專利名稱：軍曹魚MHC-Ⅱβ基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，尤其是涉及一種軍曹魚MHC-Iie基因序列。
背景技術(shù)：
MHC (major histocompatibility complex)即主要組織相容性復(fù)合體，是指染色體上由一系列緊密連鎖的基因位點(diǎn)所組成的具有高度多態(tài)性的復(fù)合遺傳系統(tǒng)或區(qū)域。是由MHC編碼的一類細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白，能結(jié)合并呈遞內(nèi)源抗原和外源抗原給T淋巴細(xì)胞。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的不同，MHC可分為MHC I類分子和MHC II類分子。其中，II類MHC分子呈遞的抗原多是細(xì)胞外源性多肽，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)由a 、P和輔助分子Y鏈組裝成完整三聚體，蛋白酶水解Y鏈，抗原多肽與II類MHC分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的II類MHC-多肽復(fù)合體，再運(yùn)至細(xì)胞表面，外源性抗原在線粒體或溶酶體中與MHC II類分子結(jié)合后呈遞給協(xié)助T淋巴細(xì)胞(Th，CD4+)，從而觸發(fā)免疫反應(yīng)。魚類MHC II類分子是由a鏈和P鏈以非共價(jià)鍵的形式組成一個(gè)異二聚體。 MHC廣泛參與免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)，激發(fā)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，在免疫學(xué)上具有極為重要的意義。由于MHC具有多態(tài)性、與疾病的相關(guān)性以及連鎖不平衡性的特點(diǎn)，因此，了解魚類MHC基因的結(jié)構(gòu)與功能，尋找與疾病相關(guān)聯(lián)的易感基因或疾病抵抗基因，對(duì)預(yù)防疾病具有很高的價(jià)值。此外，由于MHC的高度多態(tài)性，故可用于種群遺傳學(xué)研究，并作為種群分子進(jìn)化的標(biāo)記之一。再者，MHC具有的多態(tài)性、與疾病的關(guān)聯(lián)及其連鎖不平衡等特點(diǎn)可以用來選育抗病品系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種軍曹魚腿C-II |3基因序列。 本發(fā)明通過以近源物種腿C-Iie基因的CDS序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)的兼并引物，并用PCR法擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到軍曹魚MHC-II P鏈基因的全表達(dá)序列；通過對(duì)MHC-II P基因設(shè)計(jì)有效地鑒定引物，從而可以通過半定量來分析該基因的組織分布情況，并運(yùn)用熒光定量PCR對(duì)經(jīng)LPS剌激后的脾臟中的MHCIie的表達(dá)量進(jìn)行了分析。具體DNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列如下 agagctctcaactcaccatcatggcttcatccttcgtctgcctctgcctcgtcttcatcg
〈 Leader peptide MASSFVCLCLVFI ctgcctecacagcagatggattcatgaatttcgcggtgggtcgctgtgacttteactcct
X P 1 domain AAYT^DGFMNFAVGRCDFNS ctgatccteaagacatcgagtecattcagtcttettettecaacgaactggagttcatca SDPKDIEYIQSYYYNELEFI ggttc3gC3gC3gtgtgggg皿gtttgttgg3tec3C3g3gcttgg3gtg皿g皿cgC3g
憶
60
13120
33180
53240
RFSSSVGKFVGYTELGVKNA 73 皿cgctgg皿c皿3ggtcc3g3gttggttc3g3tg皿gggtg3g皿gg3C3g3tectgtg 300 ERWNKGPELVQMKGEKDRYC 93 tcaggaccgtgggactegactecacagctettctgacteagtcagtcgaaccctcggtca 360
X domain VRTVGLDYTAILTKSYEPSV 113 ggctgcactcgaccacgccccctetgggcaaacacccggccatgctggtctgcagcgtct 420 RLHSTTPPMGKHPAMLVCSV 133 acgacttcteccccaaatecatcagggtgagttggtgccgagatggacaggaagtggcct 480 YDFYPKYIRVSWCRDGQEVA 153 ctgatgtcagctccactgaggagctggctgacggcgactggtecteccagatccactctc 540 SDVSSTEELADGDWYYQIHS 173 acctggagtecacgcccaggtctggagagaagatctcctgtgtggtggagcacgccagcc 600 HLEYTPRSGEKISCVVEHAS 193 tgaaagaacctctggttettgactgggatccgtccatgcctgagtcagagagaaacaaaa 660
〉〈 CP/TM/CYT regi on LKEPLVIDW2PSMPESERNK 213 ttgccattggagcttcaggactgatcctgggtctgatcttetctctggctggattcatct 720 IAIGASGLILGLILSLAGFI 233 actecaagaggaaggcccgaggaaggatcctggttcccacteactgagccaggtcctgte 780 YYKRKARGRILVPTN* 248 tgctggacctggacctggacctggacctgcttctcagatggaagaaaatcagctgctgct 840 tteaactgcttcttgtttctcagtgctgccacttgttggaccagctgaacacctcagtct 900 ggtccaggactggrtctgacagtctgctggtcteaacctggtycatgaggtcacaggagt 960 cttgatcgggactctgacagtcctggaccaggttteatgtggactcacgtgtetcagctg 1020 gatctggactctgctgctttectgtgtgaatcaaaaccagatcagggctctggtgtcaaa 1080 tccttcatgatccagatgttttctecgctgtcatgt attta caateaaaaccaccagaaa 1140 c t c t g皿皿皿皿皿皿皿皿 1161 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本基因的獲得不僅為研究魚類MHC-II |3類分子的作用機(jī)理以及MHC-II 13基因多態(tài)性與魚體抗病力的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為進(jìn)一步研究MHC-Iie的免疫學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)提供理論基礎(chǔ)。