: JP-A-2008-37831 發(fā)明概述
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的一個(gè)目的是提供不太可能受病毒突變影響的、用于有效地預(yù)防高致病性禽流感病毒感染的疫苗。解決問題的手段
本發(fā)明人勤勉地進(jìn)行研究而完成上述目的，并在高致病性禽流感病毒的高度保守的內(nèi)部蛋白序列中發(fā)現(xiàn)了在制備上述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞中尤其有效的抗原表位。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過用結(jié)合了包含該表位的肽的脂質(zhì)體進(jìn)行接種疫苗，抗原-特異性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞可以被非常有力地誘導(dǎo)，并開發(fā)了本發(fā)明。因此，本發(fā)明如下。[1]能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的肽， 所述肽包含
(1)SEQ ID N0:7、3或8中的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:7、3或8中的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取
代，
并具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。[2]根據(jù)[1]的肽，其中 HLA 是 HLA_A*0201 或 HLA_AM402。[3]肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且
能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；
其中所述脂質(zhì)體包括具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；⒒驇в?4至 24個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂，和脂質(zhì)體穩(wěn)定劑；并且其中所述肽與所述脂質(zhì)體的表面結(jié)合。[4]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述HLA是HLA_A*0201或HLA_AM402。[5]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述磷脂是具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；牧字?。[6]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述?；怯王；7]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述磷脂是選自下列的至少一種二?；字＝z氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二?；字帷⒍；字Ｄ憠A、二?；字Ｒ掖及贰㈢牾啺坊?二酰基磷脂酰乙醇胺和馬來酰亞胺基-二?；字Ｒ掖及?。[8]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體穩(wěn)定劑是膽固醇。[9]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述肽與構(gòu)成脂質(zhì)體的磷脂膜中含有的、 具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；驇в?4至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂結(jié)合。[10]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體具有下列組成
(A)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；?、或帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂 1至99. 8 mol% ；
(B)脂質(zhì)體穩(wěn)定劑0.2至75 mol%。
[11]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體具有下列組成
(I)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；?、或帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的酸性磷脂 1至85 mol% ；
(II)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；⒒驇в?4至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的中性磷脂 0. 01至80 mol% ；
(III)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的酰基、或帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂，帶有與其結(jié)合的肽0. 2至80 mol% ；
(IV)脂質(zhì)體穩(wěn)定劑0.2至75 mol%0[12]細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活劑，包括肽， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且
能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。[13]細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活劑，其包括根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體。[14]根據(jù)[12]或[13]的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活劑，其進(jìn)一步包括CpG_DNA。[15]禽流感病毒疫苗，其包括肽， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且
能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。[16]禽流感病毒疫苗，其包括根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體。[17]根據(jù)[15]或[16]的禽流感病毒疫苗，其進(jìn)一步包括CpG_DNA。[18]用于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化的肽， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且
能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。[19]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其用于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化。[20]藥物組合物，其用于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化，其包括根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體和CpG-DNA。[21]肽，其用于針對(duì)禽流感的接種疫苗， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且
能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
[22]根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其用于針對(duì)禽流感的接種疫苗。[23]藥物組合物，其用于針對(duì)禽流感的接種疫苗，其包括根據(jù)[3]的肽結(jié)合的脂質(zhì)體和CpG-DNA。本發(fā)明的效果
應(yīng)用本發(fā)明的肽和肽結(jié)合的脂質(zhì)體，可以從衍生自禽流感病毒的高度保守內(nèi)部蛋白的抗原制備禽流感疫苗。根據(jù)本發(fā)明，可能提供高度通用的禽流感疫苗，其不同于常規(guī)禽流感疫苗且不太可能受到病毒表面蛋白突變的影響，從而消除了對(duì)預(yù)期要流行的病毒毒株(型或亞型)進(jìn)行正確估計(jì)的需要。實(shí)施本發(fā)明的方式
本發(fā)明提供了能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的肽，其包括(1) SEQ ID NO: 1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或O) SEQ ID NO: 1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代，并且具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度(本發(fā)明的肽)。本發(fā)明已基于高致病性禽流感病毒抗原中下列優(yōu)異表位序列(本發(fā)明的表位序列)的發(fā)現(xiàn)而開發(fā)
-SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，
-SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代(此處，由該氨基酸序列構(gòu)成的肽能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)。SEQ ID NO: 1至9所示的氨基酸序列相當(dāng)于高致病性禽流感病毒A/Hong_ Kong/483/97 (H5N1)的內(nèi)部蛋白 PA(SEQ ID NO: 2 和 3)、PBl (SEQ ID NO: 1、4、5、6 和 9)和 PB2 (SEQ ID N0:7和8)的氨基酸序列中存在的部分序列。對(duì)O)中的取代方式?jīng)]有特別限制，只要由該氨基酸序列構(gòu)成的肽能夠誘導(dǎo) HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞即可；反映在不同的禽流感病毒毒株(型或亞型)的相同抗原中的對(duì)應(yīng)表位序列中已發(fā)生的已知氨基酸突變的取代方式可作為優(yōu)選方式而提到?？商岬较铝凶鳛榇朔N取代的實(shí)例。
權(quán)利要求
1.能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的肽， 所述肽包含(1)SEQ ID N0:7、3或8中的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:7、3或8中的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代，并具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
2.權(quán)利要求1所述的肽，其中所述HLA是HLA-A*0201或HLA_AM402。
3.肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；其中所述脂質(zhì)體包括具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；?、或帶有14至 24個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂，和脂質(zhì)體穩(wěn)定劑；并且其中所述肽與所述脂質(zhì)體的表面結(jié)合。
4.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述HLA是HLA-A*0201或HLA_AM402。
5.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述磷脂是具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；牧字?。
6.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述?；怯王；?。
7.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述磷脂是選自下列的至少一種二?；字＝z氨酸、二?；字８视汀⒍；字帷⒍；字Ｄ憠A、二?；字Ｒ掖及?、琥珀酰亞胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和馬來酰亞胺基-二?；字Ｒ掖及?。
8.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體穩(wěn)定劑是膽固醇。
9.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述肽與構(gòu)成所述脂質(zhì)體的磷脂膜中含有的、具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；驇в?4至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂結(jié)合。
10.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體具有下列組成(A)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；⒒驇в?4至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂 1至99. 8 mol% ；(B)脂質(zhì)體穩(wěn)定劑0.2至75 mol%0
11.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體具有下列組成(I)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；?、或帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的酸性磷脂 1至85 mol% ；(II)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的酰基、或帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的中性磷脂 0. 01至80 mol% ；(III)具有帶有14至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的?；⒒驇в?4至M個(gè)碳原子和一個(gè)不飽和鍵的烴基的磷脂，帶有與其結(jié)合的肽0. 2至80 mol% ；(IV)脂質(zhì)體穩(wěn)定劑0.2至75 mol%0
12.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活劑，包括肽， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
13.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活劑，其包括權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體。
14.權(quán)利要求12或13所述的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活劑，其進(jìn)一步包括CpG-DNA。
15.禽流感病毒疫苗，其包括肽， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
16.禽流感病毒疫苗，其包括權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體。
17.權(quán)利要求15或16所述的禽流感病毒疫苗，其進(jìn)一步包括CpG-DNA。
18.用于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化的肽， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
19.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其用于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化。
20.藥物組合物，其用于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化，其包括權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體和CpG-DNA。
21.肽，其用于針對(duì)禽流感的接種疫苗， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代， 具有9至11個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且能夠誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
22.權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體，其用于針對(duì)禽流感的接種疫苗。
23.藥物組合物，其用于針對(duì)禽流感的接種疫苗，其包括權(quán)利要求3所述的肽結(jié)合的脂質(zhì)體和CpG-DNA。
全文摘要
含有脂質(zhì)體和與脂質(zhì)體結(jié)合的肽的禽流感病毒疫苗，其中所述肽包含(1)SEQIDNO:1至SEQIDNO9的任一個(gè)所示的氨基酸序列，或(2)SEQIDNO:1至SEQIDNO9的任一個(gè)所示的氨基酸序列中通過一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代產(chǎn)生的氨基酸序列，具有9至11個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度，并且可誘導(dǎo)HLA-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；且所述脂質(zhì)體包括具有含有一個(gè)不飽和鍵的C14-24?；?、或含有一個(gè)不飽和鍵的C14-24烴基的磷脂，和脂質(zhì)體穩(wěn)定劑；并且其中所述肽與所述脂質(zhì)體的表面結(jié)合。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102232083SQ20098014754
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者內(nèi)田哲也, 小田洋, 松井政則, 梶野喜一, 種市麻衣子 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人北海道大學(xué), 學(xué)校法人埼玉醫(yī)科大學(xué), 日本國(guó)立感染癥研究所, 日油株式會(huì)社