本基因?yàn)轸~類種群遺傳學(xué)及進(jìn)化遺傳學(xué)研究提供材料，可用于種群遺傳學(xué)研究，并作為種群分子進(jìn)化的標(biāo)記之一。同時(shí)可以進(jìn)行抗病相關(guān)性及抗病輔助育種的研究。


圖i是本發(fā)明在軍曹魚正常組織中的分布；
A.正常軍曹魚組織的腿CIie基因的組織表達(dá)
B. e-actin 1.頭腎；2.皮膚；3.脾；4.腸；5.鰓；6.腦；7.心
圖2是本發(fā)明經(jīng)LPS剌激后軍曹魚脾臟組織中的MHC-II P基因隨時(shí)間的表達(dá)變化圖。
具體實(shí)施例方式
1.總RNA的提取 取健康的軍曹魚(體重約1000g)在養(yǎng)殖桶中養(yǎng)殖3日后，腹腔注射1ml的鯊魚弧菌(JT2)。剌激192h后，解剖魚體取出脾臟約250mg，放入-8(TC冰箱備用。取備用組織約lOOmg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol (美國invitrogen公司)進(jìn)行勻漿，按照試劑盒說明提取總RNA。 2. cDNA第一鏈的合成 取軍曹魚總RNA5iig與反轉(zhuǎn)錄引物(oligodT接頭引物)1 (1Opmol/L)混合，65。C加熱5min后，立即放置冰上靜置2min，然后加入5Xbuffer， 10mmol/LdNTP混合液，Ribo皿clease Inhibitor, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為20 ii 1 。反應(yīng)程序?yàn)?7°C 、60min，最后放入-S(TC保存?zhèn)溆谩?br> 3.引物設(shè)計(jì)依據(jù)，引物合成的方法 從GenBank中下載近源物種(如人、鼠、虹鱒等)MHCII-e同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物，擴(kuò)增片段大小約為460bp。引物設(shè)計(jì)后提交英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA合成。
4.對(duì)軍曹魚MHC-II P基因cDNA全序列的克隆 以近源物種MHC-II 13基因CDS序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)的兼并引物，擴(kuò)增片段大小約為460bp。 以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)簡并引物PCR檢測(cè)后，將具有插入片段的質(zhì)粒DNA用M13通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。
根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(R即id Amplification of cDNA ends,RACE)對(duì)目的基因的3'和5'末端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在3' RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側(cè)引物和接頭引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得產(chǎn)物利用內(nèi)側(cè)和接頭引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 在5' RACE中，利用末端轉(zhuǎn)移酶和dCTP在cDNA末端加上poly (C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側(cè)特異性引物和OligodG進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物再利用內(nèi)側(cè)引物和OligodG進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。 所得到的PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，用M13引物對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得序列再與兼并引物擴(kuò)增所得的序列利用DNAStar軟件進(jìn)行拼接。 5.對(duì)軍曹魚MHC-II |3基因的測(cè)定 所得到的PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P IO感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性測(cè)定，來確定為軍曹魚MHC-II P基因同源序列。
6、MHC-Iie基因在不同組織中的RT-PCR分析 用引物肌動(dòng)蛋白F和肌動(dòng)蛋白R(shí)擴(kuò)增P-actin為內(nèi)參照，取健康的軍曹魚(185g) 心臟、脾臟、鰓、頭腎、皮膚、心和腦等組織，設(shè)計(jì)特異性引物(J2BF， J2BR)對(duì)MHC-IIP的 cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。用13 -actin基因作為內(nèi)參照(引物分別為P -ActinF， P -ActinR)， 擴(kuò)增500bp左右的片段，調(diào)整各樣品模板濃度。PCR反應(yīng)參數(shù)為94t:預(yù)變性5min，然后 94t:變性50S，58t:退火50S，72t:延伸50S，共35個(gè)循環(huán)，然后72。C延伸10min。 PCR產(chǎn)物 用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)。如圖l所示，在正常大菱鲆組織中MHC-Iie基因 均擴(kuò)增出約165bp的片段，其中較強(qiáng)的表達(dá)于鰓、脾、頭腎、小腸中，中等程度表達(dá)于皮膚， 在心、腦中表達(dá)較弱。 7 、 RT-PCR檢測(cè)MHC-II P mRNA的表達(dá)情況 提取經(jīng)LPS剌激的不同時(shí)間點(diǎn)的脾臟組織RNA，利用合成的cDNA —鏈為模板進(jìn)行 RT-PCR( P -ActinF2， P -ActinR2， J2BF， J2BR)，檢測(cè)LPS剌激后的脾臟中表達(dá)調(diào)控規(guī)律。設(shè) 計(jì)|3 -actin引物(13 -ActinF2， P -ActinR2)。利用2—A ACT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，如圖2所示， 經(jīng)LPS剌激后MHC-II 13基因表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，并且在96小時(shí)后逐漸恢復(fù)到正常水平。 除96小時(shí)外，其余都具有顯著性差異。
序列表 〈110〉中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 〈120〉軍曹魚MHC-II P基因序列 〈160>2 〈210>1 〈211>1161 〈212>RNA 〈213>軍曹魚(Rachycent皿canadium) 〈220〉 〈221>3， UTP 〈222〉 (768) . . (1161) 〈220〉 〈221>5， UTR 〈222〉 (1) . (20) 〈220〉 〈221>CDS 〈222>(21). . (767) 〈220〉 〈221>PolyA site 〈222〉 (1146) . (1161) 〈400〉 1 agagctctcaactcaccatcatggcttcatccttcgtctgcctctgcctcgtcttcatcg 60
〈 Leader peptide




































MASSFVCLCLVFI ctgcctacacagcagatggattcatgaatttcgcggtgggtcgctgtgactttaactcct
X PI domain AAYT^DGFMNFAVGRCDFNS ctgatccteaagacatcgagtecattcagtcttettettecaacgaactggagttcatca SDPKDIEYIQSYYYNELEFI ggttcagcagcagtgtggggaagtttgttggatecacagagcttggagtgaagaacgcag RFSSSVGKFVGYTELGVKNA aacgctggaacaaaggtccagagttggttcagatgaagggtgagaaggacagatectgtg ERWNKGPELVQMKGEKDRYC tcaggaccgtgggactegactecacagctettctgacteagtcagtcgaaccctcggtca
X P 2 domain VRTVGLDYTAILTKSYEPSV ggctgcactcgaccacgccccctetgggcaaacacccggccatgctggtctgcagcgtct RLHSTTPPMGKHPAMLVCSV acgacttcteccccaaatecatcagggtgagttggtgccgagatggacaggaagtggcct YDFYPKYIRVSWCRDGQEVA ctgatgtcagctccactgaggagctggctgacggcgactggtecteccagatccactctc SDVSSTEELADGDWYYQIHS acctggagtecacgcccaggtctggagagaagatctcctgtgtggtggagcacgccagcc HLEYTPRSGEKISCVVEHAS tg朋3g朋cctctggttettg3ctggg3tccgtcc3tgcctg3gtc3g3g3g3朋c朋朋
X CP/TM/CYT region
LKEPLVIDWHPSMPESERNK ttgccattggagcttcaggactgatcctgggtctgatcttetctctggctggattcatct IAIGASGLILGLILSLAGFI 3ctec朋g3gg朋ggcccg3gg朋gg3tcctggttccc3cteactg3gcc3ggtcctgte YYKRKARGRILVPTN承 tgctggacctggacctggacctggacctgcttctcagatggaagaaaatcagctgctgct tteaactgcttcttgtttctcagtgctgccacttgttggaccagctgaacacctcagtct ggtccaggactggrtctgacagtctgctggtcteaacctggtycatgaggtcacaggagt cttgatcgggactctgacagtcctggaccaggttteatgtggactcacgtgtetcagctg gatctggactctgctgctttectgtgtgaatcaaaaccagatcagggctctggtgtcaaa
tccttcatgatccagatgttttctacgctgtcatgt .attta' caataaaaaccaccagaaa
〈210>2
〈211>248
〈212>PRT
〈213>軍曹魚(Rachycentron canadium)
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13 120
33 180
53 240
73 300
93 360
113 420 133
■ 153 540 173 600 193 660
213 720 233 780 248 840
■ 960
1020 1080
1140
〈400>2 GRILVPTN 248
權(quán)利要求
一種軍曹魚MHC-IIβ基因序列，其特征在于它的DNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種軍曹魚MHC-IIβ基因序列，它的DNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本基因的獲得不僅為研究魚類MHC-IIβ類分子的作用機(jī)理以及MHC-IIβ基因多態(tài)性與魚體抗病力的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為進(jìn)一步研究MHC-IIβ的免疫學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/74GK101709302SQ20091021368
公開日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者侯月娥, 馮娟, 徐力文, 王江勇, 蘇友祿, 茅莉娜, 郭志勛 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所